Montage en Tracking van Microbiële Community Development binnen een Microwell Array Platform
6 juni 2017
De ontwikkeling van microbiële gemeenschappen hangt af van een combinatie van factoren, waaronder milieu-architectuur, lidmaatschap, eigenschappen en interacties. Dit protocol beschrijft een synthetische microfabriek die gelijktijdig wordt bijgehouden van duizenden gemeenschappen in femtoliterputten, waar sleutelfactoren zoals nisgrootte en bevalling kunnen worden benaderd.
Het algemene doel van deze methode is hoogdoorvoer parallelle analyse van microbiële gemeenschappen met meerdere leden in beperkte omgevingen met behulp van siliconen micro-wel-arrays. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een hoogdoorvoer, zeer parallelle screening mogelijk maakt van fijn gelokaliseerde microbiële interacties die belangrijk zijn voor de industrie, geneeskunde en het milieu. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van biomedische en microbiële ecologie, zoals hoe ruimtelijke beperkingen die inherent zijn op fijne schalen deterministische en stochastische parameters van gemeenschapsontwikkeling aandrijven en wat zijn de belangrijkste effecten op de abundantie en organisatie van microbiële leden?
Begin met het voorbereiden van de micro-wel-arrays. Snijd eerst individuele micro-wel-arraychips van siliconenwafels die met meerdere arrays bedrukt zijn met behulp van een diamantschrijver. Elke afzonderlijke chip bevat sub-arrays van putjes met diameters variërend van vijf tot 100 micron op drie verschillende afstandsdichtheden.
Op elke chip wordt het volledige motief van putjes ook vier keer herhaald. Maak vervolgens een bevochtigde kamer met behulp van een pipettentipbox en een in PBS gedrenkte doek. Breng vervolgens een druppel van 150 microliter BSA-oplossing aan op elke chip en incubeer de chips in de box gedurende een uur op kamertemperatuur.
Bereid ondertussen de bacteriën voor. Centrifugeer een kweek en suspendeer deze opnieuw in 500 microliter vers R2A-medium met twee procent glycerol. Meet vervolgens de kweekdichtheid bij 600 nanometer en pas de concentratie aan tot een optische dichtheid van 0,02.
Na de chipincubatie, verwijder de BSA-oplossing en spoel de chips drie keer met PBS. Droog de chips na het spoelen af met stikstofgas en plaats ze terug in de bevochtigde kamer. Voeg vervolgens 150 microliter kweeksuspensie toe aan elke droge chip en incubeer de chips gedurende een uur bij vier graden Celsius, zodat de bacteriën de tijd hebben om aan de putjes te hechten, maar de celdeling van eventuele verontreiniging langzaam is.
Om een chip voor beeldvorming voor te bereiden, maak eerst een agarose-gecoate deksel voor elke chip. Maak een kleine hoeveelheid agarose vloeibaar, ongeveer vijf milliliter is nodig voor elke deksel. Was vervolgens één kant van een deksel met ethanol en centreer het op een glazen plaat met de gewassen kant omhoog.
Plaats vervolgens twee PDMS-afstandsstukken van één millimeter langs de lange randen van de deksel en verplaats de deksel zodat er één millimeter over de plaat hangt. Giet nu genoeg agarose op de deksel om deze volledig te bedekken. Gebruik vervolgens een tweede glazen plaat om de agarose in een uniforme dikte te vlakken.
Bereid meerdere dergelijke plaatassemblages parallel voor. Wanneer de agarose begint te stollen, brengt u de assemblages over naar vier graden Celsius. Na 15 minuten koelen, snijdt u het overtollige agarose rond de deksels af.
Plaats vervolgens de assemblages in petrischalen en bewaar ze bij vier graden Celsius. Nadat de chips zijn geïncubeerd met de bacteriën, doopt u de chips één voor één gedurende 10 seconden in ultrazuiver water. Zet vervolgens de natte chips op hun randen bovenop een zakdoek tot het meeste vocht is weggeloopt.
Verwijder nu de bacteriën die zich niet in de putjes hebben gesetteld. Snijd een stuk tape van de lengte van de siliconenchip en hecht deze aan de paryleenlaag op de siliconen. Scheur vervolgens het tape af om de paryleenlaag te verwijderen en bereid onmiddellijk voor om de chip om te keren.
Plaats nu de chip op een plaatassemblage zodat de micro-wels in contact komen met de agarose. Wees voorzichtig om de chip niet te verplaatsen of te verschuiven zodra deze in contact komt met de agarose. Breng nu de complete assemblage over naar de plaathouder van een omgevingscontrolekamer op het podium en neem tijdsverloopbeelden gedurende de volgende 24 uur met het gewenste interval en onder 10x vergroting op.
Verwerk de beeldstacks met conventionele, vrije software. Importeer eerst de beeldsequentie. Voor gemiddeld laden, laadt u de correctie- of donkerveldbeelden.
Voer vervolgens een achtergrondsubtraksie uit. Geef een straalwaarde op, zoals 135 pixels, en selecteer een glijdende paraboloïde. Verwijder vervolgens het gemiddelde donkerveldbeeld van het gemiddelde verlichtingsveldbeeld door de twee afbeeldingen te selecteren en de aftrekbewerking te gebruiken.
Pas nu een verlichtingscorrectie toe als volgt. Stel de bewerking in op delen, stel i1 in op de putafbeelding, stel i2 in op de correctie-afbeelding, stel k1 in op de gemiddelde correctie-afbeelding en stel k2 in op nul. Klik vervolgens op Nieuw venster maken.
Om de bacteriegroei in de micro-wels te kwantificeren, selecteert u eerst de gebieden van belang met de microarray-plug-in. Klik in het kaartmenu op raster resetten en specificeer de rijen, kolommen en putdiameters. Selecteer vervolgens cirkel uit het menu met ROI-vormen.
Om de ROI-array aan te passen aan het beeld, kan de ROI-array worden verplaatst door de ALT- of ALT+SHIFT-toets in te drukken en de bovenste linker ROI met de muis te selecteren. Om de ROI's te herstellen, drukt u op de shift-toets terwijl u het onderste rechterdeel van de ROI-array selecteert. Om de afstand tussen de ROI's aan te passen, drukt u op de shift-toets terwijl u de boven- of onderkant van de array sleept.
Zodra de ROI-array over de putjes van het beeld past, klikt u op RT meten. Vervolgens wordt een tabel met alle metingen voor elke afbeelding of tijdstip uitgegeven en kan deze worden gekopieerd naar een spreadsheet voor analyse. De groei van twee stammen van Pseudomonas aeruginosa werd vergeleken. Eén stam drukt constitutief toxische effectoreiwitten tot expressie die geassocieerd zijn met type zes secreties.
De andere is vatbaar voor type zes pathogenese als gevolg van functieverlies. Beiden drukken een ander fluorescerend eiwit tot expressie. Co-culturen werden longitudinaal en in verschillende putgroottes bestudeerd.
De bacteriën werden individueel en als
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor high-throughput analyse van microbiële gemeenschappen in afgesloten omgevingen met behulp van silicium microwell-arrays. Hiermee kunnen microbiële interacties worden gevolgd die relevant zijn voor diverse vakgebieden, waaronder de industrie en de geneeskunde.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Microbiële ecologie
- Biomedisch onderzoek
- Milieuwetenschappen
Achtergrond
- Microbiële gemeenschappen worden beïnvloed door de omgevingsarchitectuur en interacties tussen leden.
- Inzicht in deze gemeenschappen kan leiden tot antwoorden op ecologische en biomedische vragen.
- High-throughput methoden zijn essentieel voor het analyseren van complexe interacties.
- Deze studie maakt gebruik van microgefabriceerde omgevingen voor nauwkeurige tracking.
Doel van het onderzoek
- Om microbiële gemeenschappen met meerdere leden in beperkte ruimtes te analyseren.
- Om te onderzoeken hoe ruimtelijke beperkingen de ontwikkeling van de gemeenschap beïnvloeden.
- Om de effecten op de abundantie en organisatie van de microbiële leden te verkennen.
Gebruikte methoden
- Bereiding van microput-arrays uit siliciumwafers.
- Gebruik van arrays met putten variërend van 5 tot 100 micron.
- High-throughput screening van microbiële interacties.
- Parallelle analyse van gemeenschapsdynamiek in beperkte omgevingen.
Belangrijkste resultaten
- Aangetoond vermogen om duizenden microbiële gemeenschappen gelijktijdig te volgen.
- Belangrijke interacties geïdentificeerd die worden beïnvloed door nichegrootte en insluiting.
- Inzichten verschaft in deterministische en stochastische parameters van gemeenschapsontwikkeling.
- Het belang van deze methode voor industriële en milieu-toepassingen benadrukt.
Conclusies
- Deze methode biedt een innovatieve benadering voor het bestuderen van microbiële interacties.
- Het vergroot het begrip van gemeenschapsdynamiek in besloten omgevingen.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze bevindingen om ecologische en biomedische uitdagingen aan te pakken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Dit microwell-arrayplatform maakt high-throughput parallelle analyse mogelijk van de ontwikkeling van microbiële gemeenschappen in besloten omgevingen, wat mechanische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase ondersteunt door ruimtelijke effecten en interactie-effecten op microbiële groei te kwantificeren. De methode biedt voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door te onthullen hoe ruimtelijke beperkingen op fijne schaal de deterministische en stochastische parameters van de gemeenschapsdynamiek beïnvloeden, wat direct bijdraagt aan de relevantie van translationele biomarkers en preklinische modellen. De schaalbaarheid en reproduceerbaarheid ondersteunen enterprise R&D-workflows bij antimicrobial target screening en fenotypische screening-toepassingen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door te kwantificeren hoe ruimtelijke beperking de abundantie en organisatie van microbiële leden in co-cultuursystemen beïnvloedt.
- Operationele waarde: Maakt functionele target-validatie mogelijk door longitudinale tracking van fluorescentie-gelabelde stammen in gedefinieerde microwell-omgevingen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door groeitrajecten en interactie-effecten te meten onder gecontroleerde nichegroottes.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream screening door het standaardiseren van microbiële seeding in arrays met putdiameters van 5 tot 100 micron.
- Operationele waarde: Garandeert de reproduceerbaarheid van assays door BSA-passivering, gecontroleerde incubatie en met agarose gecoate imaging-substraten die verdamping en drift minimaliseren.
- Schaalbaarheidswaarde: Maakt parallelle analyse van duizenden gemeenschappen mogelijk, wat hergebruik van het platform ondersteunt in antimicrobiële en pathogeniteitsstudies.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele waarde: Verbindt interactiegegevens uit de ontdekkingsfase met preklinische continuïteit door te modelleren hoe ruimtelijke beperkingen pathogenische uitkomsten beïnvloeden in Pseudomonas aeruginosa co-culturen.
- Mechanistische risicoreductie: Kwantificeert verwaarloosbare groeieffecten in co-cultuur, wat helpt bij het reduceren van risico's op fout-positieven in screens voor targetvalidatie.
- Predictieve betrouwbaarheid: Maakt gebruik van aangepaste logistieke fitting van groeicurves om het maximale signaal, de snelheid en de lag-tijd te extraheren voor comparatieve stamanalyses.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van hypothesetoetsing tot lead-identificatie en levert kwantitatieve interactiegegevens die de go/no-go-beslissingen in antimicrobiële targetprogramma's onderbouwen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door te onthullen hoe ruimtelijke beperkingen de parameters van gemeenschapsontwikkeling in multi-member systemen sturen.
- Screening: Maakt assays gereed door middel van gestandaardiseerde chipvoorbereiding, bacteriële adhesie bij 4°C en time-lapse fluorescentie-imaging met intervallen van 30 minuten over een periode van 20 uur.
- Analytics: Genereert kwantitatieve groeitrajecten via achtergrondsubtractie, illuminatiecorrectie en ROI-gebaseerde fluorescentiemeting, waardoor statistische vergelijking van condities mogelijk wordt.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt met preklinische relevantie door interacties afhankelijk van Type VI-secretie te modelleren in Pseudomonas aeruginosa, een pathogeen met biomedische betekenis.
- Enterprise Hergebruik: Fungeert als een herbruikbaar platform voor het screenen van microbiële interacties in de industrie, geneeskunde en milieu-applicaties dankzij de parallelle doorvoer en precisie in een afgesloten omgeving.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid bij targetvalidatie door kwantificering van microbiële interactie-effecten in ruimtelijk beperkte omgevingen.
- Operationele waarde: Standaardisatie en reproduceerbaarheid via gecontroleerde chipvoorbereiding, fluorescentielabeling en geautomatiseerde workflows voor beeldanalyse.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen door het verminderen van mechanistische ambiguïteit bij de identificatie van antimicrobiële targets in een vroeg stadium.
- Impact op de portfolio: Risicogebaseerde prioritering op basis van kwantitatieve interactiegegevens uit high-throughput community-arrays.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in microbiologie, fluorescentiemicroscopie en software voor beeldanalyse voor de instelling van ROI en kwantitatieve metingen.
- Is afhankelijk van infrastructuur voor silicium-microfabricage, met agarose gecoate objectglasassemblages en kamers voor omgevingscontrole voor stabiele beeldvorming gedurende 24 uur.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor de bacteriële preparatie, OD-aanpassing en paryleenverwijderingsstappen om wel-specifieke adhesie te garanderen.
- Vereist aanpassingen bij uitbreiding van Pseudomonas aeruginosa naar andere microbiële modellen vanwege variaties in oppervlaktechemie en groei.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak van aseptische technieken bij het hanteren van Pseudomonas aeruginosa en mogelijke variabiliteit tussen de wells voor kenmerken kleiner dan 10 micron.
