Montage en Tracking van Microbiële Community Development binnen een Microwell Array Platform
June 6th, 2017
De ontwikkeling van microbiële gemeenschappen hangt af van een combinatie van factoren, waaronder milieu-architectuur, lidmaatschap, eigenschappen en interacties. Dit protocol beschrijft een synthetische microfabriek die gelijktijdig wordt bijgehouden van duizenden gemeenschappen in femtoliterputten, waar sleutelfactoren zoals nisgrootte en bevalling kunnen worden benaderd.
Het algemene doel van deze methode is hoogdoorvoer parallelle analyse van microbiële gemeenschappen met meerdere leden in beperkte omgevingen met behulp van siliconen micro-wel-arrays. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een hoogdoorvoer, zeer parallelle screening mogelijk maakt van fijn gelokaliseerde microbiële interacties die belangrijk zijn voor de industrie, geneeskunde en het milieu. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van biomedische en microbiële ecologie, zoals hoe ruimtelijke beperkingen die inherent zijn op fijne schalen deterministische en stochastische parameters van gemeenschapsontwikkeling aandrijven en wat zijn de belangrijkste effecten op de abundantie en organisatie van microbiële leden?
Begin met het voorbereiden van de micro-wel-arrays. Snijd eerst individuele micro-wel-arraychips van siliconenwafels die met meerdere arrays bedrukt zijn met behulp van een diamantschrijver. Elke afzonderlijke chip bevat sub-arrays van putjes met diameters variërend van vijf tot 100 micron op drie verschillende afstandsdichtheden.
Op elke chip wordt het volledige motief van putjes ook vier keer herhaald. Maak vervolgens een bevochtigde kamer met behulp van een pipettentipbox en een in PBS gedrenkte doek. Breng vervolgens een druppel van 150 microliter BSA-oplossing aan op elke chip en incubeer de chips in de box gedurende een uur op kamertemperatuur.
Bereid ondertussen de bacteriën voor. Centrifugeer een kweek en suspendeer deze opnieuw in 500 microliter vers R2A-medium met twee procent glycerol. Meet vervolgens de kweekdichtheid bij 600 nanometer en pas de concentratie aan tot een optische dichtheid van 0,02.
Na de chipincubatie, verwijder de BSA-oplossing en spoel de chips drie keer met PBS. Droog de chips na het spoelen af met stikstofgas en plaats ze terug in de bevochtigde kamer. Voeg vervolgens 150 microliter kweeksuspensie toe aan elke droge chip en incubeer de chips gedurende een uur bij vier graden Celsius, zodat de bacteriën de tijd hebben om aan de putjes te hechten, maar de celdeling van eventuele verontreiniging langzaam is.
Om een chip voor beeldvorming voor te bereiden, maak eerst een agarose-gecoate deksel voor elke chip. Maak een kleine hoeveelheid agarose vloeibaar, ongeveer vijf milliliter is nodig voor elke deksel. Was vervolgens één kant van een deksel met ethanol en centreer het op een glazen plaat met de gewassen kant omhoog.
Plaats vervolgens twee PDMS-afstandsstukken van één millimeter langs de lange randen van de deksel en verplaats de deksel zodat er één millimeter over de plaat hangt. Giet nu genoeg agarose op de deksel om deze volledig te bedekken. Gebruik vervolgens een tweede glazen plaat om de agarose in een uniforme dikte te vlakken.
Bereid meerdere dergelijke plaatassemblages parallel voor. Wanneer de agarose begint te stollen, brengt u de assemblages over naar vier graden Celsius. Na 15 minuten koelen, snijdt u het overtollige agarose rond de deksels af.
Plaats vervolgens de assemblages in petrischalen en bewaar ze bij vier graden Celsius. Nadat de chips zijn geïncubeerd met de bacteriën, doopt u de chips één voor één gedurende 10 seconden in ultrazuiver water. Zet vervolgens de natte chips op hun randen bovenop een zakdoek tot het meeste vocht is weggeloopt.
Verwijder nu de bacteriën die zich niet in de putjes hebben gesetteld. Snijd een stuk tape van de lengte van de siliconenchip en hecht deze aan de paryleenlaag op de siliconen. Scheur vervolgens het tape af om de paryleenlaag te verwijderen en bereid onmiddellijk voor om de chip om te keren.
Plaats nu de chip op een plaatassemblage zodat de micro-wels in contact komen met de agarose. Wees voorzichtig om de chip niet te verplaatsen of te verschuiven zodra deze in contact komt met de agarose. Breng nu de complete assemblage over naar de plaathouder van een omgevingscontrolekamer op het podium en neem tijdsverloopbeelden gedurende de volgende 24 uur met het gewenste interval en onder 10x vergroting op.
Verwerk de beeldstacks met conventionele, vrije software. Importeer eerst de beeldsequentie. Voor gemiddeld laden, laadt u de correctie- of donkerveldbeelden.
Voer vervolgens een achtergrondsubtraksie uit. Geef een straalwaarde op, zoals 135 pixels, en selecteer een glijdende paraboloïde. Verwijder vervolgens het gemiddelde donkerveldbeeld van het gemiddelde verlichtingsveldbeeld door de twee afbeeldingen te selecteren en de aftrekbewerking te gebruiken.
Pas nu een verlichtingscorrectie toe als volgt. Stel de bewerking in op delen, stel i1 in op de putafbeelding, stel i2 in op de correctie-afbeelding, stel k1 in op de gemiddelde correctie-afbeelding en stel k2 in op nul. Klik vervolgens op Nieuw venster maken.
Om de bacteriegroei in de micro-wels te kwantificeren, selecteert u eerst de gebieden van belang met de microarray-plug-in. Klik in het kaartmenu op raster resetten en specificeer de rijen, kolommen en putdiameters. Selecteer vervolgens cirkel uit het menu met ROI-vormen.
Om de ROI-array aan te passen aan het beeld, kan de ROI-array worden verplaatst door de ALT- of ALT+SHIFT-toets in te drukken en de bovenste linker ROI met de muis te selecteren. Om de ROI's te herstellen, drukt u op de shift-toets terwijl u het onderste rechterdeel van de ROI-array selecteert. Om de afstand tussen de ROI's aan te passen, drukt u op de shift-toets terwijl u de boven- of onderkant van de array sleept.
Zodra de ROI-array over de putjes van het beeld past, klikt u op RT meten. Vervolgens wordt een tabel met alle metingen voor elke afbeelding of tijdstip uitgegeven en kan deze worden gekopieerd naar een spreadsheet voor analyse. De groei van twee stammen van Pseudomonas aeruginosa werd vergeleken. Eén stam drukt constitutief toxische effectoreiwitten tot expressie die geassocieerd zijn met type zes secreties.
De andere is vatbaar voor type zes pathogenese als gevolg van functieverlies. Beiden drukken een ander fluorescerend eiwit tot expressie. Co-culturen werden longitudinaal en in verschillende putgroottes bestudeerd.
De bacteriën werden individueel en als
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor hoogdoorvoeranalyse van microbiële gemeenschappen in beperkte omgevingen met behulp van silicium micro putjesarrays. Het maakt het mogelijk om microbiële interacties die belangrijk zijn voor verschillende gebieden, waaronder industrie en geneeskunde, te volgen.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Microbiële Ecologie
- Biomedisch Onderzoek
- Milieuwetenschappen
Achtergrond
- Microbiële gemeenschappen worden beïnvloed door omgevingsarchitectuur en interacties tussen leden.
- Het begrijpen van deze gemeenschappen kan inzichten bieden in ecologische en biomedische vragen.
- Hoogdoorvoermethoden zijn essentieel voor het analyseren van complexe interacties.
- Dit onderzoek maakt gebruik van microfabriceerde omgevingen voor nauwkeurige tracking.
Doel van het onderzoek
- Om multi-leden microbiële gemeenschappen in beperkte ruimtes te analyseren.
- Om te onderzoeken hoe ruimtelijke beperkingen de ontwikkeling van de gemeenschap beïnvloeden.
- Om de effecten op de abundantie en organisatie van microbiële leden te verkennen.
Gebruikte methoden
- Bereiding van micro putjesarrays van siliciumwafels.
- Gebruik van arrays met putjes variërend van vijf tot 100 microns.
- Screening van microbiële interacties op een hoogdoorvoerwijze.
- Parallelle analyse van gemeenschapsdynamiek in beperkte omgevingen.
Belangrijkste resultaten
- Aangetoond de mogelijkheid om duizenden microbiële gemeenschappen gelijktijdig te volgen.
- Geïdentificeerd sleutelinteracties beïnvloed door nichesgrootte en beperking.
- Biedt inzichten in deterministische en stochastische parameters van gemeenschapsontwikkeling.
- Benadrukt de betekenis van deze methode voor industriële en milieutoepassingen.
Conclusies
- Deze methode biedt een nieuwe aanpak voor het bestuderen van microbiële interacties.
- Het verbetert het begrip van gemeenschapsdynamiek in beperkte omgevingen.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze bevindingen om ecologische en biomedische uitdagingen aan te pakken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This microwell array platform enables high-throughput parallel analysis of microbial community development in confined environments, supporting mechanistic de-risking in early discovery by quantifying spatial and interaction effects on microbial growth. The method provides predictive confidence in target validation by revealing how fine-scale spatial constraints influence deterministic and stochastic parameters of community dynamics, directly informing translational biomarker and preclinical model relevance. Its scalability and reproducibility support enterprise R&D workflows in antimicrobial target screening and phenotypic screening applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying how spatial confinement alters microbial member abundance and organization in co-culture systems.
- Operational Value: Enables functional target validation through longitudinal tracking of fluorescently labeled strains in defined microwell environments.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by measuring growth trajectories and interaction effects under controlled niche sizes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by standardizing microbial seeding in arrays with well diameters from 5 to 100 microns.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through BSA passivation, controlled incubation, and agarose-coated imaging substrates that minimize evaporation and drift.
- Scalability Value: Enables parallel analysis of thousands of communities, supporting platform reuse across antimicrobial and pathogenicity studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Connects discovery-phase interaction data to preclinical continuity by modeling how spatial constraints affect pathogenic outcomes in Pseudomonas aeruginosa co-cultures.
- Mechanistic De-risking: Quantifies negligible growth effects in co-culture, helping de-risk false positives in target validation screens.
- Predictive Confidence: Uses modified logistic fitting of growth curves to extract maximum signal, rate, and lag time for comparative strain analysis.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, providing quantitative interaction data that informs go/no-go decisions in antimicrobial target programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing how spatial constraints drive community development parameters in multi-member systems.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized chip preparation, bacterial adhesion at 4°C, and time-lapse fluorescence imaging at 30-minute intervals over 20 hours.
- Analytics: Generates quantitative growth trajectories via background subtraction, illumination correction, and ROI-based fluorescence measurement, enabling statistical comparison of conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical relevance by modeling Type VI secretion-dependent interactions in Pseudomonas aeruginosa, a pathogen with biomedical significance.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for screening microbial interactions across industry, medicine, and environmental applications due to its parallel throughput and confined-environment precision.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through quantification of microbial interaction effects in spatially constrained environments.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via controlled chip preparation, fluorescence labeling, and automated image analysis workflows.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by de-risking mechanistic ambiguity in early-stage antimicrobial target identification.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative interaction data from high-throughput community arrays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiology, fluorescence microscopy, and image analysis software for ROI setup and quantitative measurement.
- Depends on silicon microfabrication infrastructure, agarose-coated slide assemblies, and environmental control chambers for stable 24-hour imaging.
- Necessitates cross-team standardization of bacterial preparation, OD adjustment, and parylene removal steps to ensure well-specific adhesion.
- Requires adaptation considerations when extending beyond Pseudomonas aeruginosa to other microbial models due to surface chemistry and growth variability.
- Practical limitations include the need for aseptic technique when handling Pseudomonas aeruginosa and potential well-to-well variability in sub-10 micron features.
