Flash-en-Freeze: een nieuwe techniek op Capture Membrane Dynamics met Electron Microscopy
1 mei 2017
We ontwikkelden een nieuwe techniek in elektronenmicroscopie, "flash-and-vries," dat de visualisatie van membraan dynamiek met ms temporele resolutie mogelijk maakt. Deze techniek combineert de optogenetic stimulatie van neuronen met hogedruk vriezen. Hier tonen we de procedures en een beschrijving van de protocollen in detail.
Het algemene doel van deze procedure is om membraandynamiek vast te leggen door middel van elektronenmicroscopie na inductie van neuronale activiteit met behulp van optogenetica en vervolgens cellen in te vriezen op gedefinieerde tijdstippen na stimulatie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de neurowetenschappen en celbiologie over de mechanismen van recyclen van synaptische vesicles en ook misschien modellering op een zeer snelle tijdschaal. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat morfologische veranderingen binnen een cel kunnen worden gevisualiseerd met behulp van elektronenmicroscopie op een tijdschaal van milliseconden.
De procedure zal worden gedemonstreerd door Shuo Li, een afstudeerstudent en Sumana Raychaudhuri, een onderzoeksmedewerker. Beiden uit mijn laboratorium. Voordat u het fixeermiddel bereidt, moet u twee milliliter cryogene bestanden met een potlood labelen volgens hun specimennummers.
Combineer vervolgens alle fixeermiddelreagentia en verdeel één milliliter van de volumes van het fixeermiddel in elke fles. Na het afdekken van de buisjes, dompelt u het fixeermiddel onmiddellijk in vloeibare stikstof en bewaart u de flesjes in een gesloten styrofoamdoos. Vul vervolgens een geautomatiseerd gratis substitutie-eenheid en hogedrukvriezer met vloeibare stikstof.
Plaats vervolgens een kleine container met aceton in de monsterkamer van de gratis substitutie-eenheid en wacht tot de temperatuur van de substitutie-eenheid min 90 graden Celsius bereikt. Om het lichtstimulatieprotocol te programmeren, klikt u op bewerken in het lichtstimulatie-venster van de touchscreen-monitor. Er zal een ander venster openen.
Voer 15 seconden in voor de donkere fase. 100 milliseconden voor de periode. 10 milliseconden voor de puls, en één voor het aantal perioden voor een enkele 10 milliseconden stimulus.
Bevestig op het hoofdscherm dat het lichtstimulatievakje is aangevinkt en klik op monsteropslag gevolgd door bewerken. Gebruik in het nieuwe venster de plus- of minuusknop om twee te selecteren om twee monsters in elke kanaal op te slaan en bevestig dat opslag vloeibare stikstof is ingeschakeld. Plaats nu onder een stereomicroscoop een saffierschijf met de celzijde omhoog in de put van een middelzwarte plaat.
Gevolgd door een ruimtering van 100 micron. Dompel een kant van een lege saffierschijf in voorverwarmde zoutoplossing en plaats de schijf met de zoutoplossing naar beneden over de ruimtering. Plaats nog een ruimtering van 100 micron.
En een ruimtering van 400 micron bovenop de laatste saffierschijf, en gebruik filterpapier om eventueel overtollig vocht te verwijderen. Terwijl u de monsters vasthoudt, moet u ervoor zorgen dat u geen luchtbellen tussen de saffierschijven vasthoudt. Plaats vervolgens de hele constructie tussen de twee transparante halve cilinders en sluit de bovenste rode deksel om het bevriezingsproces te starten.
De rode deksel zal automatisch weer omhoog komen zodra het bevriezingsproces voltooid is. Wanneer alle monsters zijn bevroren, opent u de deur naar de opslagelektrische kruik en brengt u de kruik naar de werktafel. Breng de monsterkamer over van de opslagelektrische kruik naar een gespecialiseerde monsterlade gevuld met vloeibare stikstof.
En ontgrendel de knop om de monsterschaal vrij te geven. Gebruik vervolgens een tang met in vloeibare stikstof gekoelde punten om de transparante halve cilinders uit de monsterschaal te verwijderen. En breng de middelste zwarte platen voorzichtig over in een kleine kop met vloeibare stikstof.
Zorg ervoor dat de bevroren monsters altijd onder vloeibare stikstof worden bewaard en dat de monsters altijd met voorgekoelde pincetten worden gehanteerd. Koel de pincetten opnieuw voor en breng de eerste middelste plaat snel over naar het voorgekoelde aceton. Schud en tik voorzichtig met de plaat om de saffierschijf van de plaat te scheiden.
Plaats vervolgens een open cryogene bestand van fixeermiddel in een monsterkamer in de substitutie-eenheid. Breng de saffierschijf over in de fles. En dek de fles onmiddellijk af.
Wanneer alle monsters zijn overgebracht, stelt u de juiste gratis substitutieprogrammaparameters in en start u het programma. Aan het einde van het gratis substitutieprogramma, gebruikt u handschoenen om de cryogene bestanden van de monsterkamer naar een chemische kap te brengen en gebruikt u een pipette om kamertemperatuur aceton toe te voegen aan elke fles. Vervang de was in elke fles vier tot zes keer gedurende een periode van één tot twee uur met verse aceton.
Voeg vervolgens vers bereid 30% epoxyhars toe aan elke fles voor een incubatie van twee tot drie uur bij kamertemperatuur in een orbitale schudder op 120 rpm. Aan het einde van de incubatie vervangt u de 30% epoxyhars door 70% epoxyhars voor een incubatie van drie tot vier uur op de orbitale schudder. Gebruik vervolgens een tang om elke schijf, celzijde omhoog, over te brengen naar de dop van een inbeddingscapsule en voeg 90% epoxyhars toe aan de schijven voor een overnachtelijke incubatie bij vier graden Celsius.
De volgende ochtend brengt u elke saffierschijf over naar de dop van een nieuwe inbeddingscapsule en vult u de dop met vers bereid 100% epoxyhars. Na de laatste 100% epoxyhars incubatie, polymeriseert u de monsters in een oven van 60 graden Celsius gedurende 48 uur. Wanneer de monsters zijn gepolymeriseerd, plaatst u het eerste monster ondersteboven op de stereomicroscoop zodat de saffierschijf zich aan de bovenkant van het harsblok bevindt en gebruikt u een scheermes om een dunne laag hars van de bovenkant van het monster te verwijderen.
Gebruik vervolgens het scheermes om een ondiepe lijn langs de rand van de schijf te snijden om de saffierschijf te scheiden van de epoxyhars. En dompel de schijf ongeveer 10 seconden in vloeibare stikstof om de schijf te scheiden van de rest van het hars. Breng het hars over onder een dissectiescoop en plak het monster op het microscoopplatform.
Gebruik een vergrootglas van vier tot tien maal en zoek een gebied met cellen en gebruik een dubbelzij
Overzicht
Dit artikel presenteert de "flash-and-freeze"-techniek, een methode voor tijdopgeloste elektronenmicroscopie die de visualisatie van snelle membraandynamiek in neuronen mogelijk maakt. Door optogenetische stimulatie te combineren met hoogdrukvriezen, kunnen onderzoekers morfologische veranderingen, zoals de fusie en endocytose van synaptische blaasjes, vastleggen met een temporele resolutie in milliseconden en een ruimtelijke resolutie in nanometers. Het protocol wordt gedemonstreerd met behulp van hippocampale neuronen van muizen die channelrhodopsine tot expressie brengen, wat een precieze inductie en observatie van synaptische gebeurtenissen mogelijk maakt.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Elektronenmicroscopie
- Optogenetica
Achtergrond
- Celmembranen en proteïneverdelingen zijn zeer dynamisch, maar moeilijk te visualiseren met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie.
- Traditionele elektronenmicroscopie mist het vermogen om snelle, kortstondige cellulaire gebeurtenissen vast te leggen.
- Optogenetica maakt precieze temporele controle van neuronale activiteit mogelijk.
- Het begrijpen van de recycling van synaptische blaasjes en membraandynamiek is cruciaal voor neurowetenschappelijk onderzoek.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen en te demonstreren voor het visualiseren van snelle membraandynamiek in neuronen.
- Om morfologische veranderingen tijdens synaptische transmissie vast te leggen op gedefinieerde tijdstippen na stimulatie.
- Om een protocol te leveren waarmee onderzoekers de fusie en endocytose van synaptische blaasjes met een hoge temporele precisie kunnen bestuderen.
Gebruikte methoden
- Expressie van channelrhodopsine in hippocampale neuronen van muizen voor optogenetische stimulatie.
- Inductie van neuronale activiteit met een gecontroleerde lichtpuls.
- Hogedrukvriezen van cellen op specifieke tijdstippen na stimulatie.
- Monsterverwerking, inclusief vries-substitutie, inbedding in hars, sectionering en beeldvorming met transmissie-elektronenmicroscopie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle vastlegging van synaptische vesikelversmelting (exocytose) binnen 15 ms na lichtstimulatie.
- Waarneming van endocytotische putjes die wijzen op ultrafast endocytose 100 ms na stimulatie.
- Generatie van grote datasets voor blinde analyse van morfologische veranderingen in de tijd.
- Aantonen dat flash-and-freeze visualisatie van membraandynamica met milliseconde-resolutie mogelijk maakt.
Conclusies
- De flash-and-freeze-techniek biedt een krachtige benadering om snelle cellulaire gebeurtenissen te bestuderen met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie.
- Deze methode verbetert het vermogen om mechanismen van synaptische blaasjesrecycling en membraanremodellering te onderzoeken.
- Protocollen kunnen worden aangepast voor eiwitlokalisatie of visualisatie van eiwitdynamiek met behulp van alternatieve preservatietechnieken.
Veelgestelde Vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Flash-and-freeze elektronenmicroscopie maakt directe visualisatie van snelle membraandynamiek mogelijk met milliseconde- en nanometerresolutie, waardoor een kritisch gat in de mechanistische risicobeperking voor neurobiologische en celbiologische pijplijnen wordt gedicht. Deze capaciteit ondersteunt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie en het onderzoek naar functionele pathways, in het bijzonder voor synaptische blaasjescycli en membraanremodellering. De aanpak genereert datasets met een hoog informatiegehalte die vroege ontdekkingen en translationele onderzoeksbeslissingen binnen neurowetenschappelijke portfolio's informeren.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt directe observatie van membraanfusie- en herstelgebeurtenissen na optogenetische stimulatie mogelijk.
- Ondersteunt mechanische risicoreductie door voorbijgaande morfologische veranderingen op vastgestelde tijdstippen vast te leggen.
- Faciliteert functionele validatie van targets die betrokken zijn bij de cyclus van synaptische blaasjes en membraantransport.
- Levert bewijs met een hoge resolutie om de voorspellende betrouwbaarheid in vroege stadia van programma's te onderbouwen.
Screening & Assayontwikkeling
- Stelt gevalideerde biologische systemen vast voor downstream kwantitatieve imaging-workflows.
- Levert reproduceerbare, tijdopgeloste datasets die geschikt zijn voor vergelijkende analyse over verschillende experimentele condities.
- Maakt standaardisatie van stimulatie- en vriesprotocollen mogelijk voor de schaalbaarheid van assays.
- Ondersteunt een betrouwbare evaluatie van compound- of genetische perturbaties op membraandynamiek.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt morfologische resultaten uit met ziekte-relevante synaptische en membraanprocessen.
- Zorgt voor continuïteit van mechanistische inzichten in de ontdekkingsfase naar validatie in preklinische modellen.
- Maakt risico-gecorrigeerde voortgang mogelijk door cellulaire gebeurtenissen te koppelen aan functionele uitkomsten.
- Ondersteunt de ontwikkeling van biomarkers door kwantitatieve analyse van de kinetiek van vesikelrecycling.
Integratie van Pipeline & Workflow
Flash-and-freeze bevindt zich op het snijvlak van vroege ontdekking en preklinisch onderzoek en slaat een brug tussen optogenetische stimulatie en elektronenmicroscopie met hoge resolutie voor tijdopgeloste analyse.
- Ontdekkingsbiologie: Maakt hypothesetesten mogelijk met betrekking tot de timing en volgorde van membraangebeurtenissen na een gedefinieerde stimulatie.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare imaging-resultaten voor de vergelijking van condities en de ontwikkeling van assays.
- Analytiek: Genereert grote, geblindeerd geanalyseerde datasets die de statistische evaluatie van morfologische veranderingen ondersteunen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt mechanistische bevindingen met ziekterelateerde processen in neuronale systemen.
- Hergebruik in de sector: Biedt een platform dat aanpasbaar is voor eiwitlokalisatie en dynamische studies in diverse celtypen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid en vermindert mechanistische ambiguïteit in de membraanbiologie.
- Operationele waarde: Standaardiseert monsterbehandeling en beeldvorming voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen door het leveren van hoogwaardige, tijdopgeloste morfologische gegevens.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van activa op het gebied van neurobiologie en celbiologie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in optogenetica, elektronenmicroscopie en cryogene monsterverwerking.
- Vereist toegang tot infrastructuur voor hogedrukvriesmethoden, vriessubstitutie en geavanceerde beeldvorming.
- Noodzaakt een strikte standaardisatie van stimulerings- en vriesprotocollen tussen teams.
- Aanpasbaar voor eiwitlokalisatie of dynamische studies middels protocolmodificaties.
- De monsterdoorvoer en analysetijden kunnen worden verlengd vanwege complexe preparatie- en beeldvormingsstappen.
