Detectie en visualisatie van DNA-schade-geïnduceerde eiwitcomplexen in suspensiecellenculturen met behulp van de proximity-liggingsassay
June 9th, 2017
Hier wordt aangetoond hoe de in situ Proximity Ligation Assay (PLA) kan worden gebruikt om de directe eiwit-eiwit interacties tussen ATM en p53 te detecteren en visualiseren in suspensiecellen die blootgesteld zijn aan genotoxische stress.
Het algemene doel van dit nabijheidsligatie-assay-experiment is om de vorming van DNA-schadereactie en reparatie-eiwitcomplexen te visualiseren en te kwantificeren na het induceren van DNA-schade in suspensiecellenculturen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over DNA-schadeherstel, zoals ruimtelijk-temporele organisatie en regulatie en hoe verschillende herstelroutes reageren op verschillende soorten DNA-schade. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het relatief eenvoudig is, een laag aantal cellen vereist en geen uitgebreide verwerking vereist, wat eiwit-eiwitinteracties kan verstoren of veranderen.
Hoewel deze methode inzicht kan geven in DNA-reparatie, eiwitcomplexvorming in cultuur-suspensiecellen, kan deze ook worden toegepast in gekweekte adherente cellen, bevroren of paraffine-ingebedde weefsels en zelfs hele dieren. De humane BCR able-positieve, b-cel acute lymfatische leukemielijn, BV-173, wordt in deze studie gebruikt en gekweekt in IMDM met supplementen bij 37 graden Celsius in een atmosfeer van 5%CO2. Plaats de cellen bij twee keer 10 tot de zesde per milliliter in een zeswellplate bij vijf milliliter per putje.
Om de cellen in de G1-fase van de celcyclus te arresteren, voeg vijf micromolar van ammoniummethanesulfonaat toe aan elke putje en incubeer de plaat een nacht bij 37 graden Celsius in een atmosfeer van 5%CO2. Voeg op de volgende dag vijf micromolar van een ATM-remmer toe aan elk van twee putjes en breng de plaat terug naar de incubator gedurende 30 minuten. Induceer vervolgens DNA-schade door 50 nanogram per milliliter NCS toe te voegen aan een van de putjes dat werd voorbehandeld met de ATM-remmer en aan een ander putje dat niet voorbehandeld werd.
Incubeer gedurende twee uur. Bereid 1XPBS plus 10%BSA voor door vijf gram fractie-5 BSA bovenop 50 milliliter 1XPBS in een beker te leggen en laat het zitten bij kamertemperatuur zonder te schudden of roeren tot de BSA is opgelost. Filter de PBS plus 10%BSA-oplossing langzaam door een 0,22 micrometerfilter en bewaar het op ijs.
Verzamel de cellen door de inhoud van elke putje over te brengen in een 15 milliliter buisje. Was de cellen twee keer met ijskoud 1XBPS. Na het tellen van de cellen, resuspendeer bij twee keer 10 tot de zesde cellen per milliliter in 1XBPS plus 10%BSA.
Houd de cellen op ijs. Bereid de microscoopglazen voor deze procedure voor door ze voorzichtig te polijsten met pluisvrij weefsel en ze te ontvetten door een 96%ethanol in een Coplin-pot gedurende vijf minuten te plaatsen. Laat de glazen 10 minuten aan de lucht drogen.
Monteer de microscoopglazen in de cytospin-cytologie-trechters met een oppervlakte van zes milliliter. Bedek de glazen vooraf door 50 microliter 1XPBS plus 10%BSA in elke trechter te pipetten en centrifugeer gedurende één minuut bij 500 RPM. Voeg aan elke trechter 100 microliter van de celsuspensie toe en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 500 RPM.
Demonteer voorzichtig de trechters en zorg ervoor dat u de vlekken op de glazen niet aanraakt. Gebruik een Pap-pen vloeibare blokker met een vijf millimeter punt om een cirkel rond elke vlek te tekenen. Voeg vervolgens 50 microliter 4%PFA-fixatieoplossing toe aan elke vlek.
En incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Na 30 minuten, was de cellen met 1XPBS in een Coplin-pot bij kamertemperatuur met zachte agitatie. Was drie keer op deze manier gedurende vijf minuten elke keer.
Droog de glazen rond de vlekken met een pluisvrij weefsel en verwijder zoveel mogelijk vloeistof van de vlekken door de schuif te kantelen en te drogen met pluisvrij weefsel. Voeg 50 microliter 0,25%Triton X in 1XPBS toe aan elke vlek en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur zonder agitatie. Was de glazen in 50 tot 60 milliliter TBS-T in een Coplin-pot bij kamertemperatuur met zachte agitatie.
Drie keer gedurende vijf minuten elke keer. Voor het blokkeren, tap TBS-T af en droog de glazen rond de vlekken met een pluisvrij weefsel. Verwijder zoveel mogelijk vloeistof van de vlek.
Vortex kort de blokkeringsoplossing en voeg vervolgens een druppel van ongeveer 40 microliter toe aan elke vlek. Plaats de glazen in een voorverwarmde bevochtigde kamer en incubeer gedurende één uur bij 37 graden Celsius. Bereid de antilichaamcocktails voor.
Vortex en pipet vervolgens commercieel antilichaamverdunning in elke microfugebuis. Voeg het geitenanti-ATM-antilichaam toe bij 1:1000. En het konijnenanti-fosforser-15 p53-antilichaam bij 1:100.
Voor experimenten met enkele antilichamen bereid antilichaamdiluties voor die alleen het geitenanti-ATM-antilichaam en alleen het konijnenanti-fosforser-15 p53-antilichaam bevatten. Bij het voltooien van de een uur durende incubatie tap de blokkeringsoplossing af, maar zorg ervoor dat de cellen niet uitdrogen. Voeg 30 microliter van elke antilichaamdilutiecocktail toe en incubeer in een bevochtigde kamer bij vier graden Celsius een nacht.
Op de volgende dag, was de glazen met 1X NC2 wasbuffer A in een Coplin-pot bij kamertemperatuur met zachte agitatie twee keer gedurende vijf minuten elke keer. Nadat de glazen twee keer met wasbuffer A waren gewassen, tap de wasbuffer van de glazen af en voeg 30 microliter van de nabijheidsligatie-assay sondevermenging toe aan elke vlek. Incubeer gedurende één uur bij 37 graden Celsius in een voorverwarmde bevochtigde kamer.
Was de glazen met 50 tot 60 milliliter wasbuffer A in een Coplin-pot bij kamertemperatuur met zachte agitatie. Bereid vervolgens de ligatieligaseoplossing op ijs voor door één microliter ligase toe te voegen aan 39 microliter ligatieoplossing voor elke vlek. Vo
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie toont het gebruik van de in situ Proximity Ligation Assay (PLA) om directe eiwit-eiwit interacties tussen ATM en p53 in suspensie celculturen onder genotoxische stress te detecteren en visualiseren. De methode maakt het mogelijk om de respons op DNA-schade en reparatie-eiwitcomplexen te visualiseren en kwantificeren.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- DNA-schade reparatie
Achtergrond
- Het begrijpen van eiwitinteracties is cruciaal voor het bestuderen van de DNA-schaderesponsie.
- Proximity Ligation Assay (PLA) is een krachtig hulpmiddel voor het visualiseren van eiwitcomplexen.
- Genotoxische stress kan complexvorming tussen DNA-reparatie-eiwitten induceren.
- Deze studie maakt gebruik van de BV-173-cellijn voor experimenten.
Doel van het onderzoek
- Om eiwit-eiwit interacties in reactie op DNA-schade te visualiseren.
- Om de vorming van eiwitcomplexen betrokken bij DNA-reparatie te kwantificeren.
- Om de ruimtelijk-tijdelijke organisatie van reparatieroutes te verkennen.
Gebruikte methoden
- In situ Proximity Ligation Assay (PLA) voor het detecteren van eiwitinteracties.
- Gebruik van suspensie celculturen blootgesteld aan genotoxische stress.
- Celcultuur van BV-173 in IMDM met supplementen bij 37°C.
- Cellen plateren bij een dichtheid van 2 x 10^6 per milliliter.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van ATM en p53 interacties.
- Kwantificering van eiwitcomplexvorming in reactie op DNA-schade.
- Inzichten in de dynamiek van DNA-reparatieroutes.
- Demonstratie van de toepasbaarheid van de methode in verschillende celtypen.
Conclusies
- De PLA-techniek is effectief voor het bestuderen van eiwitinteracties bij DNA-reparatie.
- Deze methode kan worden aangepast voor verschillende celtypen en condities.
- De bevindingen dragen bij aan het begrijpen van de regulatie van de DNA-schaderesponsie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Proximity Ligation Assay (PLA) enables direct visualization of protein-protein interactions in suspension cell cultures, addressing a critical gap in DNA damage response research. This method supports target validation by confirming functional interactions between key signaling proteins such as ATM and p53 under genotoxic stress. The assay provides quantitative, spatially resolved data that enhances predictive confidence in early discovery and mechanistic de-risking of DNA repair pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Confirms direct ATM-p53 interaction upon DNA damage, supporting functional validation of DNA damage response targets.
- Operational Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in suspension cultures relevant to hematologic malignancies.
- Predictive Value: Quantifies interaction frequency (e.g., ~7 signals/cell post-damage) to inform target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Detects proximal protein complexes (<40 nm) with high specificity, reducing false positives from co-localization alone.
- Operational Value: Requires low cell numbers and minimal processing, preserving native protein interactions.
- Assay Readiness: Compatible with cytospin preparation and standard fluorescence microscopy, enabling scalable implementation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Links DNA damage sensing to downstream signaling via ATM-mediated p53 phosphorylation.
- Mechanistic De-risking: Demonstrates dependency of p53-S15 phosphorylation on ATM kinase activity via inhibitor studies.
- Model Relevance: Uses BV-173 suspension cells, a clinically relevant pre-B ALL model, to study DNA repair in hematologic contexts.
Pipeline & Workflow Integration
PLA fits within the discovery continuum from target validation to preclinical mechanistic studies, particularly for DNA damage response and repair pathway modulation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of kinase-substrate relationships and pathway activation in response to genotoxins.
- Screening: Enables reproducible, quantitative readouts of protein interaction dynamics in suspension cells.
- Analytics: Provides punctate nuclear signals as measurable outputs for comparing conditions (e.g., ±ATM inhibitor, ±NCS).
- Translational Research: Connects early target engagement to functional outcomes in DNA repair and cell fate decisions.
- Enterprise Reuse: Adaptable to adherent cells, tissues, and whole animals, supporting cross-platform target validation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Direct visualization of protein interactions reduces mechanistic ambiguity in signaling pathways.
- Operational Value: Simple workflow, low cell input, and compatibility with suspension cultures increase accessibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by confirming target engagement and pathway specificity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of DNA repair targets based on interaction validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence and proximity ligation assay techniques.
- Dependent on validated primary antibodies (e.g., anti-ATM, anti-pS15 p53) and optimization via titration.
- Necessitates controlled incubation conditions (humidified chamber, temperature shifts) for reagent steps.
- Applicable across model systems with adaptation of cell preparation and fixation methods.
- Limited by antibody availability and specificity; single antibody controls essential for specificity confirmation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:02
Treatment of Cells and Induction of DNA Damage
12:03
Conclusion
10:34
Results: The PLA Assay Detects Direct Protein-protein Interactions in Suspension Cell Cultures
3:21
Cytocentrifugation, Fixation, and Permeabilization
5:35
Blocking and Primary Antibody Incubation
7:19
PLA Probes, Ligation, and Amplification
9:04
Mounting and Imaging
