Tijdafhankelijke toename in het netwerkrespons bij de stimulatie van neuronale celculturen op micro-elektrode arrays

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren en associëren van neuronaal weefsel van E17-muizen, om neuronale netwerken te kunnen kweken, registreren en stimuleren op micro-elektrodenarrays. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen bij de studie van netwerkdynamiek, in relatie tot de basismechanismen van leren en geheugen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat micro-elektrodenarrays gelijktijdig registraties kunnen maken op meerdere locaties en daarom een betere ruimtelijke en temporele resolutie kunnen bieden in vergelijking met de meer traditionele glazen pipet voor registratie op een enkele locatie.

Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de netwerkdynamiek van leren en geheugen, kan deze ook worden gebruikt om drugstoxiciteit te onderzoeken of paradigma's te ontwerpen voor gepersonaliseerde geneeskunde van de volgende generatie. Een visuele demonstratie van dit proces is essentieel, aangezien de manipulatie van het weefsel tijdens het dissectie- en dissociatieproces moeilijk te leren is door enkel het lezen van protocollen. Om de array voor te bereiden, voegt u met steriele pipetpunten 40 tot 50 µL ontdooide laminine toe aan het midden van elke MEA, en 0,2 mL laminine aan de controleplaten.

Dek alle MEA's en de controleschalen in de biologische veiligheidskabinet af en plaats ze gedurende één uur in een incubator bij 37 graden Celsius. Verwijder na één uur voorzichtig het overtollige laminine uit het centrum van de MEA's door middel van aspiratie met steriele Pasteurpipetten, en laat het oppervlak aan de lucht drogen voordat het uitplaten plaatsvindt. Giet vervolgens L-15 medium in vier Petri-schalen van 100 millimeter, dek ze af en plaats ze gedurende ongeveer 40 tot 60 minuten in een vriezer bij minus 20 graden Celsius, totdat het medium een slush-consistentie heeft, maar niet volledig is bevroren.

Ter voorbereiding op de dissectie plaatst u een glazen Petrischaal met de opening naar beneden in een bak met ijs. Bespuit vervolgens de onderbuik van de dieren met 70% ethanol. Maak met een kleine chirurgische schaar een V-vormige incisie door de huid en het subcutane vet van de onderbuik, waarbij u de snede uitbreidt tot aan de distale uiteinden van de borstholte om de uterus bloot te leggen.

Til de uterus met een pincet voorzichtig tussen de embryo's uit. Knip het bindweefsel met dissectiescharen weg totdat de gehele uterus is vrijgemaakt. Spoel de uterus vervolgens kort af met 70% ethanol om bloed te verwijderen en plaats deze in een van de vier Petrischalen gevuld met koud L-15.

Bevrijd vervolgens elk embryo uit de baarmoeder en de binnenste embryonale zak met behulp van twee paren fijngepunte pincetten. Plaats de bevrijde embryo's in de tweede schaal met koud L-15, breng vervolgens de koppen over naar de derde Petrischaal en de lichamen naar de vierde.

Plaats vervolgens de snijkant van het onderste blad van de irisschaar in de basis van de schedel. Houd het onderste blad tegen het binnenoppervlak van de schedel en weg van de hersenen, knip door de occipitale plaat en vervolgens langs de middenlijn tussen de pariëtale platen. Ga door met knippen in rostrale richting tussen de kraakbenige frontale schedelplaten. Maak vervolgens, beginnend vanuit het midden van de occipitale plaat, een loodrechte snede naar links en naar rechts van de middelste snede.

Schuif daarna voorzichtig een kleine spatel tussen het ventrale oppervlak van de hersenen en de onderste schedelplaten, totdat deze volledig onder de hersenen ligt. Til vervolgens de spatel op om de hersenen te verwijderen. Verwijder eerst de bulbus olfactorius met een schone spatel en ontleed daarna de frontale kwab in een trapeziumvormig patroon.

Breng vervolgens het weefsel over naar een centrifugebuis van 15 milliliter die bewaarmedium bevat. Gebruik bij deze procedure twee steriele scalpellames om het weefsel fijn te hakken. Voeg daarna 2,5 milliliter van het Dnase papain-mengsel toe aan het fijngehakte weefsel in de Petrischaal.

Wrijf voorzichtig met de Petrischaal om zodat al het weefsel vrij in de oplossing komt en niet aan de bodem van de schaal kleeft. Plaats de schaal vervolgens gedurende 15 minuten in een incubator bij 37 °C. Gebruik in de biohood een steriele transferpipet met een wijde opening om al het medium en het weefsel over te brengen naar een steriele cryogene buis van 5 mL.

Plaats de punt van dezelfde transferpipet dicht bij de bodem van de buis en pipetteer het mengsel voorzichtig 10 tot 15 keer op en neer. Voeg vervolgens twee milliliters verwarmd DMEM 5/5 toe aan het mengsel van gedissocieerde cellen en sluit de centrifugebuis met de dop. Meng het geheel voorzichtig door inversie en centrifugeer dit gedurende vijf minuten bij 573 ×g bij kamertemperatuur.

Verwijder in de biologische veiligheidskast al het supernatant zonder de pellet te verstoren. Voeg vervolgens één milliliter voorverwarmd DMEM 5/5 toe aan de pellet in de buis om de cellen te resuspenderen. Gebruik een steriele transferpipet met een kleine opening om de pellet op te lossen door voorzichtig op en neer te pipetteren totdat het mengsel homogeen is.

Breng vervolgens 10 µL van de cel-suspensie over naar een microcentrifugebuisje. Voeg buiten de biologische veiligheidskast 10 µL trypaanblauw toe aan de 10 µL cel-suspensie in het microcentrifugebuisje. Laad vervolgens 10 µL van de trypaanblauwe cel-suspensie op een wegwerp-hemocytometerchip om de cellen te tellen.

Gebruik in de steriele werkbank een steriele micropipet om 50 µL cel-suspensie over te brengen naar het centrum van elke array en naar elke controle-petrischaal. Plaats de afgedekte petrischalen vervolgens in een incubator ingesteld op 37 °C gedurende drie tot vier uur. Voeg daarna voorzichtig 1 mL opgewarmd DMEM 5/5 toe aan elke MEA.

Voeg het medium voorzichtig druppel voor druppel toe langs de binnenranden van de MEA, en voorkom dat de cellen uit het centrum van het array worden weggespoeld. Plaats vervolgens op elke MEA een dop met een gasdoorlatend FEP-membraan voordat ze terug in de incubator worden geplaatst. Voer na twee dagen een volledige mediumverversing uit met voorverwarmd DMEM+ door het medium uit de schaal af te zuigen.

Plaats de punt van de pipet voorzichtig tegen de binnenwand en voeg 1 mL opgewarmd DMEM+ toe. Trek voor de daaropvolgende voedingen 500 µL medium uit de schaal en voeg opnieuw 500 µL opgewarmd DMEM+ toe. Inspecteer bij deze procedure de monster-schalen om de dag onder een microscoop om te controleren op de celbedekking over de array en op contaminatie door bacteriën of schimmels. Sluit de temperatuurregelaar aan en zet het systeem aan voordat de culturen uit de incubator worden gehaald, zodat de verwarmde basisplaat van de voorversterker 35 °C kan bereiken.

Plaats vervolgens de afgedekte cultuur in de voorversterker, zodat de zwarte lijn in de MEA-well is uitgelijnd met de referentiemassa. Zorg ervoor dat de pinnen van de voorversterker zodanig zijn uitgelijnd dat de bovenkant van de voorversterker is vastgezet en de dop van de cultuur nog op zijn plaats zit. Druk vervolgens in de softwareomgeving op start om de signalen te visualiseren.

Selecteer in het hoofdvenster Spikes, Detection, Automatic, wijzig de waarde van de standaarddeviatie naar min vijf, en klik op Refresh om de drempelwaarde opnieuw in te stellen. Nadat de signalen zijn gevisualiseerd, klikt u op Stop, Record en Play om met het registreren van de activiteit te beginnen. Embryonale muizneuronen worden geplaatst op 60-kanaals MEA's, die de gelijktijdige registratie van de neuronale activiteit over het netwerk vanuit elke elektrode mogelijk maken.

Hier is een representatieve rasterplot van de activiteit van acht elektroden als reactie op stimulatie vóór en na de training. De verticale rode lijn geeft het tijdstip van de stimulus aan en de zwarte streepjes geven actiepotentialen aan. Vóór de training is er in alle kanalen een onmiddellijke reactie op de stimuluspuls.

Na de training vertoont het netwerk een meer langdurige activiteitsrespons, naast de onmiddellijke respons op de stimulatie. Hier wordt het gemiddelde getoond van 12 getrainde en 10 controle-netwerken; de getrainde netwerken vertonen significant gewijzigde spike-frequenties. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u neuronaal weefsel van embryonale muizen kunt isoleren en associëren, en in staat moeten zijn om neuronale netwerken op micro-elektrode-arrays te kweken, te registreren en te stimuleren.