Isolatie Murine vetweefsel afgeleide microvasculaire fragmenten als Vascularisatie eenheden voor Tissue Engineering

Het algemene doel van deze procedure is om microvasculaire fragmenten te isoleren uit muis vetweefsel voor het genereren van vascularisatie-eenheden voor weefselengineering. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van weefselengineering over de in vivo vascularisatie van weefselsubstituten. Een voordeel van deze techniek is dat het volledig functionele microvasculaire segmenten oplevert zonder complexe in vitro verwerking die op scaffolds kunnen worden gezaaid en in weefseldeffecten kunnen worden geïmplanteerd.

Deze methode kan ook worden toegepast op andere systemen zoals in vitro angiogenese-assays om moleculaire mechanismen te ontrafelen die ten grondslag liggen aan de vorming en remodellering van microvasculaire netwerken. Begin met het plaatsen van een geanestheseerde mannelijke wildtype C57 zwarte zes muis in de rugligging onder een chirurgische stereomicroscoop en bevestig het ontbreken van reactie op teenprik. Immobiliseer de poten met plakband en desinfecteer de buik.

Gebruik vervolgens disserpeerschaar om de buiklaag te scheiden van het onderliggende spierweefsel en maak een middenlijnlaparotomie. Vouw de flappen van de buikwand lateraal uit en identificeer bilateraal de testikels, epididymis en de epididymale vetkussens. Gebruik vervolgens kleine preparatiescharen en fijne pincetten om de vetkussens te oogsten, zorg ervoor dat u geen epididymaal weefsel verzamelt en plaats de vetkussens in een petrischaaltje met 15 ml 37 graden celsius DMEM.

In een laminaire stromingskap, was de vetkussens in drie afzonderlijke petrischalen met 15 ml PBS en plaats het gewassen vet in een lege 14 ml polypropyleen buis. Gebruik een buisschaal om het volume van het geoogste vet te bepalen. Gebruik vervolgens fijne schaar om het vetweefsel mechanisch te snijden.

Wanneer een homogene weefselsuspensie is verkregen, gebruik een 10 mL meetpijp om het gesneden weefsel met twee volumes collaginase NB 4G over te brengen in een 50 mL erlenmeyer kolf met een 25 millimeter roerstaaf. Plaats de kolf in een cellencultuur incubator gedurende 10 minuten onder krachtig roeren. Observeer vervolgens 10 mcL van het verteerde weefsel onder een microscoop.

De moeilijkste stap in deze isolatieprocedure is het identificeren van het juiste moment om de vertering te stoppen. Het te lang verteren van de vetkussens zal resulteren in een enkele celsuspensie zonder enige microvasculaire fragmenten. Als het digestaat vrije microvasculaire fragmenten afkomstig van adipeus weefsel bevat naast enkele cellen, neutraliseer het enzym met twee volumes PBS aangevuld met 20%FCS en breng de celvattensuspensie over in nieuwe polypropyleen buizen.

Incubeer de oplossing gedurende vijf minuten bij 37 graden celsius om de microvasculaire fragmenten van het resterende vet te scheiden door middel van zwaartekracht. Gebruik vervolgens een 1 mL precisiepipet om voorzichtig 1 mL van de hoofdvetsupernatant te verwijderen, gevolgd door het gebruik van een 100 mcL precisiepipet om de rest van de supernatant te verwijderen totdat de suspensie vetvrij lijkt. Wanneer al het vet is verwijderd, gebruik een 10 mL meetpijp om de celvattensuspensie te filteren door een 50 micron zeef over een 50 mL conische buis en breng de gefilterde suspensie over in een nieuwe 14 mL polypropyleen buis voor elke individuele microvasculaire fragment isolaat.

Verzamel de microvasculaire fragmenten door centrifugatie en verwijder alles behalve de laatste 1 mL supernatant uit elke buis. Resuspendeer de pellets in de resterende supernatanten. Breng vervolgens elke suspensie over in afzonderlijke 1,5 mL conische microcentrifugebuisjes en pellet de microvasculaire fragmenten opnieuw voor resuspendering in het juiste eindvolume van PBS en 20%FCS voor de geplande downstream analyse.

Hier wordt de lengteverdeling van vers geïsoleerde microvasculaire fragmenten van zes, zeven tot twaalf maanden oude wildtype C57 zwarte zes muizen getoond, met een gemiddelde lengte van ongeveer 42 micrometer. Zoals deze representatieve celvattensuspensie-uitstrijk aantoont, worden grote, middelgrote en kleine microvasculaire fragmenten evenals enkele cellen waargenomen wanneer het vetweefsel voldoende is verteerd. Hogere vergroting laat zien dat de microvasculaire fragmenten een volwassen microvatmorfologie vertonen met hiërarchische microvatsegmenten.

Karakterisering van de microvasculaire fragmenten door middel van flowcytometrie geeft aan dat ze CD31-positieve endotheelcellen, alpha gladde spieracton-positieve paravasculaire cellen en CD117-positieve mesenchymale stamcellen, markerexpressiecellen bevatten. Na zaaien op een dermale huidsubstituut zijn grotere microvasculaire fragmenten voornamelijk gelokaliseerd op het oppervlak van het implantaat met enkele capillaire vaatsegmenten gedetecteerd in de implantaatkernen. Immunohystochemische kleuring van de gezaaide microvasculaire fragmenten onthult verder fysiologische microvatconfiguraties met arteriële, veneuze en capillaire-achtige fragmenten.

Eenmaal beheerst, kan deze techniek in twee uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u microvasculaire fragmenten kunt isoleren uit muis vetweefsel als vascularisatie-eenheden voor weefselengineering.