Name: Murine Korte As Ventriculaire Hartschijven voor Elektrofysiologische Studies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Leer hoe je levensvatbare ventriculaire hartschijven van muizen prepareert voor elektrofysiologische metingen. Deze techniek behoudt de in vivo-achtige weefselstructuur en maakt directe metingen in alle hartregio's mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij erkennen de ondersteuning die wordt verstrekt door de workshops en de dierfaciliteit van het Institute of Neurophysiology. Dit werk werd ondersteund door Walter und Marga Boll-Stiftung, Köln Fortune en Deutsche Stiftung für Herzforschung.

Dierbehandeling moet voldoen aan de richtlijnen van het lokale dierenwelzijnscomité en aan de Richtlijn 2010/63 / EU van het Europees Parlement. 1. Bereid Oplossingen voor <ol><li> Bereid de oplossing van Tyrode zonder Ca 2+ (samenstelling in mM): NaCl 136, KCl 5.4, NaH 2 PO 4 0,33, MgCl 2 1, glucose 10, HEPES 5, 2,3-butandiolmonoxime (BDM) Met NaOH bij 4 ° C. </li><li> Bereid Tyrode&#39;s oplossing met Ca2 + (samenstelling in mM): NaCl 136, KCl 5.4, NaH2P04 0,33, MgCl2 1, glucose 10, HEPES 5, BDM 30, CaCl2 0,9. Pas de pH aan op 7,4 met NaOH bij 4 ° C. </li><li> Bereid 4% low-melt agarose: Zet 0,6 g laagsmelt agarose in 15 ml Tyrode&#39;s oplossing zonder Ca 2+ . Verhit het mengsel tweemaal bij 750 W gedurende 10-15 s tot de agarose opgelost is. Houd de oplossing bij een constante temperatuur van 37 &amp;# 176; C en roer continu. </li><li> Bewaar Dulbecco&#39;s Gemodificeerde Eagle Medium (DMEM) zonder serum bij 37 ° C met carbogen (5% CO 2 , 95% O 2 ) geborreld. </li></ol> 2. Bereid de Microtome voor <ol><li> Schakel de microtome in. </li><li> Vul de buitenste microtoomkamer met ijs. </li><li> Vul de innerlijke microtoomkamer met ijskoude Tyrode&#39;s oplossing zonder Ca 2+ en zet de oplossing voortdurend met 100% O 2 . </li><li> Plaats een stalen mes in de meshouder van de microtome. </li></ol> 3. Muis Hart Isolatie <ol><li> Injecteer 2.500 U heparine subcutaan. Wacht 15 minuten. </li><li> Offer het dier door cervicale dislocatie. </li><li> Open de borst door sternotomie. </li><li> Ontleed het pericardium zorgvuldig met behulp van een kleine schaar en een tang # 5. </li><li> Plaats een canule in de oplopende aorta en vul de kransslagaders in situ met ijskoude Tyrode&#39;sOplossing zonder Ca 2+ tot het resterende bloed wordt verwijderd. </li><li> Zet het hart voorzichtig met een tang en een schaar en verplaats het hart in ijskoude Tyrode&#39;s oplossing is gereden zonder Ca 2+ . </li><li> Scheep de atria uit de ventrikels met een scalpel of een schaar. </li></ol> 4. Inbedding van de ventrikels in 4% Low-Melt Agarose <ol><li> Plaats de ventrikels met de top naar boven in de agarosevorm ( Figuur 1 ). Plaats de pen in het midden van de mal in de linker ventrikelkamer. </li><li> Vul de mal met 4% lage smelt agarose bij 37 ° C tot het hart volledig is bedekt. </li><li> Leg de mal op ijs voor een snellere verharding van de agarose die het drijven van het weefsel voorkomt. </li><li> Verwijder het agarose blok dat de ventrikels uit de mal met een scalpel bevat. </li><li> Draai het blok ondersteboven en vul ventriculaire kamers en de spleet op de achterkant van het agarose blok, welke ikS gelaten door de speld van de molt, met 4% laagmelt agarose met behulp van een injectiespuit met een 20 G-naald. </li><li> Trim het agarose blok met een scalpel om een ​​platte bodem van het blok te bereiken en de rechtopstand van de harttap. </li></ol> 5. Snijden van de ventriculaire weefsel <ol><li> Bevestig het blok op de specimenhouder van de microtome met een druppel cyanoacrylaatlijm. Ga naar de harttoppen omhoog. </li><li> Plaats de monsterhouder in de binnenste kamer van de microtome, die gevuld is met ijskoude Tyrode zonder Ca 2+ . Dek het agarose blok volledig met Tyrode&#39;s oplossing. </li><li> Bereid kortgesneden plakken met een dikte van 150-400 μm, afhankelijk van de verdere toepassing (voor scherpe elektrode opnames 150-200 μm), houd de trillingsfrequentie van het mes bij 60-70 Hz en beweeg het mes zo langzaam mogelijk naar voren . </li><li> Gebruik een fijne poets om de resterende agarose zorgvuldig uit de plakken te verwijderen. </li><li> Voorzichtig transfeR plakjes met een Pasteur pipette in de Tyrode oplossing met 0,9 mM Ca 2+ belucht met 100% O 2 en houd ze gedurende tenminste 30 minuten op ijs om ze te herstellen uit de snijprocedure. </li><li> Daarna houd u 30 minuten schijfjes in DMEM bij 37 ° C, beluchten met carbogen, om BDM uit te spoelen voor verder gebruik. </li></ol> 6. De Sharp Electrode Setup voorbereiden <ol><li> Voor voorverwarming, schakel alle elektrische apparaten 30 minuten in voordat de opnames starten. </li><li> Zet een 3 cm celcultuurschotel op de verwarmingsplaat geplaatst op de omgekeerde microscoop. </li><li> Plaats de op maat gemaakte ringelektrode (afbeelding 2 ) in de schotel en verbind de aardkabels van de voorversterker en de stimulatie-elektrode. </li><li> Sluit de flexibele buizen van het perfusiesysteem aan op de schotel. </li><li> Vul het reservoir van het perfusiesysteem met DMEM, belicht met carbogen. </li><li> Schakel de perfusiepomp in en zet de perfusie-raTe 2-3 ml / min. </li><li> Stel de temperatuur van DMEM in het gerecht op tot 37 ° C door de stookverwarming en de verwarmingsplaat te regelen. </li></ol> 7. Actieve potentiële opnames <ol><li> Plaats een ventrikelschijf in de DMEM-vulling. </li><li> Controleer de structurele integriteit en levensvatbaarheid (gebaseerd op contractiele functie) van het weefsel met de omgekeerde microscoop. </li><li> Vul een opnameglaselektrode met 3 M KCL. </li><li> Vul een stimulatie-elektrode met DMEM. </li><li> Plaats de opnamelektrode en de stimulatieelektrode op de elektrodenhouders. </li><li> Plaats de stimulatie-elektrode zorgvuldig op de plak en zet de elektrische stimulator aan. Begin met een stimuleringsfrequentie van 1-2 Hz. </li><li> Verplaats de opnamelektrode met de micromanipulator over de beoogde opname positie. </li><li> Laat de opnameelektrode langzaam zakken tot de punt het weefsel raakt. </li><li> Breng een korte rechthoekige elektrische puls door deOpname elektrode om het celmembraan te penetreren. </li><li> Zet de opnameelektrode voorzichtig terug totdat een stabiel signaal is gewaarborgd. </li><li> Begin met opname van actiepotenties. </li></ol>

<ol><li>Yamamoto, C., McIlwain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+activities+in+thin+sections+from+the+mammalian+brain+maintained+in+chemically-defined+media+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro.</a> J Neurochem. 13, 1333-1343 (1966).</li>
<li>Colbert, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cortical+brain+slices+for+electrophysiological+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording.</a> Methods Mol Biol. 337, 117-125 (2006).</li>
<li>Ad Graaf, I., Groothuis, G. M., Olinga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision-cut+tissue+slices+as+a+tool+to+predict+metabolism+of+novel+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Metab+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Precision-cut tissue slices as a tool to predict metabolism of novel drugs.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 3, 879-898 (2007).</li>
<li>Kim, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiopulmonary+toxicity+of+peat+wildfire+particulate+matter+and+the+predictive+utility+of+precision+cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Part+Fibre+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Cardiopulmonary toxicity of peat wildfire particulate matter and the predictive utility of precision cut lung slices.</a> Part Fibre Toxicol. 11, 29(2014).</li>
<li>Nembo, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+chronotropic+effects+of+Erythrina+senegalensis+DC+%28Fabaceae%29+aqueous+extract+on+mouse+heart+slice+and+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">In vitro chronotropic effects of Erythrina senegalensis DC (Fabaceae) aqueous extract on mouse heart slice and pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> J Ethnopharmacol. 165, 163-172 (2015).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+tissue+slices%3A+preparation%2C+handling%2C+and+successful+optical+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308, H1112-H1125 (2015).</li>
<li>Bussek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+slices+from+adult+mammalian+hearts+as+a+model+for+pharmacological+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tissue slices from adult mammalian hearts as a model for pharmacological drug testing.</a> Cell Physiol Biochem. 24, 527-536 (2009).</li>
<li>Burnashev, N. A., Edwards, F. A., Verkhratsky, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+recordings+on+rat+cardiac+muscle+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp recordings on rat cardiac muscle slices.</a> Pflugers Arch. 417, 123-125 (1990).</li>
<li>Pillekamp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+mouse+embryonic+heart+slice+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation.</a> Cell Physiol Biochem. 16, 127-132 (2005).</li>
<li>Pillekamp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+murine+heart+slices.+A+robust+model+to+study+ventricular+isometric+contractions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Neonatal murine heart slices. A robust model to study ventricular isometric contractions.</a> Cell Physiol Biochem. 20, 837-846 (2007).</li>
<li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventricular+slices+of+adult+mouse+hearts--a+new+multicellular+in+vitro+model+for+electrophysiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Ventricular slices of adult mouse hearts--a new multicellular in vitro model for electrophysiological studies.</a> Cell Physiol Biochem. 18, 1-8 (2006).</li>
<li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+maturation+and+integration+of+murine+fetal+cardiomyocytes+after+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological maturation and integration of murine fetal cardiomyocytes after transplantation.</a> Circ. Res. 101, 484-492 (2007).</li>
<li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-course+of+the+electrophysiological+maturation+and+integration+of+transplanted+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Time-course of the electrophysiological maturation and integration of transplanted cardiomyocytes.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 53, 401-408 (2012).</li>
<li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+persistence+and+electrical+integration+of+transplanted+fetal+cardiomyocytes+from+different+developmental+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Cell persistence and electrical integration of transplanted fetal cardiomyocytes from different developmental stages.</a> Int. J. Cardiol. 171, e122-e124 (2014).</li>
<li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+integration+and+action+potential+properties+of+transplanted+cardiomyocytes+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological integration and action potential properties of transplanted cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells.</a> Cardiovasc. Res. 100, 432-440 (2013).</li>
<li>Verrecchia, F., Herve, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+blockade+of+gap+junctional+communication+by+2%2C3-butanedione+monoxime+in+rat+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes.</a> Am J Physiol. 272, C875-C885 (1997).</li>
<li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+effect+of+2%2C3-butanedione+monoxime+%28BDM%29+on+Na%28%2B%29%2FCa%282%2B%29+exchange+current+in+guinea-pig+cardiac+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes.</a> Br J Pharmacol. 132, 1317-1325 (2001).</li>
<li>Fleischmann, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+subunit+composition+of+the+G+protein-activated+inward-rectifier+potassium+channel+during+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Differential subunit composition of the G protein-activated inward-rectifier potassium channel during cardiac development.</a> J Clin Invest. 114, 994-1001 (2004).</li>
<li>Peinkofer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Early+Embryonic+to+Adult+Stage%3A+Comparative+Study+of+Action+Potentials+of+Native+and+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">From Early Embryonic to Adult Stage: Comparative Study of Action Potentials of Native and Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Stem Cells Dev. 25, 1397-1406 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te verklaren.

Ventriculaire plakjes maken elektrofysiologische, farmacologische en mechanische studies mogelijk met een behouden in vivo weefselstructuur en directe toegang van de meettechnologie naar alle regio&#39;s van het hart. Fysiologische actiepotentieel eigenschappen zijn aangetoond in embryonale, neonatale en volwassen plakjes 9 , 10 , 11 . De vitaliteit van de plakjes, behalve de oppervlaktelagen die direct beschadigd zijn...

Weefselschijfjes zijn vaak gebruikt in de basiswetenschap, aangezien Yamamot en Mcllwain in 1966 toonden dat de elektrische activiteit van hersenschijfjes in vitro 1 wordt behouden. Sindsdien zijn elektrofysiologische en farmacologische studies uitgevoerd op plakjes van hersenen 2 , lever 3 , long 4 en myocardiaal weefsel 5 , 6 , 7 . Eerste patch-clamp opnames in ventriculaire plakjes van neonatale rat harten werden beschreven in 1990 8 , maar deze techniek viel al een tijdje in vergetelheid. Meer dan een decennium later vestigde onze groep een nieuwe methode om muizen embryonale 9 , neonatale 10 en volwassen 11 hartschijven te bereiden. Deze levensvatbare weefselplakken kunnen worden gebruikt voor acute experimenten (volwassen plakS kunnen meerdere uren worden gekweekt) of korte-termijncultuur experimenten (embryonale en neonatale plakjes kunnen enkele dagen worden gekweekt). Plakjes tonen in vivo zoals elektrofysiologische kenmerken en een homogene excitatieverspreiding zoals beoordeeld door scherp elektrode-actiepotentieel en micro-elektrode-opnamen 11 . Door hun &quot;tweedimensionale&quot; morfologie bieden ze rechtstreekse toegang tot opnameelektroden aan alle gebieden van de ventrikel, waardoor ze een interessant instrument zijn voor elektrofysiologische onderzoeken en nieuwe experimentele opties opbouwen in vergelijking met Langendorff-perfuse gehele harten. Drugrespons van de plakjes naar ionenkanaalblokkers zoals verapamil (L-type Ca 2+ -kanaalblokker), lidocaïne (Na + -kanaalblokker), 4-aminopyridine (niet-selectieve spanningsafhankelijke K + -kanaalblokker) en linopirdine (KCNQ K + -kanaalblokkeraar) 9 , 11 </suP&gt; correspondeerde met bekende effecten op gedissocieerde cardiomyocyten. Isometrische krachtmetingen onthulden een positieve krachtfrequentieverhouding en stelden sterk intacte contractiele functie 10 voor . Deze bevindingen aangetoond dat murine ventriculaire plakjes geschikt zijn als een in vitro weefselmodel voor fysiologische en farmacologische studies. Bovendien zijn ventriculaire snijpunten van ontvanger harten in combinatie met scherpe elektrode opnames een zeer behulpzaam hulpmiddel om elektrische en mechanische integratie te identificeren, evenals rijping van transplantaat van 12 , 13 , 14 en stamcellen afgeleide 15 cardiomyocyten. Samenvattend zijn ventriculaire plakjes een waardevol en goed vast te stellen multicellulair weefselmodel en moeten beschouwd worden als complementair aan gedissocieerde cardiomyocyten en Langendorff-geperfuseerde hartenIn het hart- en vaatonderzoek, met het grootste voordeel van het leveren van een in vivo- weefselstructuur (in tegenstelling tot dissociatiecellen), evenals de directe toegang van meettechnologieën zoals scherpe elektrodeopnamen naar alle hartstreken (in tegenstelling tot hartpreparaten).

<table><tbody><tr><td>Leica VT 1000s</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td></td><td>Microtoom met trillende mes.</td></tr><tr><td>Roestvrijstalen mesjes</td><td>Campden Instruments, Loughborough, England</td><td>7550-1-SS</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipetten</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>Z627992</td><td></td></tr><tr><td>Fijne borstel, bijv. maat 6 (4/32")</td><td>VWR, International, Radnor, USA</td><td>149-2125</td><td></td></tr><tr><td>Voorbereidingstafel</td><td></td><td></td><td>zelf gemaakt</td></tr><tr><td>Molt voor het inbedden van ventrikels in agarose</td><td></td><td></td><td>zelf gemaakt</td></tr><tr><td>1 mL-spuiten</td><td>Becton, Dickinson; Franklin Lakes, USA</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>27 G x 3/4`` naalden</td><td>Braun, Melsungen, Germany</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>20 G 11/2`` naalden</td><td>4657519</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleine schaar</td><td>WPI, Sarasota, USA</td><td>501263</td><td></td></tr><tr><td>Pincet #5, 0.1 x 0.06 mm tip</td><td>WPI, Sarasota, USA</td><td>500342</td><td></td></tr><tr><td>Zuurstofgas (medisch zuurstof)</td><td>Linde, München, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbogengas (95 % O2, 5 % CO2)</td><td>Linde, München, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>746436</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>NIST200B</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylaatlijm</td><td>Henkel, Düsseldorf, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low-melt agarose</td><td>Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>6351.2</td><td></td></tr><tr><td>Heparine-natrium-25000 I.E./5 mL</td><td>Ratiopharm, Ulm, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), hoge glucose, GlutaMAX</td><td>ThermoScientific, Waltham, USA</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>SEC-10LX Versterker</td><td>npi electronic GmbH, Tamm, Germany</td><td>SEC-10LX</td><td></td></tr><tr><td>EPC 9</td><td>HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 200</td><td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator met lage vergroting</td><td>Narashige, Tokyo, Japan</td><td>Nm-3</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator met hoge vergroting, drie assen</td><td>Narashige, Tokyo, Japan</td><td>MHW-3</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltiek perfusiepomp</td><td>Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany</td><td>PPS2</td><td></td></tr><tr><td>2-kanaals temperatuurregelaar</td><td>Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany</td><td>TCO02</td><td></td></tr><tr><td>Vierkant pulsstimulator</td><td>Natus Europe GmbH, Planegg, Germany</td><td>Grass SD9</td><td></td></tr><tr><td>Glasmacapillairen</td><td>WPI, Sarasota, USA</td><td>1B150F-1</td><td></td></tr></tbody></table>

murine korte as ventriculaire hartschijven voor elektrofysiologische studies

Murine Short Axis Ventricular Heart Slices for Electrophysiological Studies

Murine cardiomyocyten zijn uitgebreid gebruikt voor in vitro studies van hartfysiologie en nieuwe therapeutische strategieën. Echter, multicellulaire preparaten van gedissocieerde cardiomyocyten zijn niet representatief voor de complexe in vivo structuur van cardiomyocyten, niet-myocyten en extracellulaire matrix, die zowel mechanische als elektrofysiologische eigenschappen van het hart beïnvloedt. Hier beschrijven we een techniek om levensvatbare ventriculaire plakjes volwassen muisharten te bereiden met een behoud van in vivo weefselstructuur en hun geschiktheid voor elektrofysiologische opnamen aan te tonen. Na afscheiding van het hart worden ventrikels gescheiden van de atria, geperfumeerd met Ca2 + -vrije oplossing die 2,3-butaandionmonoxime bevat en ingebed in een 4% laagsmelt agarose blok. Het blok is op een microtome geplaatst met een trillend mes en weefselschijfjes met een dikte van 150-400 μm zijn bereid om de vibratie vrij te houdenFrequentie van het mes bij 60-70 Hz en beweeg het mes zo langzaam mogelijk naar voren. De dikte van de plakjes hangt af van de verdere toepassing. Plakjes worden opgeslagen in ijskoude Tyrode&#39;s oplossing met 0,9 mM Ca 2+ en 2,3-butandiolmonoxime (BDM) gedurende 30 minuten. Daarna worden plakken over 30 minuten overgebracht naar 37 ° C DMEM om de BDM uit te spoelen. Plakjes kunnen worden gebruikt voor elektrofysiologische studies met scherpe elektroden of micro-elektrode arrays, voor krachtsmetingen om contractiele functie te analyseren of om de interactie van getransplanteerde stamcel-afgeleide cardiomyocyten en gastheerweefsel te onderzoeken. Voor scherpe elektrode opnames wordt een plak in een 3 cm celcultuurschotel geplaatst op de verwarmingsplaat van een omgekeerde microscoop. De plak wordt gestimuleerd met een unipolaire elektrode, en intracellulaire actiepotenties van cardiomyocyten in de plak worden opgenomen met een scherpe glaselektrode.

Myocardinfarct leidt tot een vrijwel onomkeerbaar verlies van cardiomyocyten. Celvervangende therapie met behulp van stamcellen afgeleide cardiomyocyten voor exogene hartregeneratie is een veelbelovende therapeutische aanpak. Elektrische integratie en rijping van de getransplanteerde cellen zijn cruciaal voor de veiligheid en efficiëntie van celvervangende therapie. Om integratie en rijping te beoordelen, hebben we getransplan...

Hier beschrijven we de voorbereiding van levensvatbare ventriculaire plakjes van volwassen muizen en hun gebruik voor scherpe elektrodeactiepotentiële opnamen. Deze multicellulaire preparaten leveren een geconserveerde in vivo weefselstructuur, waardoor ze in vitro een waardevol model vormen voor elektrofysiologische en farmacologische studies.

Murine Korte As Ventriculaire Hartschijven voor Elektrofysiologische Studies

Murine cardiomyocytes have been extensively used for in vitro studies of cardiac physiology and new therapeutic strategies. However, multicellular ...

Het algemene doel van deze techniek is het verkrijgen van levensvatbare ventriculaire hartplakjes die geschikt zijn voor elektrofysiologische registraties. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen op weefselniveau binnen het vakgebied van de cardiale elektrofysiologie, zoals de elektrische integratie van getransplanteerde cardiomyocyten of de effecten van cardioactieve geneesmiddelen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat levensvatbare ventriculaire weefselplakjes een behouden, in vivo-achtige weefselstructuur hebben en directe metingen in alle regio's van het hart mogelijk maken.Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de elektrofysiologie van het muizenhart, kan deze ook worden toegepast op andere dieren, zoals konijnen of cavia's. Om deze procedure te starten, veegt u eerst de huid van het dier af met 70% ethanol. Ontleed na het openen van de thorax zorgvuldig het pericardium van het hart met een kleine schaar en een pincet.Plaats een canule in de linker ventrikel en perfuseer het hart in situ met ijskoude Tyrode-oplossing zonder calcium, totdat het resterende bloed is verwijderd. Resecteer vervolgens voorzichtig het hart en breng het over in de ijskoude Tyrode-oplossing zonder calcium. Scheid de atria van de ventricels met een scalpel of een schaar.Plaats vervolgens de ventrikels met de apex naar boven in de agarosevorm. Plaats daarna de pin in het midden van de vorm en in de linker ventrikelkamer. Vul de vorm met 4% low-melt agarose bij 37 °C totdat het hart volledig is bedekt.Plaats de mal vervolgens op ijs zodat de agarose sneller uithardt om te voorkomen dat het weefsel gaat drijven. Verwijder na één minuut het agaroseblok met de ventrikels met een scalpel uit de mal. Keer het blok daarna om en vul de ventrikelkamers en de opening aan de achterzijde van het agaroseblok met 4% low-melt agarose met behulp van een spuit.Trim vervolgens het agaroseblok met een scalpel om een vlakke onderkant en een rechtopstaande positie van de cardiac apex te verkrijgen. Fixeer bij deze procedure het blok met een druppel cyanoacrylaatlijm op de specimenhouder van de microtoom, waarbij de cardiac apex naar boven is gericht. Plaats vervolgens de specimenhouder in de binnenste specimenkamer van de microtoom, die is gevuld met ijskoud Tyrode zonder calcium.Zorg ervoor dat het agaroseblok volledig bedekt is met Tyrode-oplossing. Bereid de coupes met een dikte van 150 tot 400 micrometers, afhankelijk van de verdere toepassing. Houd de vibratiefrequentie van het mes op 60 tot 70 Hertz en beweeg het mes zo langzaam mogelijk naar voren.Verwijder vervolgens met een fijn penseel voorzichtig de resterende agarose van de plakjes. Breng de plakjes daarna voorzichtig met een Pasteur-pipet over in de Tyrode-oplossing met 0,9 millimolair calcium, belucht met 100% zuurstof. Bewaar ze gedurende ten minste 30 minuten op ijs om te herstellen van de snijprocedure.Het plaatsen van de plakjes op een netje helpt om ze plat te houden. Gebruik vervolgens filterpapier en een tweede netje om de plakjes over te brengen naar DMEM bij 37 °C, gebubbeld met carbogeen, om BDM uit te spoelen vóór verder gebruik. Schakel voor het voorverwarmen alle elektrische apparaten 30 minuten voor de opnames in.Plaats een celkweekschaal van drie centimeter met de warmteplaat op de geïnverteerde microscoop. Plaats vervolgens de op maat gemaakte ringelektrode in de schaal en verbind de aardingsdraden van de voorversterker en de stimulatie-elektrode. Verbind daarna de flexibele slangen van het perfusiesysteem met de schaal.Vul het reservoir van het perfusiesysteem met DMEM en belucht dit met carbogen. Zet vervolgens de perfusiepomp aan en stel de perfusiesnelheid in op twee tot drie milliliters per minuut. Stel de temperatuur van het DMEM in de schaal in op 37 °C door de stroomverwarmer en de warmteplaat te regelen.Plaats nu een ventriculaire slice in de met DMEM gevulde schaal. Controleer met de omkeermicroscoop de structurele integriteit en levensvatbaarheid van het weefsel. Vul vervolgens een registreerelektrode van glas met drie molair kaliumchloride en een stimulatie-elektrode met DMEM.Plaats vervolgens de registreerelektrode en de stimulatie-elektrode in de elektrodehouders. Plaats daarna de stimulatie-elektrode voorzichtig op de slice. Zet de elektrische stimulator aan en begin met een stimulatiefrequentie van één tot twee Hertz.Verplaats vervolgens de registreerelektrode met een micromanipulator naar de gewenste registratiepositie. Laat de registreerelektrode langzaam zakken tot de punt het weefsel raakt. Zodra de registratie het contact detecteert, wordt via de registreerelektrode een korte rechthoekige elektrische puls toegediend om het celmembraan te penetreren.Positioneer vervolgens de registratie-elektrode voorzichtig opnieuw totdat een stabiel signaal is gewaarborgd. Begin daarna met de registratie van actiepotentialen. Om de integratie en rijping te beoordelen, werden cardiomyocyten, afgeleid van iPSCM die eGFP tot expressie brengen, getransplanteerd in de gezonde harten van volwassen muizen.Hier wordt een ventriculaire hartslice getoond, met daarin de getransplanteerde iPSCM, die focaal werd gestimuleerd door een unipolaire elektrode in het gastweefsel. Intracellulaire actiepotentialen werden geregistreerd met scherpe glasmicro-elektroden gevuld met drie molar kaliumchloride in eGFP-positieve getransplanteerde iPSCM en het naburige gastweefsel binnen de slices. Hier volgen de registraties van de actiepotentialen in het gezonde gastweefsel en de getransplanteerde iPSCM.De plak werd focaal gestimuleerd met een stimulatie-elektrode geplaatst in het gastweefsel, bij ongeveer twee Hertz en vijf Hertz. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in één tot twee uur worden voltooid, mits deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de voorwaartse snelheid van het microtoommes zo laag mogelijk te houden.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals eerste metingen, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van celtherapie om de elektrische integratie en rijping van getransplanteerde cardiomyocyten in recipientenharten te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u levensvatbare korte-as-sneden van de ventrikels bereidt met behulp van een microtoom met een vibrerend mes.Deze plakjes zijn bijzonder geschikt voor elektrofysiologische opnames met scherpe glaselektroden.

murine-short-axis-ventricular-heart-slices-for-electrophysiological

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Hoge frequentie Doppler-echografie is een nieuwe technologie voor de beoordeling van regionale myocardiale functie. Dit werk presenteert eerste bewijs waaruit de toepasselijkheid van deze veelzijdige imaging platform voor de herhaalde meting van het myocard stam, dp / dt, en mitralisinsufficiëntie in de ischemie-reperfusie (IR) muizen hart.

Hoogfrequente hoge resolutie Echocardiografie: eerste bewijs op niet-invasieve Herhaalde Maatregel van myocard Strain, contractiliteit, en mitralisinsufficiëntie in de Ischemie-reperfusie Murine Hart

Chirurgisch trauma veroorzaakt een ontstekingsreactie. Cytokines en endogene liganden zijn bekend voor het moduleren van een myocard infarct grootte na ischemie en reperfusie. We presenteren een aangepaste gesloten kist model van muizen ischemie en reperfusie met behulp van gewichten opknoping om de effecten van thoracotomie te minimaliseren.

Een murine Closed-borst Model van myocardiale ischemie en reperfusie

This video demonstrates a vibratome-based procedure to generate viable, ultra-thin sections of pig heart. The prepared tissue slices can be cultured and used as model systems for pharmacological testing.

Generation of Porcine Ventricular Slices: A Vibratome-based Technique to Prepare Ultra-thin Slices of Pig Heart Tissue

We laten zien hoe we schuine plakjes van het ruggenmerg in jonge muizen bereiden. Deze voorbereiding maakt de stimulatie van de ventrale wortels mogelijk.

De Voorbereiding van de Oblique Spinal Cord Slices voor Ventral Root Stimulation

We ontwikkelden een horizontale slice voorbereiding van de zoogdierretina volwassene met het vlak van snijden parallel aan het netvliesoppervlak. Dendritische gebied van nonradially georiënteerde retinale neuronen werden niet afgekapt, waardoor de studie van de signaalverwerking met patch-klem en beeldvormende technieken.

Voorbereiding van de Horizontale Schijfjes van Adult Mouse Retina voor elektrofysiologisch onderzoek

Dit protocol beschrijft de procedure voor het doorsnijden en kweken van menselijke cardiale plakjes voor preklinische geneesmiddelentesten en beschrijft het gebruik van optische mapping voor het opnemen van transmembranespanning en intracellulaire calciumsignalen gelijktijdig van deze plakjes.

Preklinische Cardiale Elektrofysiologie Beoordeling door Dual Voltage en Calcium Optical Mapping van human organotypic cardiale plakjes

Dit protocol beschrijft hoe hartweefsel te snijden en te kweken onder fysiologische omstandigheden gedurende 6 dagen. Dit cultuursysteem kan worden gebruikt als een platform voor het testen van de werkzaamheid van nieuwe harthartfalen therapieën evenals betrouwbare testen van acute cardiotoxiciteit in een 3D-hartmodel.

Snijden en kweken Varkensharten onder fysiologische omstandigheden

Gepresenteerd is een protocol voor de isolatie van menselijke en dierlijke ventriculaire cardiomyocyten van vibratome-cut myocardische plakjes. Hoge opbrengsten van calciumtolerante cellen (tot 200 cellen/mg) kunnen worden verkregen uit kleine hoeveelheden weefsel (&lt;50 mg). Het protocol is van toepassing op myocardium dat tot 36 uur aan koude ischemie wordt blootgesteld.

Isolatie van human ventriculaire cardiomyocyten van Vibratome-Cut Myocardial Slices

Muismodellen maken het mogelijk om belangrijke mechanismen van aritmogenese te bestuderen. Voor dit doel zijn cardiomyocyten van hoge kwaliteit nodig om patchklemmetingen uit te voeren. Hier wordt een methode beschreven om murine atriale en ventriculaire myocyten te isoleren via retrograde enzymgebaseerde Langendorff-perfusie, die gelijktijdige metingen van calciumtransiënten en L-type calciumstroom mogelijk maakt.

Isolatie van hoogwaardige murine atriale en ventriculaire myocyten voor gelijktijdige metingen van Ca2+ transiënten en L-type calciumstroom

Vanwege de complexe anatomie kan een consistent reproduceerbaar dissectie- en oogstprotocol voor hartmonsters een uitdaging zijn om te implementeren. Dit manuscript presenteert de belangrijkste elementen van enkele standaard cardiale dissectieprotocollen, waarbij zowel de grove onderzoeksbenaderingen als de bemonsteringslocaties die vaak worden gebruikt voor histopathologisch onderzoek worden benadrukt.

Dissectietechnieken en histologische bemonstering van het hart in grote diermodellen voor hart- en vaatziekten

We presenteren een protocol voor ex vivo kweek van humaan ventriculaire myocardiale weefsel. Het maakt een gedetailleerde analyse van contractiekracht en kinetiek mogelijk, evenals de toepassing van pre- en afterload om de in vivo fysiologische omgeving beter na te bootsen.

Voorbereiding van menselijk myocardiale weefsel voor langdurige teelt

Leer hoe je levensvatbare ventriculaire hartschijven van muizen prepareert voor elektrofysiologische metingen. Deze techniek behoudt de in vivo-achtige weefselstructuur en maakt directe metingen in alle hartregio's mogelijk.

Murine Korte As Ventriculaire Hartschijven voor Elektrofysiologische Studies

Meer video's verkennen