Tijdafhankelijke toename in het netwerkrespons bij de stimulatie van neuronale celculturen op micro-elektrode arrays

Het algemene doel van deze procedure is om E17-muisneuronaal weefsel te isoleren en te associëren, om neuronenetwerken te kweken, op te nemen en te stimuleren op micro-elektrodenarrays. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de studie van netwerkdynamica, zoals deze betrekking hebben op de basismechanismen van leren en geheugen. Het grote voordeel van deze techniek is dat micro-elektrodenarrays van meerdere locaties tegelijkertijd kunnen opnemen en daarom een betere ruimtelijke, temporele resolutie kunnen geven, in vergelijking met de meer traditionele glazen pijp op eenmalige opname.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in de netwerkdynamica van leren en geheugen, kan deze ook worden gebruikt om de toxiciteit van geneesmiddelen te onderzoeken of paradigma's voor de volgende generatie, gepersonaliseerde geneeskunde te ontwerpen. Visuele demonstratie van dit proces is cruciaal, aangezien manipulatie van het weefsel tijdens het dissectie- en dissociatieproces moeilijk te leren is door alleen protocollen te lezen. Om de array voor te bereiden, voegt u 40 tot 50 microliter ontdooid laminine toe aan het centrum van elke MEA en 0,2 milliliter laminine aan de controleplakjes, met behulp van steriele pipettentips.

Bedek alle MEA's en de controleschalen in de biohood en breng ze over naar een incubatiekast bij 37 graden Celsius gedurende een uur. Na een uur verwijdert u voorzichtig het overtollige laminine uit het centrum van de MEA's met behulp van zuiging met steriele Pasteur-pipetten en laat u het oppervlak drogen voordat u gaat plateren. Giet vervolgens L-15-medium in vier 100 millimeter Petrischotels, bedek ze en plaats ze in een min 20 graden Celsius vriezer gedurende ongeveer 40 tot 60 minuten, totdat het medium een slushy consistentie heeft, maar niet vast bevroren is.

Voorbereiding voor de dissectie, plaats een glazen Petrischotel met de zijkant naar beneden in een bak vol ijs. Spuit nu de onderbuik van de dieren met 70%ethanol. Gebruik kleine chirurgische schaar om een V-vormige snede te maken door de huid en het onderhuidse vet van de onderbuik, waarbij de snede wordt uitgebreid tot aan de distale uiteinden van de borstholte, en de baarmoeder blootlegt.

Gebruik pincetten om voorzichtig de baarmoeder tussen de embryo's op te tillen. Snijd het bindweefsel weg met dissectieschaartjes totdat de hele baarmoeder vrij is. Spoel vervolgens de baarmoeder kort af met 70%ethanol om eventueel bloed te verwijderen en plaats deze in een van de vier Petrischotels gevuld met koud L-15.

Vervolgens laat u elk embryo los uit de baarmoeder en de binnenste embryozak, met behulp van twee paar fijne pincetten. Plaats de bevrijde embryo's in de tweede schotel gevuld met koud L-15, breng vervolgens de hoofden over naar de derde schotel en de lichamen naar de vierde. Plaats in de biohood een wig van gesteriliseerd filterpapier op de gekoelde glazen Petrischotelstandaard en plaats een embryohoofd op het filterpapier.

Plaats vervolgens de snijkant van de onderste schaar van de irisschaar in de basis van de schedel, houd de onderste schaar tegen de binnenkant van de schedel en weg van de hersenen, snijd door de occipitale plaat en vervolgens langs de middenlijn tussen de pariëtale platen. Ga door met snijden rostraraal tussen de kraakbeenachtige frontale schedelplaten. Begin vervolgens vanuit het midden van de occipitale plaat en maak een loodrechte snede naar links en rechts van de centrale snede.

Schuif vervolgens voorzichtig een kleine spatel tussen het ventrale oppervlak van de hersenen en de onderste schedelplaten, totdat deze volledig onder de hersenen is. Til vervolgens de spatel op om de hersenen te verwijderen. Gebruik een schone spatel om eerst de reukbol te verwijderen en vervolgens de frontale kwab in een trapeziumvormig patroon te dissecteren.

Breng vervolgens het weefsel over in een 15 milliliter centrifugeerbuis met opslagmedium. Gebruik in deze procedure twee steriele scalpelmesjes om het weefsel te hakken. Voeg vervolgens 2,5 milliliter van het Dnase papainemengsel toe aan het gehakte weefsel in de Petrischotel.

Slinger voorzichtig met de Petrischotel om ervoor te zorgen dat al het weefsel vrij in de oplossing is en niet aan de bodem van de schotel is gehecht. Plaats de schotel vervolgens gedurende 15 minuten in een incubatiekast bij 37 graden Celsius. Gebruik in de biohood een steriele breed-boorgasoverdrachtpijp om al het medium en weefsel over te brengen naar een steriele cryogene buis van vijf milliliter.

Plaats de punt van dezelfde overdrachtspijp dicht bij de bodem van de buis en chitteer het mengsel voorzichtig 10 tot 15 keer. Voeg vervolgens twee milliliter verwarmde DMEM 5/5 toe aan het gedissocieerde celmengsel en sluit de centrifugeerbuis. Meng voorzichtig door omkering en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 573 keer g op kamertemperatuur.

In de biohood, gooit u al het supernatant weg zonder de pallet te breken. Voeg vervolgens een milliliter verwarmde DMEM 5/5 toe aan de pallet in de buis om de cellen op te schorsen. Gebruik een steriele small-bore overdrachtspijp om de pallet te breken door voorzichtig op en neer te pipetten totdat het mengsel homogeen is.

Breng vervolgens 10 microliter van de celsuspensie over naar een microcentrifugebuis. Voeg buiten de biohood 10 microliter trypanblauw toe aan de 10 microliter celsuspensie in de microcentrifugebuis. Laad vervolgens 10 microliter van de trypanblauwcelsuspensie op een wegwerphemocytometerchip om de cellen te tellen.

Gebruik in de biohood een steriele micropipet om 50 microliter celsuspensie over te brengen naar het centrum van elke array en elke controle-Petrischaal. Plaats vervolgens de bedektPetrischalen in een incubatiekast ingesteld op 37 graden Celsius gedurende drie tot vier uur. Voeg vervolgens voorzichtig een milliliter verwarmde DMEM 5/5 toe aan elke MEA.

Voeg voorzichtig het medium toe, één druppel per keer rond de binnenranden van de MEA, en vermijd het wegwassen van