Flash-en-Freeze: een nieuwe techniek op Capture Membrane Dynamics met Electron Microscopy
May 1st, 2017
We ontwikkelden een nieuwe techniek in elektronenmicroscopie, "flash-and-vries," dat de visualisatie van membraan dynamiek met ms temporele resolutie mogelijk maakt. Deze techniek combineert de optogenetic stimulatie van neuronen met hogedruk vriezen. Hier tonen we de procedures en een beschrijving van de protocollen in detail.
Het algemene doel van deze procedure is om membraandynamiek vast te leggen door middel van elektronenmicroscopie na inductie van neuronale activiteit met behulp van optogenetica en vervolgens cellen in te vriezen op gedefinieerde tijdstippen na stimulatie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de neurowetenschappen en celbiologie over de mechanismen van recyclen van synaptische vesicles en ook misschien modellering op een zeer snelle tijdschaal. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat morfologische veranderingen binnen een cel kunnen worden gevisualiseerd met behulp van elektronenmicroscopie op een tijdschaal van milliseconden.
De procedure zal worden gedemonstreerd door Shuo Li, een afstudeerstudent en Sumana Raychaudhuri, een onderzoeksmedewerker. Beiden uit mijn laboratorium. Voordat u het fixeermiddel bereidt, moet u twee milliliter cryogene bestanden met een potlood labelen volgens hun specimennummers.
Combineer vervolgens alle fixeermiddelreagentia en verdeel één milliliter van de volumes van het fixeermiddel in elke fles. Na het afdekken van de buisjes, dompelt u het fixeermiddel onmiddellijk in vloeibare stikstof en bewaart u de flesjes in een gesloten styrofoamdoos. Vul vervolgens een geautomatiseerd gratis substitutie-eenheid en hogedrukvriezer met vloeibare stikstof.
Plaats vervolgens een kleine container met aceton in de monsterkamer van de gratis substitutie-eenheid en wacht tot de temperatuur van de substitutie-eenheid min 90 graden Celsius bereikt. Om het lichtstimulatieprotocol te programmeren, klikt u op bewerken in het lichtstimulatie-venster van de touchscreen-monitor. Er zal een ander venster openen.
Voer 15 seconden in voor de donkere fase. 100 milliseconden voor de periode. 10 milliseconden voor de puls, en één voor het aantal perioden voor een enkele 10 milliseconden stimulus.
Bevestig op het hoofdscherm dat het lichtstimulatievakje is aangevinkt en klik op monsteropslag gevolgd door bewerken. Gebruik in het nieuwe venster de plus- of minuusknop om twee te selecteren om twee monsters in elke kanaal op te slaan en bevestig dat opslag vloeibare stikstof is ingeschakeld. Plaats nu onder een stereomicroscoop een saffierschijf met de celzijde omhoog in de put van een middelzwarte plaat.
Gevolgd door een ruimtering van 100 micron. Dompel een kant van een lege saffierschijf in voorverwarmde zoutoplossing en plaats de schijf met de zoutoplossing naar beneden over de ruimtering. Plaats nog een ruimtering van 100 micron.
En een ruimtering van 400 micron bovenop de laatste saffierschijf, en gebruik filterpapier om eventueel overtollig vocht te verwijderen. Terwijl u de monsters vasthoudt, moet u ervoor zorgen dat u geen luchtbellen tussen de saffierschijven vasthoudt. Plaats vervolgens de hele constructie tussen de twee transparante halve cilinders en sluit de bovenste rode deksel om het bevriezingsproces te starten.
De rode deksel zal automatisch weer omhoog komen zodra het bevriezingsproces voltooid is. Wanneer alle monsters zijn bevroren, opent u de deur naar de opslagelektrische kruik en brengt u de kruik naar de werktafel. Breng de monsterkamer over van de opslagelektrische kruik naar een gespecialiseerde monsterlade gevuld met vloeibare stikstof.
En ontgrendel de knop om de monsterschaal vrij te geven. Gebruik vervolgens een tang met in vloeibare stikstof gekoelde punten om de transparante halve cilinders uit de monsterschaal te verwijderen. En breng de middelste zwarte platen voorzichtig over in een kleine kop met vloeibare stikstof.
Zorg ervoor dat de bevroren monsters altijd onder vloeibare stikstof worden bewaard en dat de monsters altijd met voorgekoelde pincetten worden gehanteerd. Koel de pincetten opnieuw voor en breng de eerste middelste plaat snel over naar het voorgekoelde aceton. Schud en tik voorzichtig met de plaat om de saffierschijf van de plaat te scheiden.
Plaats vervolgens een open cryogene bestand van fixeermiddel in een monsterkamer in de substitutie-eenheid. Breng de saffierschijf over in de fles. En dek de fles onmiddellijk af.
Wanneer alle monsters zijn overgebracht, stelt u de juiste gratis substitutieprogrammaparameters in en start u het programma. Aan het einde van het gratis substitutieprogramma, gebruikt u handschoenen om de cryogene bestanden van de monsterkamer naar een chemische kap te brengen en gebruikt u een pipette om kamertemperatuur aceton toe te voegen aan elke fles. Vervang de was in elke fles vier tot zes keer gedurende een periode van één tot twee uur met verse aceton.
Voeg vervolgens vers bereid 30% epoxyhars toe aan elke fles voor een incubatie van twee tot drie uur bij kamertemperatuur in een orbitale schudder op 120 rpm. Aan het einde van de incubatie vervangt u de 30% epoxyhars door 70% epoxyhars voor een incubatie van drie tot vier uur op de orbitale schudder. Gebruik vervolgens een tang om elke schijf, celzijde omhoog, over te brengen naar de dop van een inbeddingscapsule en voeg 90% epoxyhars toe aan de schijven voor een overnachtelijke incubatie bij vier graden Celsius.
De volgende ochtend brengt u elke saffierschijf over naar de dop van een nieuwe inbeddingscapsule en vult u de dop met vers bereid 100% epoxyhars. Na de laatste 100% epoxyhars incubatie, polymeriseert u de monsters in een oven van 60 graden Celsius gedurende 48 uur. Wanneer de monsters zijn gepolymeriseerd, plaatst u het eerste monster ondersteboven op de stereomicroscoop zodat de saffierschijf zich aan de bovenkant van het harsblok bevindt en gebruikt u een scheermes om een dunne laag hars van de bovenkant van het monster te verwijderen.
Gebruik vervolgens het scheermes om een ondiepe lijn langs de rand van de schijf te snijden om de saffierschijf te scheiden van de epoxyhars. En dompel de schijf ongeveer 10 seconden in vloeibare stikstof om de schijf te scheiden van de rest van het hars. Breng het hars over onder een dissectiescoop en plak het monster op het microscoopplatform.
Gebruik een vergrootglas van vier tot tien maal en zoek een gebied met cellen en gebruik een dubbelzij
Overzicht
Dit artikel presenteert een nieuwe "flash-and-freeze" techniek in elektronenmicroscopie die de visualisatie van membraandynamiek met milliseconde tijdelijke resolutie mogelijk maakt. Door optogenetische stimulatie van neuronen te combineren met hogedrukbevriezing, beschrijven de auteurs de procedures en protocollen die nodig zijn voor deze innovatieve methode.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Elektronenmicroscopie
Achtergrond
- Het begrijpen van membraandynamiek is cruciaal voor inzichten in synaptisch blaasje recycling.
- Optogenetica maakt nauwkeurige controle van neuronale activiteit mogelijk.
- Hogedrukbevriezing behoudt cellulaire structuren voor beeldvorming.
- Deze methode maakt snelle observatie van morfologische veranderingen mogelijk.
Doel van studie
- Om membraandynamiek na neuronale stimulatie vast te leggen.
- Om een gedetailleerd protocol voor de flash-and-freeze techniek te verstrekken.
- Om onderzoek naar synaptische mechanismen met hoge tijdelijke resolutie te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van fixeermiddel en cryogene flacons.
- Programmeren van het optogenetische stimulatieprotocol.
- Hogedrukbevriezing van neuronale monsters.
- Inbedding en polymerisatie van monsters voor elektronenmicroscopie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van synaptisch blaasje fusie via exocytose.
- Gedetailleerde beeldvorming van morfologische veranderingen binnen neuronen.
- Demonstratie van de effectiviteit van de techniek met milliseconde resolutie.
- Bijdrage aan het begrijpen van synaptische mechanismen in neurowetenschap.
Conclusies
- De flash-and-freeze techniek is een krachtig hulpmiddel voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Het biedt inzichten in snelle cellulaire processen.
- Deze methode kan ons begrip van synaptische dynamiek verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Flash-and-freeze electron microscopy enables direct visualization of rapid membrane dynamics at millisecond and nanometer resolution, addressing a critical gap in mechanistic de-risking for neurobiology and cell biology pipelines. This capability supports predictive confidence in target validation and functional pathway interrogation, particularly for synaptic vesicle cycling and membrane remodeling. The approach generates high-content datasets that inform early discovery and translational research decisions across neuroscience portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of membrane fusion and recovery events following optogenetic stimulation.
- Supports mechanistic de-risking by capturing transient morphological changes at defined time points.
- Facilitates functional validation of targets involved in synaptic vesicle cycling and membrane trafficking.
- Provides high-resolution evidence to inform predictive confidence in early-stage programs.
Screening & Assay Development
- Establishes validated biological systems for downstream quantitative imaging workflows.
- Delivers reproducible, time-resolved datasets suitable for comparative analysis across experimental conditions.
- Enables standardization of stimulation and freezing protocols for assay scalability.
- Supports reliable evaluation of compound or genetic perturbations on membrane dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Aligns morphological readouts with disease-relevant synaptic and membrane processes.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic insights to preclinical model validation.
- Enables risk-adjusted advancement by linking cellular events to functional outcomes.
- Supports biomarker development through quantitative analysis of vesicle cycling kinetics.
Pipeline & Workflow Integration
Flash-and-freeze integrates at the interface of early discovery and preclinical research, bridging optogenetic stimulation with high-resolution electron microscopy for time-resolved analysis.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on the timing and sequence of membrane events following defined stimulation.
- Screening: Provides quantitative, reproducible imaging outputs for condition comparison and assay development.
- Analytics: Generates large, blind-analyzed datasets supporting statistical evaluation of morphological changes.
- Translational Research: Connects mechanistic findings to disease-relevant processes in neuronal systems.
- Enterprise Reuse: Offers a platform adaptable for protein localization and dynamic studies across diverse cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in membrane biology.
- Operational Value: Standardizes sample handling and imaging for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing high-content, time-resolved morphological data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurobiology and cell biology assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optogenetics, electron microscopy, and cryogenic sample handling.
- Demands access to high-pressure freezing, freeze substitution, and advanced imaging infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of stimulation and freezing protocols.
- Adaptable for protein localization or dynamic studies with protocol modifications.
- Sample throughput and analysis timelines may be extended due to complex preparation and imaging steps.
