Name: Breinmembraanfractie: An Ex Vivo Aanpak om de subsynaptische eiwit lokalisatie te beoordelen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Leer een hersenmembraanfractieprotocol om eiwitten uit verschillende synaptische compartimenten in de muizenhersenen te isoleren. Deze methode helpt onderzoekers synaptische functie te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door Ministerio de Economia en Competitividad / Instituto de Salud Carlos III (SAF2014-55700-P, PCIN-2013-019-C03-03 en PIE14 / 00034), Instituciò Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA Academia-2010 ), En Agentschap voor Innovatie door Wetenschap en Technologie (SBO-140028) aan FC Ook X. M, VF-D, en FC behoren tot de &quot;Neuropharmacology and Pain&quot; geaccrediteerde onderzoeksgroep (Generalitat de Catalunya, 2014 SGR 1251) . Het werk werd ook ondersteund door de &quot;Programa Pesquisador Visitante Especial-Ciência sem Fronteiras&quot; van CAPES (Brazilië) naar FC

Alle dierproefprocedures werden goedgekeurd door het Comité voor diergeneeskunde en zorg van de Universiteit van Barcelona (CEEA), in overeenstemming met de richtlijnen beschreven in de Gids voor de verzorging en het gebruik van laboratoriumdieren 11 en na de Europese Gemeenschap, wet 86/609 / CCE, FELASA en ARRIVE richtlijnen. Zo worden muizen gehuisvest in standaardkooien, met ad libitum toegang tot voedsel en water, en worden onder gecontroleerde standaardomstandigheden gehandhaafd (12 uur donker / licht cyclus vanaf 7:30, 22 ° C en 66% vochtigheid). 1. Verkrijgen van Synaptosomen van de Muishersenen met behulp van een Discontinuous Sucrose Gradient Opmerking: deze methode is eerder gemeld 10 . <ol><li> Bereid verse isolatiebuffer (IB) op, pH 7,4; 2 M sucrose; 1 M sucrose / 0,1 mM CaCl2; En 0,1 mM CaCl2 (zie tabel 1 ). Chill de oplossingen op ijs. </li><li> SaSnijd vijf muizen door cervicale dislocatie. Dekapiteer en verwijder snel de hersenen van elk dier. Dissecteer het hersengebied van belang (dat wil zeggen de hippocampus, 0,25-0,35 g vers weefsel) en plaats het in een 5 ml Potter-Elvehjem glazen buis op ijs met 1 ml IB. </li><li> Homogeniseer het weefsel met behulp van een homogeniserende roerder (10 slagingen bij 700-900 rotaties per minuut), bij voorkeur in een ijsbad om het opwarmen van het monster te voorkomen. </li><li> Plaats het gehomogeniseerde weefsel (1 ml) in een 15 ml buis die 6 ml 2 M sucrose en 2,5 ml 0,1 mM CaCl2 bij 4 ° C bevat. Meng langzaam door de buis om te keren. Opmerking: De toevoeging van calcium is essentieel voor het handhaven van de lijminteracties tussen organellen en derhalve om de structuur van de verschillende &quot;dichtheden&quot; te behouden. </li><li> Plaats de oplossing in een 12 ml centrifugebuis en voeg langzaam 2,5 ml 1 M sucrose / 0,1 mM CaCl2 bovenop elke buis toe om de sucrosegradiënt te vormen. Opmerking: label de positie oF de gradiëntinterface op de centrifugebuis met behulp van een permanente marker. </li><li> Weeg en evenwicht de centrifugebuizen met IB-oplossing in hun bijbehorende stalen steunen en met hun afsluitkleppen. </li><li> Centrifugeer de buizen gedurende 3 uur bij 100.000 x g en 4 ° C met behulp van een roterende centrifuge Vul de rotor volledig met alle stalen steunen (zelfs leeg, indien nodig). </li><li> Verwijder de bovenste laag die myeline bevat. Met een Pasteurpipet verzamelt u de witte ring tussen de 1.25-M en 1-M sucrose interfase die overeenstemt met de synaptosome fractie. </li><li> Verdun de synaptosomen met 9X hun volume met behulp van IB in een centrifugebuis. </li><li> Weeg en evenwicht de centrifugebuizen met IB-oplossing in hun bijbehorende stalen steunen en met hun afsluitkleppen. </li><li> Centrifugeer de buizen gedurende 30 minuten bij 15.000 x g en 4 ° C met behulp van een roterende centrifuge </li><li> Gooi de supernatant weg en verwijder de thE pellet met 1,1 ml IB oplossing. Verzamel 100 μL van deze synaptosomale oplossing en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 11.000 x g en 4 ºC. </li><li> Resuspendeer de synaptosomale pellet in 5% natriumdodecylsulfaat (SDS) en sla dit monster op -20 ºC op. Opmerking: dit monster komt overeen met de totale synaptosome fractie voor verdere Western-blot analyse. De resterende synaptosomale fractie (~ 1 ml) kan ofwel bij -20 ºC worden bevroren tot gebruik of verwerkt voor de daaropvolgende subsynaptische fractionering. De synaptosomen of gezuiverde synapsen vertegenwoordigen tussen 1 en 2% van het totale hippocampale volume 12 . </li></ol> 2. Pre-, post- en extrasynaptische isolatie <ol><li> Bereid 2x verse solubilisatiebuffer, pH 6,0; 1x solubiliseringsbuffer, pH 6,0; Oplosbare buffer, pH 8,0; En 0,1 mM CaCl2 (zie tabel 1 ). Chill de oplossingen op ijs. Opmerking: de pH van deze oplossingen moet nauwkeurig zijnY aangepast om een ​​goede subsynaptische fractionering te bereiken. </li><li> Verdun de 1 ml geresuspendeerde synaptosomale fractie langzaam (zie stap 1.12) met 5 ml 0,1 mM CaCl2. </li><li> Voeg hetzelfde volume (5 ml) ijskoude 2x solubiliseringsbuffer, pH 6,0 toe, en incubeer gedurende 50 minuten op ijs onder hoge roering in een beker op ijs. Opmerking: Terwijl 1% Triton X-100 bij pH 6,0 alle plasmamembraanproteïnen solubiliseert, behoudt het eiwitten in de synaptische contacten of kruispunten ( dwz pre- en postsynaptische structuren) 4 . </li><li> Plaats de oplossing in een centrifugebuis. Weeg en evenwicht de buizen met equivalente volumes van 0,1 mM CaCl2 en 2x oplosbare bufferoplossing, pH 6,0, in hun overeenkomstige stalen steunen en met hun afsluitlokken. </li><li> Centrifugeer de buizen gedurende 30 minuten bij 40.000 x g en 4 ° C met behulp van een roterende centrifuge Het resulterende supernatant vertegenwoordigt de extrasynaptische fractie,En de pellet komt overeen met de synaptische kruispunten ( dwz pre- en postsynaptische fracties). </li><li> Concentreer het supernatant dat de extrasynaptische fractie bevat tot een eindvolume van 200 μl onder gebruikmaking van een 15 ml 10K filterbuis gecentrifugeerd bij 4.000 xg en 4 ºC. </li><li> Precipiteer de resulterende geconcentreerde extrasynaptische fractie (200 μl) met 5 volumes (1 ml) vooraf gekoelde (-20 ° C) aceton gedurende de nacht bij -20 ° C. </li><li> De volgende dag centrifugeer de extrasynaptische fractie gedurende 30 minuten bij 18.000 x g en -15 ° C. Verwijder na het centrifugeren het aceton supernatant en droog de pellet om enig spoor van aceton te verwijderen. </li><li> Tenslotte resuspendeer de pellet die de extrasynaptische eiwitten bevat met 200 μl 5% SDS. Soniculeer de pellet, indien nodig. </li><li> Zonder het te storen, was de pellet zorgvuldig met de pre- en postsynaptische fracties met 2 ml 1x solubiliseringsbuffer, pH 6,0. Wis de buffer uit. </li><li> ResuspendeerDe pellet met 10 ml 1x solubiliseringsbuffer, pH 8,0, onder gebruikmaking van een glaspasteurpipet. Opmerking: Terwijl 1% Triton X-100 bij pH 8,0 de preynaptische specialisatie solubiliseert, behoudt het de onoplosbare postsynaptische dichtheid 4 . </li><li> Incubeer de suspensie gedurende 50 minuten op ijs onder hoge agitatie in een beker op ijs. </li><li> Plaats de oplossing in een centrifugebuis. Weeg en evenwicht de buizen met 1x oplosbare bufferoplossing, pH 8,0, in hun bijbehorende stalen steunen en met hun afsluitkleppen. </li><li> Centrifugeer de buizen gedurende 30 minuten bij 40.000 x g en 4 ° C met behulp van een roterende centrifuge Het resulterende supernatant komt overeen met de presynaptische fractie en de pellet naar de postsynaptische fractie. </li><li> Verwerk de supernatant die de presynaptische fractie bevat, zoals beschreven in stappen 2.6-2.9. </li><li> Resuspendeer de pelletsbevattende postsynaptische fractie met 200 μl 5% SDS. Soniculeer de pellet, iF vereist. </li></ol> 3. Analyseer de monsters door immunoblot om de membraanfractie te valideren <ol><li> Bepaal de hoeveelheid eiwit in elke fractie ( dwz de totale, extra-, pre- en postsynaptische fracties) met behulp van de bicinchoninezuur eiwit analyse. </li><li> Neem 20 μg eiwit uit elke fractie en verdun het tot een eindvolume van 50 μl in SDS-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) monsterbuffer. Kook gedurende 5 minuten bij 100 ºC. </li><li> De eiwitten scheiden met SDS-PAGE elektroforese 10%, met een 4% concentratie gel onder verminderende omstandigheden. Elektroforese bij constante spanning van 80 V tot de kleurstof de onderste gel binnentreedt en dan de spanning verhogen tot 120 V. </li><li> Breng de eiwitten over op een PVDF membraan en blokkeer met IB blokkeringsoplossing gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur onder continu schudden. </li><li> Incubeer het membraan &#39;s nachts bij 4 ºC met het aangegeven primaire antilichaam ( dat wil zeggen anti-SNAP-25,Anti-PSD-95, anti-synaptofysine of anti-GPR37) verdund in IB blokkerende oplossing onder continue schudding. </li><li> Was het membraan drie maal (10 min elk) met IB wasoplossing om ongebonden primair antilichaam te elimineren. </li><li> Incubeer met het aangegeven secundaire antilichaam gedurende 90 minuten bij donkere omstandigheden bij kamertemperatuur onder continu schudden. </li><li> Was het membraan driemaal (10 min elk) met IB wasoplossing om ongebonden secundair antilichaam te elimineren. </li><li> Incubeer het membraan met chemiluminescerend substraat (bereiding van de mix onder donkere omstandigheden en volg de verhouding 1: 1 van de oplossing A en B door de fabrikant). </li><li> Analyseer het membraan in een chemiluminescerende detectie-inrichting. </li></ol>

<ol><li>Foster, M., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="https://archive.org/details/textbookofphysio1897fost">Part III: The Central Nervous System.</a> A Text Book of Physiology. , Macmillan: London. (1897).</li>
<li>Peters, A., Palay, S. L., Webster, H. D. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeters%2C+A+%22The+fine+structure+of+the+nervous+system%22">The fine structure of the nervous system</a>. , Oxford University Press. New York. (1991).</li>
<li>Harris, K. M., Weinberg, R. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22357909">Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, 005587-005587 (2012).</li>
<li>Phillips, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presynaptic+particle+web%3A+ultrastructure%2C+composition%2C+dissolution%2C+and+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The presynaptic particle web: ultrastructure, composition, dissolution, and reconstitution.</a> Neuron. 32, 63-77 (2001).</li>
<li>Pinheiro, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+and+immunological+identification+of+presynaptic+alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic+acid+receptors+in+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Solubilization and immunological identification of presynaptic alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors in the rat hippocampus.</a> Neurosci. Lett. 336, 97-100 (2003).</li>
<li>Rebola, N., Pinheiro, P. C., Oliveira, C. R., Malva, J. O., Cunha, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+adenosine+A%281%29+receptors+in+nerve+terminals+and+synapses+of+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of adenosine A(1) receptors in nerve terminals and synapses of the rat hippocampus.</a> Brain Res. 987, 49-58 (2003).</li>
<li>Rebola, N., Canas, P. M., Oliveira, C. R., Cunha, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+synaptic+and+subsynaptic+localization+of+adenosine+A2A+receptors+in+the+hippocampus+and+striatum+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Different synaptic and subsynaptic localization of adenosine A2A receptors in the hippocampus and striatum of the rat.</a> Neuroscience. 132, 893-903 (2005).</li>
<li>Rodrigues, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Presynaptic+Control+by+ATP+of+Glutamate+Release+via+Facilitatory+P2X1%2C+P2X2%2F3%2C+and+P2X3+and+Inhibitory+P2Y1%2C+P2Y2%2C+and%2For+P2Y4+Receptors+in+the+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dual Presynaptic Control by ATP of Glutamate Release via Facilitatory P2X1, P2X2/3, and P2X3 and Inhibitory P2Y1, P2Y2, and/or P2Y4 Receptors in the Rat.</a> J. Neurosci. 25, 6286-6295 (2005).</li>
<li>Garção, P., Oliveira, C. R., Cunha, R. A., Agostinho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsynaptic+localization+of+nicotinic+acetylcholine+receptor+subunits%3A+a+comparative+study+in+the+mouse+and+rat+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Subsynaptic localization of nicotinic acetylcholine receptor subunits: a comparative study in the mouse and rat striatum.</a> Neurosci. Lett. 566, 106-110 (2014).</li>
<li>Lopes, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+parkinson%27s+disease-associated+receptor+GPR37+in+the+hippocampus%3A+functional+interplay+with+the+adenosinergic+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The role of parkinson's disease-associated receptor GPR37 in the hippocampus: functional interplay with the adenosinergic system.</a> J. Neurochem. 134, 135-146 (2015).</li>
<li>Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Special+Report%3A+The+1996+Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.</a> ILAR J. 38, 41-48 (1997).</li>
<li>Rusakov, D. A., Harrison, E., Stewart, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapses+in+hippocampus+occupy+only+1-2%25+of+cell+membranes+and+are+spaced+less+than+half-micron+apart%3A+a+quantitative+ultrastructural+analysis+with+discussion+of+physiological+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Synapses in hippocampus occupy only 1-2% of cell membranes and are spaced less than half-micron apart: a quantitative ultrastructural analysis with discussion of physiological implications.</a> Neuropharmacology. 37, 513-521 (1998).</li>
<li>Zeng, Z., Su, K., Kyaw, H., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+endothelin+receptor+type-B-like+gene+enriched+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">A novel endothelin receptor type-B-like gene enriched in the brain.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 559-567 (1997).</li>
<li>Bodenmuller, H., Schilling, E., Zachmann, B., Schaller, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuropeptide+head+activator+loses+its+biological+acitivity+by+dimerization%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The neuropeptide head activator loses its biological acitivity by dimerization.</a> EMBO J. 5, 1825-1829 (1986).</li>
<li>Rezgaoui, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuropeptide+head+activator+is+a+high-affinity+ligand+for+the+orphan+G-protein-coupled+receptor+GPR37%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The neuropeptide head activator is a high-affinity ligand for the orphan G-protein-coupled receptor GPR37.</a> J. Cell Sci. 119, 542-549 (2006).</li>
<li>Gandìa, J., Fernández-Dueñas, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Parkinson%27s+disease-associated+GPR37+receptor-mediated+cytotoxicity+is+controlled+by+its+intracellular+cysteine-rich+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The Parkinson's disease-associated GPR37 receptor-mediated cytotoxicity is controlled by its intracellular cysteine-rich domain.</a> J. Neurochem. 125, 362-372 (2013).</li>
<li>Meyer, R. C., Giddens, M. M., Schaefer, S. A., Hall, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPR37+and+GPR37L1+are+receptors+for+the+neuroprotective+and+glioprotective+factors+prosaptide+and+prosaposin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">GPR37 and GPR37L1 are receptors for the neuroprotective and glioprotective factors prosaptide and prosaposin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9529-9534 (2013).</li>
<li>Takahashi, R., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pael+receptor%2C+endoplasmic+reticulum+stress%2C+and+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Pael receptor, endoplasmic reticulum stress, and Parkinson's disease.</a> J. Neurol. 250, 9(2003).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het hier gepresenteerde protocol vormt een krachtig biochemisch hulpmiddel voor de studie van de subsynaptische verdeling van specifieke eiwitten binnen elke hersenregio. Er zijn echter enkele nadelen die inherent zijn aan de techniek en die hier benadrukt moeten worden. Bijvoorbeeld, een van de belangrijkste beperkingen is de relatief grote hoeveelheid weefsel die nodig is om een redelijke hoeveelheid eiwit te zuiveren om de immunoblot-analyse van alle subsynaptische fracties uit te voeren. Dit probleem kan samenhangen ...

Synaptische transmissie berust op de fysieke integriteit van de synaps, een concept dat al in 1897 door Foster and Sherrington 1 was overwogen. Zo is het begrip van de verdeling van belangrijke neurotransmissiecomponenten (bijvoorbeeld ionkanalen, receptoren, enz. ) Essentieel om de synaptische functie te verklaren, zowel in normale als pathologische omstandigheden. Elektronenmicroscopie (EM) heeft enorm bijgedragen aan de huidige ultrastructurele opvatting van synaptes van het prototypische zenuwstelsel (CNS). Zo heeft EM de fijne verschillen tussen pre- en postsynaptische dichtheden goed bepaald, die gescheiden zijn door een spleet van een vrij gelijkmatige afstand (~ 25 nm) 2 . Interessant genoeg toont het postsynaptische apparaat een relatief continue, elektrondichte verdikking onder het plasmamembraan, de zogenaamde postsynaptische dichtheid of PSD 2 . Omgekeerd, bij de presynaptische inrichting, een opschriftablEen discontinue cytomatrix netwerk is net onder het plasmamembraan geregeld, wat essentieel is voor het uitlijnen en docking van synaptische blaasjes aan de actieve plasmazone 3 van het plasmamembraan. Daarom vormt EM de gouden experimentele aanpak om de verdeling van eiwitten in structurele bewaarde CNS-synaptes te onderzoeken. De informatie die door elektronenmicrofotografieën wordt verstrekt is echter statisch. Inderdaad, accumulerende bewijzen tonen aan dat in vivo synapses extreem dynamisch zijn, waardoor dramatische structurele veranderingen ondervinden bij aanhoudende synaptische transmissie. Daarnaast kan de morfologie en de samenstelling van synapsen veranderen in verschillende CNS-gebieden en op ontwikkeling, rijping, veroudering en de ontwikkeling van neuropathologische aandoeningen. Over het geheel genomen is een protocol gericht op het isoleren van eiwitten die behoren tot verschillende synaptische compartimenten in fysiologische omstandigheden een waardevol instrument voor een meer uitgebreide studie van synaptische werking. <p cLass = &quot;jove_content&quot;&gt; Hier beschrijven we dit soort complementaire experimentele aanpak, die de voorbereidende biochemische verrijking van de verschillende synaptische membraancompartimenten mogelijk maakt, namelijk extra-, pre- en postsynaptische membraan domeinen. Deze membraan fractioneringswerkwijze, eerst beschreven door Philips et al . (2001) 4 , is gebaseerd op een pH-verschuiving die de adhesieve interacties die zich voordoen binnen de pre- en postsynaptische inrichting verzwakken. Ten eerste, door middel van milde schoonmaakmiddelen bij pH 6,0, is het mogelijk om de hechtingskoppeling te onderscheiden die het pre- en postsynaptische apparaat bevat en dat wordt gehandhaafd uit het extrasynaptische membraan domein, dat is opgelost en kan derhalve uit de synaptische contacten worden geëxtraheerd. Vervolgens verzwakt de pH van 6,0 tot 8,0 in aanwezigheid van milde detergentia de sterkte van de hechtingskoppeling die de presynaptische actieve zone strikt bindt aan de postsynaptische dichtheid. Vandaar dat het presynaptische compartiment zo isGesmoliseerd en kan worden gescheiden van de postsynaptische dichtheid, die voornamelijk wordt bewaard omdat de concentratie van het gebruikte detergent geen solubilisatie bevordert 4 . Interessant genoeg kan de fractioneringsefficiëntie, uiteindelijk hoger dan 90%, worden bevestigd door verschillende subsynaptische markers: i ) synaptosomaal geassocieerd eiwit 25 (SNAP-25), uit de presynaptische actieve zone; Ii ) synaptofysine, van de extrasynaptische fractie ( dwz buiten de actieve zone en met inbegrip van microsomen); En iii ) postsynaptische dichtheid eiwit 95 (PSD-95), uit de postsynaptische dichtheid. Met name is deze methode van breinmembraan fractionering succesvol gebruikt. Dienovereenkomstig is het mogelijk om de subsynaptische lokalisatie van verschillende receptoren nauwkeurig te bepalen, zoals alfa-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazoolpropionzuur (AMPA) receptoren 5 , adenosine A1 receptor (A1R) 6 ,Adenosine A 2A receptor (A 2A R) 7 , adenosine trifosfaat (ATP) P2 receptoren 8 , nicotine acetylcholine receptor subunits 9 en Parkinson&#39;s geassocieerde receptor GPR37 10 . Een aantal beperkingen kunnen echter de juiste beoordeling van de synaptische verdeling van een bepaald neuronale eiwit belemmeren. Dus in deze procedure beschrijven we niet alleen het gehele protocol, maar we beschrijven ook enkele kritische punten die overwogen moeten worden, zoals de vrij grote hoeveelheid weefsel nodig, de lage eiwitopbrengst en de verplichte eis om de efficiëntie van Elke scheiding voor het uitvoeren van het definitieve experiment.

<table><tbody><tr><td>Sucrose</td><td>Pancreac Qu&iacute;mica SL, Barcelona, Spanje</td><td>1.316.211.211</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Pancreac Qu&iacute;mica SL, Barcelona, Spanje</td><td>2.112.211.210</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot;6H2O</td><td>Pancreac Qu&iacute;mica SL, Barcelona, Spanje</td><td>1.313.961.210</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail Set III</td><td>Millipore, Darmstadt, Duitsland</td><td>535140</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma, St. Louis, MO, VS</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Pancreac Qu&iacute;mica SL, Barcelona, Spanje</td><td>1.236.541.209</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma, St. Louis, MO, VS</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma, St. Louis, MO, VS</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma, St. Louis, MO, VS</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol Blauw</td><td>Pancreac Qu&iacute;mica SL, Barcelona, Spanje</td><td>1.311.651.604</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma, St. Louis, MO, VS</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma, St. Louis, MO, VS</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Vetvrije droge melk</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Pancreac Qu&iacute;mica SL, Barcelona, Spanje</td><td>1.216.591.211</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Pancreac Qu&iacute;mica SL, Barcelona, Spanje</td><td>1.314.941.210</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>4873</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Pancreac Qu&iacute;mica SL, Barcelona, Spanje</td><td>1.316.781.211</td><td></td></tr><tr><td>Basic 20 pH</td><td>Crison, Alella, Spanje</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polytron VDI 12 Adaptable Homogenizer</td><td>VWR, Radnor, PA, VS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear Tubes (14x89mm)</td><td>Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona</td><td>344059</td><td>Buizen moeten bijna volledig worden gevuld om ineenstorting door ultracentrifugering te voorkomen.</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Centrifugal filters Ultracel -10K</td><td>Merck Millipore, Darmstadt, Duitsland</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5430R</td><td>Eppendorf, Hamburg, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonifier 250</td><td>Branson, Danbury, Connecticut</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amersham Imager 600</td><td>GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Spanje</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable Glass Pasteur Pipettes 230 mm</td><td>VWR, Radnor, PA, VS</td><td>612-1702</td><td></td></tr><tr><td>Compact Balance EK-610</td><td>A&amp;D, Tokyo, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce&trade; BCA Protein Assay Kit</td><td>Pierce Biotechnology, Rockford, IL, VS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal west pico chemiluminescent substrate</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, VS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GR 200 Precision Balance</td><td>A&amp;D, Tokyo, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-GPR37</td><td>Huisgemaakte antilichaam anti-GPR37 geproduceerd en gevalideerd in Francisco Ciruela Laboratorium.</td><td></td><td>Primaire antilichamen gebruikt bij een uiteindelijke concentratie van 0,250 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysin</td><td>Abcam, Cambridge, Verenigd Koninkrijk</td><td></td><td>Primaire antilichamen verdund 1:10.000</td></tr><tr><td>HRP-geconjugeerd geitenanti-muis IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS.</td><td></td><td>Secundaire antilichamen verdund 1:10.000</td></tr><tr><td>HRP-geconjugeerd geitenanti-konijn IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS.</td><td></td><td>Secundaire antilichamen verdund 1:30.000</td></tr></tbody></table>

breinmembraanfractie: an<em&gt; ex vivo</em&gt; aanpak om de subsynaptische eiwit lokalisatie te beoordelen

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Het beoordelen van de synaptische eiwit samenstelling en functie vormt een belangrijke uitdaging in de neurowetenschappen. Het is echter niet makkelijk om neurotransmissie die binnen synapses optreedt te evalueren omdat het sterk gereguleerd wordt door dynamische eiwit-eiwit interacties en fosforylatie gebeurtenissen. Bijgevolg, wanneer een methode wordt gebruikt om synaptische transmissie te bestuderen, is een belangrijk doel om deze transiënte fysiologische veranderingen te behouden. Hier presenteren wij een breukmembraan fractioneringsprotocol dat een robuuste procedure voor het isoleren van eiwitten uit verschillende synaptische compartimenten vertegenwoordigt. Met andere woorden, het protocol beschrijft een biochemische methode om eiwitverrijking uit presynaptische, postsynaptische en extrasynaptische compartimenten uit te voeren. Ten eerste worden synaptosomen of synaptische terminals verkregen uit neuronen die alle synaptische compartimenten bevatten door middel van een discontinuous sucrose gradiënt. Van op de hoogte is de kwaliteit van deze initiële synaptische membraanbereiding critical. Vervolgens wordt de isolatie van de verschillende subsynaptische compartimenten bereikt met lichte solubilisatie onder gebruikmaking van milde detergentia bij verschillende pH-omstandigheden. Dit zorgt voor scheiding door gradiënt en isopycnische centrifugaties. Tenslotte wordt eiwitverrijking bij de verschillende subsynaptische compartimenten ( dat wil zeggen pre-, post- en extrasynaptische membraanfracties) gevalideerd door middel van immunoblot-analyse met behulp van goed gekenmerkte synaptische eiwitmarkers ( dwz SNAP-25, PSD-95 en synaptofysine, Respectievelijk), waardoor een directe beoordeling van de synaptische verdeling van een bepaald neuronal eiwit mogelijk wordt gemaakt.

De beschreven methodologie is grotendeels gebruikt voor de subsynaptische analyse van neuronale eiwitten in het algemeen en voor de isolatie en biochemische karakterisering van synaptische receptoren 5 , 6 , 7 , 8 , 9 in het bijzonder. Interessant genoeg toont het hier weergegeven representatieve resultaat de bruikbaarheid van...

Hier presenteren wij een breukmembraan fractioneringsprotocol dat een robuuste procedure voor het isoleren van eiwitten uit verschillende synaptische compartimenten vertegenwoordigt.

Breinmembraanfractie: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Aanpak om de subsynaptische eiwit lokalisatie te beoordelen

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van eiwitten die behoren tot verschillende synaptische compartimenten uit de hersenen van muizen. Het beschrijven van de distributie van kinetische transmissiecomponenten is essentieel om de synaptische functie te begrijpen, zowel onder normale als pathologische omstandigheden. Toenemend bewijs laat zien dat synapsen in vivo extreem dynamisch zijn en dramatische structurele veranderingen kunnen ondergaan terwijl de synaptische transmissie in stand blijft.Synapsen zijn klassiek bestudeerd met behulp van elektronenmicroscopie. Deze methode voor membraanfractionering is gebaseerd op een combinatie van laserobliteratie met milde detergentia onder verschillende pH-condities, gevolgd door split-second centrifugatie. Kort samengevat wordt de muizenhersenen verwijderd en wordt de hippocampus zorgvuldig gedissecteerd in een gekoelde schaal opgeplaatst op verbrijzeld ijs.De hippocampi worden verzameld in een glazen Potter-Elvehjem buis die ijskoud isolatiebuffer bevat. Vervolgens wordt het verzamelde weefsel gehomogeniseerd met een homogeniseerder. Daarna wordt het gehomogeniseerde weefsel gemengd met een sucrose-calciumoplossing.Vervolgen

brain-membrane-fractionation-an-ex-vivo-approach-to-assess

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In situ subcellulaire fractionatie van zoogdiercellen op microscoop dekglaasjes kan de visualisatie van eiwit lokalisatie.

In situ subcellulaire fractionering van het aanklevende en niet-klevende zoogdiercellen

Deze procedure laat zien hoe u te isoleren van de volwassen hersenen van muizen de mitochondriën-geassocieerde ER membranen of Mams en de glycosfingolipiden verrijkte microdomain fracties uit Mams en mitochondriale preparaten.

Mitochondriën-geassocieerde ER Membranen (eigen MTM) en glycosfingolipiden Verrijkt microdomeinen (GEM): Isolatie van Mouse Brain

Neuronale membraan mensenhandel stelt dynamisch plasmamembraaneiwit beschikbaarheid en significant invloed neurotransmissie. Tot op heden, is het een uitdaging om neuronale endocytische handel in volwassen neuronen te meten. Hier beschrijven we een zeer effectieve, kwantitatieve methode om snelle veranderingen in de oppervlakte-eiwit expressie ex vivo bij acute plakjes hersenen te meten.

Brain Slice Biotinylatie: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Aanpak Regiospecifieke van plasma membraaneiwit Trafficking Meet in Adult Neuronen

Dit artikel beschrijft de verrijking van eiwitten geassocieerd met de synaptische plasmamembraan door ultracentrifugatie op een discontinue sucrose gradiënt. De verdere uitwerking van postsynaptische dichtheid eiwit wordt ook beschreven. Eiwitpreparaten zijn geschikt voor western blotting of 2D DIGE analyse.

Voorbereiding van Synaptic plasmamembraan en Postsynaptische Density eiwitten met behulp van een discontinue sucrosegradiënt

De identificatie van moleculen en routes die synaptische plasticiteit en geheugen beheersen, is nog steeds een grote uitdaging in de neurowetenschappen. Hier wordt een workflow beschreven die zich richt op de relatieve kwantificering van synaptische eiwitten die vermoedelijk betrokken zijn bij de moleculaire reorganisatie van synapsen tijdens het leren en het consolideren van geheugen in een auditief leerparadijm.

High Resolution Kwantitatieve Synaptic Proteome Profilering van Mouse Brain Regio Na Auditieve discriminatie Learning

Synaptic vesikel endocytose is gedetecteerd door de lichte microscopie van pHluorin gefuseerd met synaptic vesikel eiwit en elektronenmicroscopie van vesikel opname.

Meten van Synaptic vesikel endocytose in gekweekte Hippocampal neuronen

Elektroconvulsietherapie overname (ECS) is een experimentele diermodel van elektroconvulsieve therapie voor ernstige depressie. ECS stimuleert wereldwijd activiteit in de hippocampus, wat leidt tot synaptogenese en synaptische plasticiteit. Hier beschrijven we methoden voor ECS inductie bij ratten en voor subcellular versplintering van hun hippocampi te onderzoeken van inbeslagneming-geïnduceerde veranderingen in synaptic eiwitten.

Elektroconvulsietherapie vangsten bij ratten en versplintering van hun Hippocampi te onderzoeken van inbeslagneming-geïnduceerde veranderingen in postsynaptisch dichtheid eiwitten

Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van een kwantitatieve analyse van het niveau van de plasma-membraan vereniging voor fluorescently-tagged verbond-geassocieerde proteïne. De methode is gebaseerd op de computationele decompositie van membraan en cytoplasmatische onderdeel van signaal waargenomen in cellen die zijn gemarkeerd met plasmamembraan fluorescerende marker.

Bepaling van het plasmamembraan partitioneren voor zijdelings-geassocieerde eiwitten

Hier beschrijven we een kwantitatieve benadering bij de vaststelling van de verdeling van een synaptic eiwit ten opzichte van een marker eiwit met immunofluorescentie kleuring, confocal microscopie en computer-gebaseerde analyse.

Kwantificeren van de heterogene verdeling van een Synaptic proteïne in de hersenen van de muis met immunofluorescentie

Dit protocol beschrijft de cryoAPEX-methode, waarbij een APEX2-gelabeld membraaneiwit kan worden gelokaliseerd door transmissieelektronenmicroscopie binnen een optimaal bewaarde celultrastructuur.

De CryoAPEX-methode voor elektronenmicroscopieanalyse van membraaneiwitlokalisatie binnen ultrastructureel bewaarde cellen

Dit protocol presenteert een robuuste, gedetailleerde methode om zeer zuivere synaptosomen, synaptische blaasjes en andere synaptische fracties uit het muizenbrein te verkrijgen. Deze methode maakt de evaluatie van synaptische processen mogelijk, inclusief de biochemische analyse van eiwitlokalisatie en -functie met compartimentale resolutie.

Subcellulaire fractionering voor de isolatie van synaptische componenten uit het muizenbrein

Leer een hersenmembraanfractieprotocol om eiwitten uit verschillende synaptische compartimenten in de muizenhersenen te isoleren. Deze methode helpt onderzoekers synaptische functie te bestuderen.

Breinmembraanfractie: An

Meer video's verkennen