Glycoproteoomanalyses van de extracellulaire matrix: Een methode voor Intact Glycopeptide analyse met behulp van massaspectrometrie

Het algemene doel van dit protocol is het analyseren van de eiwitsamenstelling van de extracellulaire matrix, inclusief de identificatie van glycosyleringsplaatsen en de compositionele karakterisering van glycaanvormen in cardiovasculaire weefsels. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over het proces van weefselfibrose, zoals de manier waarop glycosylering van een structurele matrix invloed heeft op weefselfibrose tijdens cardiovasculaire aandoeningen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het, in tegenstelling tot eerdere protocollen die algemene glycosyleringsveranderingen analyseren, karakterisering van glycosylering op specifieke plaatsen van structurele matrixeiwitten mogelijk maakt, wat een instrument biedt voor meer gerichte vervolgstudies naar het mechanisme.

De procedures worden gedemonstreerd door Dr. Marika Fava en Mw. Ferheen Baig uit ons laboratorium. Om deze procedure te starten, bereidt u alle extractiebuffers voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Gebruik vervolgens een scalpel om 20 tot 50 milligram weefsel te snijden in drie of vier kleinere stukjes van ongeveer twee millimeter groot.

Plaats het gesneden weefsel in een buisje van 1,5 milliliter en voeg 500 microliters ijskoud PBS toe. Was het weefsel vijf keer met telkens 500 microliters PBS om bloedcontaminatie te minimaliseren. Overbreng de gewassen monsters naar een buisje van 1,5 milliliter met een schroefdop en voeg een volume natriumchloridebuffer toe dat 10 keer het weefselgewicht bedraagt.

Vortex op minimale snelheid gedurende één uur bij kamertemperatuur. Draag het extract vervolgens over naar nieuwe centrifugebuisjes en centrifugeer bij 16,000 ×g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Was de resulterende weefselpellets kort met verse natriumchloridebuffer.

Voeg hierna een volume SDS-buffer toe dat 10 keer het weefstgewicht bedraagt en vortex op minimale snelheid gedurende 16 uur bij kamertemperatuur. Breng het extract over naar nieuwe centrifugebuizen en centrifugeer bij 16 000 ×g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Was de resulterende pellets met dubbel gedestilleerd water.

Voeg een volume guanidinehydrochloridebuffer toe dat vijf keer het weefstgewicht bedraagt en vortex op maximale snelheid gedurende 72 uur bij kamertemperatuur. Draag het resulterende extract over naar nieuwe buisjes en centrifugeer bij 16,000 ×g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Na kwantificering van het eiwit, verdeel 10 µg in een nieuw buisje per monster voor de bepaling van de bezettingsgraad van glycosyleringsplaatsen en 50 µg in een apart buisje voor directe glycopeptideanalyse.

Voeg aan elk monster 10 keer het volume ethanol toe en incubeer dit een nacht bij 20 °C. Centrifugeer de monsters de volgende dag 30 minuten lang bij 16.000 ×g bij 4 °C. Aspireer het supernatant, waarbij u er zorg voor draagt dat het neergeslagen pellet niet wordt verstoord.

Gebruik vervolgens een vacuümconcentrator om de pellets gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur te drogen. Voeg 10 µL van de bereide deglycosyleringsbuffer toe aan elk monster. Plaats de monstertubes in een conische buis van 50 mL en incubeer deze gedurende twee uur onder een hoek van 45 graden bij 25 °C.

Verhoog daarna de temperatuur naar 37 °C en incubeer gedurende 36 uur onder zachte agitatie. Centrifugeer gedurende één minuut bij 16.000 ×g en gebruik vervolgens een vacuümconcentrator bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten om het water te verdampen. Resuspendeer de gedroogde monsters in 10 µL O-18 gelabeld water dat 50 U/mL PNGase F bevat. Incubeer gedurende 36 uur bij 37 °C onder constante agitatie, voer vervolgens voor alle monsters een in-solution trypsinevertering uit en ga verder met de C-18 clean-up.

Begin met het toevoegen van 200 µL methanol aan elke well van de C-18 spin plate om de hars te activeren. Centrifugeer gedurende één minuut bij 1,000 ×g. Voeg vervolgens 200 µL 80%ACN en 0.1%TFA in water toe aan elke well en centrifugeer gedurende één minuut bij 1,000 ×g.

Voeg vervolgens 200 µL van een oplossing met 1% ACN en 0,1% TFA in water toe aan elke put en centrifugeer gedurende één minuut bij 1.000 ×g. Herhaal het toevoegen van deze oplossing en het centrifugeren tweemaal. Laad daarna de monsters in de putten van de spinplaat en centrifugeer gedurende één minuut bij 1500 ×g. Laad het doorstroomvolume opnieuw en herhaal het centrifugeren.

Voeg vervolgens 200 µL van een oplossing bestaande uit 1% ACN en 0,1% TFA in water toe aan elke put en centrifugeer één minuut bij 1500 ×g. Herhaal het toevoegen van deze oplossing en het centrifugeren twee keer. Voeg daarna 170 µL van een oplossing bestaande uit 50% ACN en 0,1% TFA in water toe aan elke put en centrifugeer één minuut bij 1500 ×g.

Herhaal deze toevoeging en centrifugatie nogmaals. Gebruik een vacuümconcentrator om het gecombineerde eluaat twee uur lang bij kamertemperatuur te drogen. Bewaar de gedroogde monsters bij 80 graden Celsius tot gebruik.

Voer daarna vloeistofchromatografie-tandemmassaspectrometrie-analyse uit op de monsters die bestemd zijn voor de bepaling van de glycositebezetting. Voor monsters die bestemd zijn voor directe glycopeptide-analyse wordt eerst voortgegaan met de standaard TMT-nullabeling zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg ter begin aan elke 10 µL TMT-nulgelabeld monster 50 µL van de meegeleverde bindingsbuffer toe.

Verdeel vervolgens aliquots van 50 µL van de homogene glyco-capture hars-suspensie over nieuwe buisjes van 1,5 mL en centrifugeer gedurende één minuut bij 2500 ×g. Verwijder het supernatant en voeg met een pipet 60 µL van de monster- en bindingsbufferoplossing toe aan de buisjes met de harspellets om te mengen. Incubeer 20 minuten bij kamertemperatuur onder agitatie bij 1200 RPM. Na het centrifugeren gedurende twee minuten bij 2000 ×g wordt het supernatant overgebracht naar nieuwe buisjes.

Voeg daarna met de pipette 150 µL wasbuffer toe aan elke harsbuis en meng deze om het wasproces te starten. Incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur onder agitatie bij 1200 RPM. Centrifugeer vervolgens 2 minuten bij 2500 ×g en breng elke supernatant over naar de overeenkomstige bewaarbuis voor supernatanten om de wasbeurt te voltooien.

Herhaal dit wasproces nog twee keer. Voeg vervolgens 75 µL elutiebuffer toe en meng dit met een pipet. Incubeer vijf minuten bij kamertemperatuur onder agitatie bij 1200 RPM.

Centrifugeer 2 minuten bij 2500 ×g en breng elk supernatant over naar een nieuwe buis van 1,5 milliliter. Voeg met een pipet 75 µL elutiebuffer toe om te mengen en herhaal vervolgens de incubatie en centrifugatie van de monsters. Breng elk eluaat over naar de overeenkomstige buis.

Centrifugeer het gecombineerde eluaat gedurende twee minuten bij 2500 ×g en breng elk supernatant over naar een nieuwe buis om volledige verwijdering van de hars te garanderen. Gebruik vervolgens een vacuümconcentrator om het eluaat gedurende twee uur bij kamertemperatuur te drogen. Resuspendeer de ingedampte glycopeptiden in 15 µL van 2% ACN en 0,5% TFA in dubbel gedestilleerd water.

Voer vervolgens de massaspectrometrie-analyse uit zoals beschreven in het tekstprotocol. In deze studie worden ECM-eiwitten uit cardiovasculair weefsel voorbereid voor vloeistofchromatografie-tandem-massaspectrometrie-analyse van de ECM-samenstelling, evenals indirecte en directe glycopeptide-analyse. De kernstrategie is gebaseerd op opeenvolgende incubaties met natriumchloride, SDS en guanidinehydrochloride, gevolgd door indirecte of directe glycopeptide-analyse.

De efficiëntie van de extractie wordt gemonitord op bis-tris acrylamidegels met zilverkleuring voor visualisatie. Van de drie geladen extracten zijn de meeste ECM-glycoproteïnen zichtbaar in de guanidinehydrochloride-aliquots. ECM-glycoproteïnen zijn voorzien van grote en repetitieve glycosamine-glycaanketens samen met korte en diverse N- en O-gekoppelde oligosachariden.

De efficiëntie van de deglycosylering wordt gecontroleerd door de toevoeging van enzymen die glycosaminische glycanen afbreken en enzymen die zich richten op kleinere N- en O-gekoppelde oligosachariden. Glycoproteïnen worden vervolgens geïdentificeerd aan de hand van de aanwezigheid van gedeamideerde asparagines gelabeld met zuurstof 18 binnen NXT- of NXS-sequons. Hier wordt een representatief HCD-tandemmassaspectrum getoond voor een peptide van decorine met een gedeamideerd asparagine op positie twee 11.

Vervolgens wordt HCD ETD-fragmentatie gebruikt om het glycoprotein-verrijkte ECM-extract te analyseren. Het ETD-tandemmassaspectrum maakt de karakterisering van de glycaansamenstelling mogelijk. Eenmaal onder de knie, zou deze techniek ongeveer twee tot drie weken in beslag nemen.

Deze glycoproteomics stellen ons in staat om de fysiologie en pathologie van de fibrosefunctie te verkennen, niet alleen op basis van veranderingen in proteomics, maar ook op basis van de samenstelling van de suikers. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u monsters voorbereidt voor een studie naar eiwitglycosylering via massaspectrometrie. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in cardiovasculaire ziekten, kan deze ook worden toegepast op andere pathologieën bij fibrose, zoals respiratoire ziekten of kanker.