Name: Tijdafhankelijke toename in het netwerkrespons bij de stimulatie van neuronale celculturen op micro-elektrode arrays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Leer hoe je neuronale netwerken van E17 muizenweefsel kweekt en stimuleert op micro-elektrode arrays. Deze methode biedt betere ruimtelijke en temporele resolutie voor het bestuderen van leer- en geheugendynamica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gefinancierd door de National Science Foundation subsidie ​​CMMI-1300007. We willen graag eerdere lableden, die hebben geholpen bij het ontwerpen van deze protocollen, en met de instandhouding van de culturen al meer dan vijf jaar bij de George Mason University hebben geholpen: Dr. J. J. Pancrazio, Dr. Hamid Charkhkar, Dr. Gretchen Knaack , Dr. Franz Hamilton, Michael Maquera, en Robert Graham.

<ol><li>Charkhkar, H., Frewin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+cortical+neuronal+networks+for+in+vitro+material+biocompatibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Use of cortical neuronal networks for in vitro material biocompatibility testing.</a> Biosens Bioelectron. 53, 316-323 (2014).</li>
<li>Bologna, L. L., Nieus, T., Tedesco, M., Chiappalone, M., Benfenati, F., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-frequency+stimulation+enhances+burst+activity+in+cortical+cultures+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Low-frequency stimulation enhances burst activity in cortical cultures during development.</a> Neuroscience. 165 (3), 692-704 (2010).</li>
<li>Fröhlich, F., McCormick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+electric+fields+may+guide+neocortical+network+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Endogenous electric fields may guide neocortical network activity.</a> Neuron. 67 (1), 129-143 (2010).</li>
<li>Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephaptic+coupling+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ephaptic coupling of cortical neurons.</a> Nature Neurosci. 14 (2), 217-223 (2011).</li>
<li>Ozen, S., Sirota, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+electric+stimulation+entrains+cortical+neuronal+populations+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transcranial electric stimulation entrains cortical neuronal populations in rats.</a> J. Neurosci. 30 (34), 11476-11485 (2010).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+bursting+in+cortical+cultures+with+closed-loop+multi-electrode+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation.</a> J. Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).</li>
<li>Shahaf, G., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Learning in networks of cortical neurons.</a> J. Neurosci. 21 (22), 8782-8788 (2001).</li>
<li>Marom, S., Shahaf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%2C+learning+and+memory+in+large+random+networks+of+cortical+neurons%3A+lessons+beyond+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Q+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Development, learning and memory in large random networks of cortical neurons: lessons beyond anatomy.</a> Q Rev Biophys. 35 (1), 63-87 (2002).</li>
<li>Marom, S., Eytan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+in+ex-vivo+developing+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Learning in ex-vivo developing networks of cortical neurons.</a> Prog Brain Res. 147, 189-199 (2005).</li>
<li>Li, Y., Zhou, W., Li, X., Zeng, S., Luo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+learning+in+cultured+neuronal+networks+with+antagonists+of+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamics of learning in cultured neuronal networks with antagonists of glutamate receptors.</a> Biophys. J. 93 (12), 4151-4158 (2007).</li>
<li>Li, Y., Zhou, W., Li, X., Zeng, S., Liu, M., Luo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+synchronized+bursts+in+cultured+hippocampal+neuronal+networks+with+learning+training+on+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Characterization of synchronized bursts in cultured hippocampal neuronal networks with learning training on microelectrode arrays.</a> Biosens Bioelectron. 22 (12), 2976-2982 (2007).</li>
<li>Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+plasticity+in+cortical+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Network plasticity in cortical assemblies.</a> Eur. J. Neurosci. 28 (1), 221-237 (2008).</li>
<li>le Feber, J., Stegenga, J., Rutten, W. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+slow+electrical+stimuli+to+achieve+learning+in+cultured+networks+of+rat+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The effect of slow electrical stimuli to achieve learning in cultured networks of rat cortical neurons.</a> PloS one. 5 (1), 8871(2010).</li>
<li>Ruaro, M. E., Bonifazi, P., Torre, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+neurocomputer%3A+image+processing+and+pattern+recognition+with+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Toward the neurocomputer: image processing and pattern recognition with neuronal cultures.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 52 (3), 371-383 (2005).</li>
<li>Hamilton, F., Graham, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-Dependent+Increase+in+Network+Response+to+Stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Time-Dependent Increase in Network Response to Stimulation.</a> PloS one. 10 (11), 0142399(2015).</li>
<li>Guidelines for Euthanasia of Rodents Using Carbon Dioxide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://oacu.oir.nih.gov/sites/default/files/uploads/arac-guidelines/rodent_euthanasia_adult.pdf">https://oacu.oir.nih.gov/sites/default/files/uploads/arac-guidelines/rodent_euthanasia_adult.pdf</a> (2016).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="https://mitpress.mit.edu/books/culturing-nerve-cells">Culturing Nerve Cells: Business Source</a>. , MIT Press. Cambridge. (1998).</li>
<li>Gullo, F., Maffezzoli, A., Dossi, E., Wanke, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-latency+cross-and+autocorrelation+identify+clusters+of+interacting+cortical+neurons+recorded+from+multi-electrode+array%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Short-latency cross-and autocorrelation identify clusters of interacting cortical neurons recorded from multi-electrode array.</a> J. Neurosci. Methods. 181, 186-198 (2009).</li>
<li>Eytan, D., Brenner, N., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Adaptation+in+Networks+of+Cortical+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective Adaptation in Networks of Cortical Neurons.</a> J. Neurosci. 23 (28), (2003).</li>
<li>Bonifazi, P., Ruaro, M. E., Torre, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+properties+of+information+processing+in+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Statistical properties of information processing in neuronal networks.</a> Eur. J. Neurosci. 22 (11), 2953-2964 (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De stappen die in dit protocol zijn beschreven, geven voldoende informatie voor de beginner om zijn / haar eigen neuronale culturen op MEA&#39;s te platen en om netwerkactiviteit op te nemen. Dit protocol zal helpen om ervoor te zorgen dat de culturen goed aansluiten, een tapijtlaag van cellen vormen over de elektrode-arrays, en gedurende enkele maanden gezond en verontreinigd blijven. Hoewel het het beste is om aan alle delen van het protocol te voldoen, zijn er stappen in het proces die kritiek zijn op het succesvolle resultaat. Het gebruik van aseptische techniek door het gehele proces is essentieel om te voorkomen dat de culturen besmet raken. Nieuwe MEA&#39;s moeten hydrofiel worden gemaakt, zoals beschreven in het protocol, of anders zal een slechte celhechting ontstaan. Het vermijden van harde pipettering en de vorming van luchtbellen tijdens dissociatie zullen het aantal beschadigde cellen verminderen en zal leiden tot een hogere en gezondere opbrengst. Overschakelen van DMEM 5/5 naar DMEM + na de eersteVoeding is ook belangrijk. DMEM 5/5 bevat paardserum, waardoor glialcellen de cultuur zullen domineren als ze continu worden gebruikt en resulteren in slechte neuronale activiteit, hoewel de culturen gezond zullen blijken 17 . Voeding van de culturen zoals gepland en in goede incubatie omstandigheden te houden is ook van cruciaal belang. Plating van celculturen op MEA&#39;s omvat veel variabelen die kunnen leiden tot minder dan optimale resultaten. Hoewel het doel een perfect &quot;tapijt&quot; van cellen is, zal het niet voldoen aan de bovengenoemde kritische stappen resulteren in slechte celmaturatie of in vervuiling. Slechte celhechting, die verschilt van arme celmaturatie, is ook een zorg. Dit kan worden veroorzaakt door een aantal factoren, waaronder een slechte MEA-voorbereiding voorafgaand aan plating of het gebruik van oud medium. Als oud medium dat een gestabiliseerde vorm van L-glutamine en serumvrij supplement voor neurale celcultuur bevat (zie Materialtabel) Wordt gebruikt, hechten de cellen aanvankelijk maar dan na ongeveer twee weken weg. Als bacteriële besmetting een aanhoudend probleem is, kan een antibioticum, zoals ampicilline of pen-streep, aan het medium worden toegevoegd. Er zijn ook fungiciden beschikbaar om schimmelinfectie te behandelen. Dit zijn enkele van de meest voorkomende variabelen die het resultaat van de culturen kunnen beïnvloeden. Er zijn veel anderen die alleen na tijd en ervaring worden geconfronteerd. In vergelijking met het gebruik van glasmicro-elektroden is deze techniek uitstekend voor het bestuderen van netwerkdynamiek en farmacologische reacties. Het maakt het mogelijk om veel verschillende spatio-temporale stimulatiepatronen te gebruiken en zorgt tegelijk voor het opnemen van neuronale responsen uit meerdere gebieden. Vorige groepen hebben interessante resultaten laten zien met behulp van protocollen die vergelijkbaar zijn met die welke hier worden beschreven 18 . Aangezien de culturen voor weken of maanden duren en dezelfde culturen kunnen worden hergebruikt, deze techniek ook eenLijkt op meerdere experimenten in de loop der tijd op hetzelfde netwerk. Er zijn echter beperkingen voor deze techniek. MEA&#39;s zijn niet-invasieve. Daarom kunnen ze alleen extracellulaire activiteit opnemen, in tegenstelling tot patch-klemmen of intracellulaire opname met pipetten. Bovendien, aangezien elke elektrode in een matrix door meerdere cellen is bedekt, is het niet mogelijk om de activiteit van een enkele neuron op te lossen. Omgekeerd, omdat deze in vitro culturen zijn, kunnen ze de structurele eigenschappen van netwerken in de hersenen niet volledig reproduceren. Ook kan de activiteit slechts minder dan 30 minuten per keer worden opgenomen, zonder dat er een mechanisme is dat een CO 2 -atmosfeer biedt voor de cellen om hun pH-balans te handhaven. Zodra deze techniek wordt beheerd, kunnen farmacologische manipulaties met of zonder elektrische stimulatie worden onderzocht. Nieuwe protocollen om leer- en geheugenvorming in neuronale netwerken te onderzoeken kunnen ook worden ontworpen en getest, samen met pRotocolken voor hippocampale of ruggengraat netwerken. Protocollen voor het stimuleren en trainen van netwerken zijn eerder gepubliceerd, en sommige daarvan werden verder ontwikkeld tot in vivo protocollen, zoals de &quot;selectieve aanpassing&quot; die door Eytan et al werd voorgesteld . 19 . Verscheidene protocollen werden getest. Echter, alleen resultaten van een wijziging van de tetanusprocedure die Ruaro in 2005 voorstelde, worden hier 14 , 20 weergegeven.

Micro-elektrode arrays (MEA&#39;s) kunnen worden gebruikt om de toxiciteit van geneesmiddelen te onderzoeken, ontwerpparadigma&#39;s voor de volgende generatie gepersonaliseerde medicijnen te onderzoeken en de netwerkdynamiek in neuronale culturen te bestuderen 1 . In tegenstelling tot meer traditionele methoden, zoals patch-klemmen, die alleen de activiteit van een enkele cel kunnen registreren of veldopname met een glaspipet, die extracellulaire reacties opneemt van de neuronen die de elektrode omringen op een enkele plaats, kunnen MEA tegelijkertijd Opnemen van meerdere plaatsen in een celcultuur zonder dat de moeilijke taak nodig is om elke elektrode afzonderlijk te plaatsen. Dit zorgt voor de studie van de dynamische interacties tussen groepen cellen die een netwerk vormen binnen die cultuur. Bovendien zijn de effecten van elektrische stimulatie op netwerkbrandpatronen 2 , 3 , 4 , 5 en netwerkcontrole 6 &lt;/ Sup&gt; in neuronale culturen zijn goed gedocumenteerd en talrijke configuraties van elektrische stimulatie en controles kunnen gemakkelijk worden toegepast binnen dezelfde experimentele opstelling, waardoor een breed scala aan spatio-temporale dynamiek kan worden onderzocht. Een van de belangrijkste dynamieken van belangstelling in deze in vitro studies is in hoeverre gekweekte netwerken eigenschappen tonen die indicatief zijn voor het leren van 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . De Peixoto Lab heeft eerder de effecten van hoogfrequente trainingssignalen onderzocht, zoals beschreven in Ruaro et al. 14 , op netwerken van muisneuronen geplateerd op micro-elektrode arrays 15 . In deze experimenten vertoonden netwerken een toename van de responsvolgordeG training geïnduceerd door elektrische stimulatie. De verhoogde respons werd beschouwd als een vorm van leren via stimulusherkenning, waarbij de netwerken op een consistente manier reageren op een verandering in stimulus na de toepassing van een specifiek stimulatieprogramma ( dat wil zeggen training). Dit protocol demonstreert hoe u neuronale cellen op MEA&#39;s kunt cultiveren, succesvol opnemen van meer dan 95% van de platte schotels, een protocol opstellen om de netwerken op te leiden om stimuleringspatronen te reageren, de activiteit van een eenheid te plannen, histogrammen te plotten en de resultaten te interpreteren Dergelijke experimenten. Het gebruik van een eigen systeem (zie de Tabel van Materialen ) voor de stimulatie en opname van neuronale culturen wordt aangetoond, evenals de toepassing van softwarepakketten (zie de Tabel van Materialen ) om neuroneenheden te sorteren. Een custom-designed grafische gebruikersinterface (zie de tabel van materialen ) wordt gebruikt om post-s te visualiserenTimulus tijd histogrammen, inter-burst intervallen en burst duration, evenals het vergelijken van de cellulaire respons op stimulatie voor en na een trainingsprotocol.

<table><tbody><tr><td>Ascorbic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4403</td><td>Maak 4 mg/mL aliquoten</td></tr><tr><td>B-27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>Serum-vrij supplement voor neurale celcultuur. Maak 1 mL aliquoten en vries in</td></tr><tr><td>Bekers - glas - 100 mL</td><td>VWR</td><td>13912-160</td><td></td></tr><tr><td>Bekers - glas - 500 mL</td><td>VWR</td><td>10754-956</td><td></td></tr><tr><td>Blunt-tipped thumb forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>500365-G</td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic vial - steriele, 2 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-500-26</td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic vial - steriele, 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-500-27</td><td></td></tr><tr><td>DMEM met Glutamax</td><td>Gibco Life Technology</td><td>10569-010</td><td>Celcultuurmedium dat een gestabiliseerde vorm van L-glutamine bevat</td></tr><tr><td>DNase</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003172</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2030</td><td></td></tr><tr><td>Fine-tipped thumb forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>501324-G</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pipets</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX -- I (100X)</td><td>Gibco Life Technology</td><td>35050-061</td><td>Een gestabiliseerde vorm van L-glutamine gebruikt als supplement</td></tr><tr><td>Hemocytometer chip</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-600-101</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate EB compleet</td><td>BrainBits</td><td>D00118</td><td>Ambient CO2 celopslagmedium</td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12195H</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>MCS filter versterker</td><td>MultiChannel System</td><td>FA60SBC</td><td></td></tr><tr><td>MCS hoofdtrap/voorversterker</td><td>MultiChannel System</td><td>MEA1060-INV</td><td></td></tr><tr><td>MCS microelektrodenarray</td><td>MultiChannel System</td><td>60MEA200/10iR-ITO</td><td></td></tr><tr><td>MCS voeding</td><td>MultiChannel System</td><td>PS20W</td><td></td></tr><tr><td>MCS signaaloverbrenging</td><td>MultiChannel System</td><td>SDMEA</td><td></td></tr><tr><td>MCS stimulusgenerator</td><td>MultiChannel System</td><td>STG4002</td><td></td></tr><tr><td>MCS temperatuurregelaar</td><td>MultiChannel System</td><td>TC02</td><td></td></tr><tr><td>Mediaopslagfles - glas 500 mL</td><td>VWR</td><td>10754-818</td><td>Autoclave</td></tr><tr><td>Microcentrifugebuizen - 0,4 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>3485</td><td>Autoclave</td></tr><tr><td>Microcentrifugebuizen - 2 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>3434ECONO</td><td>Autoclave</td></tr><tr><td>Micropipetpunten - 10 µL</td><td>VWR</td><td>37001-166</td><td>Autoclave</td></tr><tr><td>Micropipetpunten - 1.000 µL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>13503-464</td><td>Autoclave</td></tr><tr><td>Micropipetpunten - 200 µL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>37001-596</td><td>Autoclave</td></tr><tr><td>Micropipettor - 10 µL&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>4641170N</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor - 1.000 µL&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>4641210N</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor - 200 µL&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>4641230N</td><td></td></tr><tr><td>Papain - 0,22 Gefilterd</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003178</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine (Pen Strep)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen -100 mm wegwerpbaar</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen -100 mm glas</td><td>VWR</td><td>10754-788</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen -35 mm&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat bufferoplossing (PBS) (1x)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Plasmareinigingssysteem</td><td>Plasma Etch, Inc.</td><td>PE-50</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide (PDL)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleen conische (centrifuge) buis -15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-527-90</td><td></td></tr><tr><td>Polypropyleen conische (centrifuge) buis -50 mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Proceduremaskers</td><td>Imco</td><td>1530-imc</td><td></td></tr><tr><td>Pyrozwavelzuur</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4562-5G</td><td></td></tr><tr><td>Scalpelmesjes</td><td>World Precision Instruments</td><td>&nbsp;500237-G</td><td></td></tr><tr><td>Schaar - iris</td><td>World Precision Instruments</td><td>14111-G</td><td></td></tr><tr><td>Schaar - groot</td><td>World Precision Instruments</td><td>14214</td><td></td></tr><tr><td>Schaar - klein chirurgisch</td><td>World Precision Instruments</td><td>&nbsp;501733-G</td><td></td></tr><tr><td>Serologische pipet - steriele, 1 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-892</td><td></td></tr><tr><td>Serologische pipet - steriele, 2 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-894</td><td></td></tr><tr><td>Serologische pipet - steriele, 25 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-900</td><td></td></tr><tr><td>Serologische pipet - steriele, 50 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-902</td><td></td></tr><tr><td>Software: Matlab GUI</td><td>Peixoto Lab</td><td>npeixoto@gmu.edu</td><td>Gebruikt om.mat-bestanden te analyseren.&nbsp; Beschikbaar gratis op aanvraag.&nbsp; Neem contact op met npeixoto@gmu.edu om een kopie aan te vragen.</td></tr><tr><td>Software: MCS MC_Rack</td><td>MultiChannel System</td><td>N/A</td><td>Gebruikt voor dataverwerving</td></tr><tr><td>Software: NeuroExplorer</td><td>Plexon&nbsp;</td><td>http://www.plexon.com/products/neuroexplorer</td><td>Gebruikt om.nex-bestanden om te zetten naar.mat</td></tr><tr><td>Software: Offline Sorter</td><td>Plexon&nbsp;</td><td>http://www.plexon.com/products/offline-sorter</td><td>Gebruikt om neurale spikes te sorteren en databestanden om te zetten naar.plx en vervolgens naar.nex</td></tr><tr><td>Softwarehandleiding: MCS MC_Rack</td><td>MultiChannel System</td><td></td><td>https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual

tijdafhankelijke toename in het netwerkrespons bij de stimulatie van neuronale celculturen op micro-elektrode arrays

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-elektrode arrays (MEA&#39;s) kunnen worden gebruikt om de toxiciteit van geneesmiddelen te onderzoeken, ontwerpparadigma&#39;s voor de volgende generatie gepersonaliseerde medicijnen te onderzoeken en de netwerkdynamiek in neuronale culturen te bestuderen. In tegenstelling tot meer traditionele methoden, zoals patch-klemmen, die alleen de activiteit van een enkele cel kunnen opnemen, kunnen MEA&#39;s tegelijkertijd op meerdere locaties in een netwerk opnemen, zonder dat het nodig is om elke elektrode afzonderlijk te plaatsen. Bovendien kunnen talrijke controle- en stimulatieconfiguraties gemakkelijk worden toegepast binnen dezelfde experimentele opstelling, waardoor een breed scala aan dynamieken kan worden onderzocht. Een van de belangrijkste dynamieken van belangstelling in deze in vitro studies is in hoeverre gekweekte netwerken eigenschappen aanwijzen die indicatief zijn voor het leren. Muis-neuronale cellen die op MEA&#39;s zijn gekweekt, tonen een toename van de respons na training die wordt geïnduceerd door elektrische stimulatie. Dit protocol demonstreert hoe u neuronale cellen op MEA&#39;s kunt cultiveren; Succesvol reKoord van meer dan 95% van de platte schotels; Een protocol opstellen om de netwerken op te leiden om te reageren op stimuleringspatronen; En sorteer, plot en interpreteer de resultaten van dergelijke experimenten. Het gebruik van een eigen systeem voor het stimuleren en registreren van neuronale culturen wordt aangetoond. Softwarepakketten worden ook gebruikt om neuroneenheden te sorteren. Een custom-designed grafische gebruikersinterface wordt gebruikt om post-stimulus tijd histogrammen, inter-burst intervallen en burst duration te visualiseren, evenals de cellulaire respons op stimulatie voor en na een trainingsprotocol te vergelijken. Tenslotte worden representatieve resultaten en toekomstige aanwijzingen van deze onderzoeksinspanning besproken.

Muisneuronale cellen die op multi-elektrode arrays worden gekweekt, tonen een toename van de respons na elektrische stimulatie. Dit protocol demonstreert hoe u neuronen kunt cultiveren, hoe u activiteiten opneemt en hoe u een protocol kunt opstellen om de netwerken op te leiden om te reageren op stimuleringspatronen.

Tijdafhankelijke toename in het netwerkrespons bij de stimulatie van neuronale celculturen op micro-elektrode arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren en associëren van neuronaal weefsel van E17-muizen, om neuronale netwerken te kunnen kweken, registreren en stimuleren op micro-elektrodenarrays. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen bij de studie van netwerkdynamiek, in relatie tot de basismechanismen van leren en geheugen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat micro-elektrodenarrays gelijktijdig registraties kunnen maken op meerdere locaties en daarom een betere ruimtelijke en temporele resolutie kunnen bieden in vergelijking met de meer traditionele glazen pipet voor registratie op een enkele locatie.Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de netwerkdynamiek van leren en geheugen, kan deze ook worden gebruikt om drugstoxiciteit te onderzoeken of paradigma's te ontwerpen voor gepersonaliseerde geneeskunde van de volgende generatie. Een visuele demonstratie van dit proces is essentieel, aangezien de manipulatie van het weefsel tijdens het dissectie- en dissociatieproces moeilijk te leren is door enkel het lezen van protocollen. Om de array voor te bereiden, voegt u met steriele pipetpunten 40 tot 50 µL ontdooide laminine toe aan het midden van elke MEA, en 0,2 mL laminine aan de controleplaten.Dek alle MEA's en de controleschalen in de biologische veiligheidskabinet af en plaats ze gedurende één uur in een incubator bij 37 graden Celsius. Verwijder na één uur voorzichtig het overtollige laminine uit het centrum van de MEA's door middel van aspiratie met steriele Pasteurpipetten, en laat het oppervlak aan de lucht drogen voordat het uitplaten plaatsvindt. Giet vervolgens L-15 medium in vier Petri-schalen van 100 millimeter, dek ze af en plaats ze gedurende ongeveer 40 tot 60 minuten in een vriezer bij minus 20 graden Celsius, totdat het medium een slush-consistentie heeft, maar niet volledig is bevroren.Ter voorbereiding op de dissectie plaatst u een glazen Petrischaal met de opening naar beneden in een bak met ijs. Bespuit vervolgens de onderbuik van de dieren met 70% ethanol. Maak met een kleine chirurgische schaar een V-vormige incisie door de huid en het subcutane vet van de onderbuik, waarbij u de snede uitbreidt tot aan de distale uiteinden van de borstholte om de uterus bloot te leggen.Til de uterus met een pincet voorzichtig tussen de embryo's uit. Knip het bindweefsel met dissectiescharen weg totdat de gehele uterus is vrijgemaakt. Spoel de uterus vervolgens kort af met 70% ethanol om bloed te verwijderen en plaats deze in een van de vier Petrischalen gevuld met koud L-15.Bevrijd vervolgens elk embryo uit de baarmoeder en de binnenste embryonale zak met behulp van twee paren fijngepunte pincetten. Plaats de bevrijde embryo's in de tweede schaal met koud L-15, breng vervolgens de koppen over naar de derde Petrischaal en de lichamen naar de vierde.Plaats vervolgens de snijkant van het onderste blad van de irisschaar in de basis van de schedel. Houd het onderste blad tegen het binnenoppervlak van de schedel en weg van de hersenen, knip door de occipitale plaat en vervolgens langs de middenlijn tussen de pariëtale platen. Ga door met knippen in rostrale richting tussen de kraakbenige frontale schedelplaten. Maak vervolgens, beginnend vanuit het midden van de occipitale plaat, een loodrechte snede naar links en naar rechts van de middelste snede.Schuif daarna voorzichtig een kleine spatel tussen het ventrale oppervlak van de hersenen en de onderste schedelplaten, totdat deze volledig onder de hersenen ligt. Til vervolgens de spatel op om de hersenen te verwijderen. Verwijder eerst de bulbus olfactorius met een schone spatel en ontleed daarna de frontale kwab in een trapeziumvormig patroon.Breng vervolgens het weefsel over naar een centrifugebuis van 15 milliliter die bewaarmedium bevat. Gebruik bij deze procedure twee steriele scalpellames om het weefsel fijn te hakken. Voeg daarna 2,5 milliliter van het Dnase papain-mengsel toe aan het fijngehakte weefsel in de Petrischaal.Wrijf voorzichtig met de Petrischaal om zodat al het weefsel vrij in de oplossing komt en niet aan de bodem van de schaal kleeft. Plaats de schaal vervolgens gedurende 15 minuten in een incubator bij 37 °C. Gebruik in de biohood een steriele transferpipet met een wijde opening om al het medium en het weefsel over te brengen naar een steriele cryogene buis van 5 mL.Plaats de punt van dezelfde transferpipet dicht bij de bodem van de buis en pipetteer het mengsel voorzichtig 10 tot 15 keer op en neer. Voeg vervolgens twee milliliters verwarmd DMEM 5/5 toe aan het mengsel van gedissocieerde cellen en sluit de centrifugebuis met de dop. Meng het geheel voorzichtig door inversie en centrifugeer dit gedurende vijf minuten bij 573 ×g bij kamertemperatuur.Verwijder in de biologische veiligheidskast al het supernatant zonder de pellet te verstoren. Voeg vervolgens één milliliter voorverwarmd DMEM 5/5 toe aan de pellet in de buis om de cellen te resuspenderen. Gebruik een steriele transferpipet met een kleine opening om de pellet op te lossen door voorzichtig op en neer te pipetteren totdat het mengsel homogeen is.Breng vervolgens 10 µL van de cel-suspensie over naar een microcentrifugebuisje. Voeg buiten de biologische veiligheidskast 10 µL trypaanblauw toe aan de 10 µL cel-suspensie in het microcentrifugebuisje. Laad vervolgens 10 µL van de trypaanblauwe cel-suspensie op een wegwerp-hemocytometerchip om de cellen te tellen.Gebruik in de steriele werkbank een steriele micropipet om 50 µL cel-suspensie over te brengen naar het centrum van elke array en naar elke controle-petrischaal. Plaats de afgedekte petrischalen vervolgens in een incubator ingesteld op 37 °C gedurende drie tot vier uur. Voeg daarna voorzichtig 1 mL opgewarmd DMEM 5/5 toe aan elke MEA.Voeg het medium voorzichtig druppel voor druppel toe langs de binnenranden van de MEA, en voorkom dat de cellen uit het centrum van het array worden weggespoeld. Plaats vervolgens op elke MEA een dop met een gasdoorlatend FEP-membraan voordat ze terug in de incubator worden geplaatst. Voer na twee dagen een volledige mediumverversing uit met voorverwarmd DMEM+ door het medium uit de schaal af te zuigen.Plaats de punt van de pipet voorzichtig tegen de binnenwand en voeg 1 mL opgewarmd DMEM+ toe. Trek voor de daaropvolgende voedingen 500 µL medium uit de schaal en voeg opnieuw 500 µL opgewarmd DMEM+ toe. Inspecteer bij deze procedure de monster-schalen om de dag onder een microscoop om te controleren op de celbedekking over de array en op contaminatie door bacteriën of schimmels. Sluit de temperatuurregelaar aan en zet het systeem aan voordat de culturen uit de incubator worden gehaald, zodat de verwarmde basisplaat van de voorversterker 35 °C kan bereiken.Plaats vervolgens de afgedekte cultuur in de voorversterker, zodat de zwarte lijn in de MEA-well is uitgelijnd met de referentiemassa. Zorg ervoor dat de pinnen van de voorversterker zodanig zijn uitgelijnd dat de bovenkant van de voorversterker is vastgezet en de dop van de cultuur nog op zijn plaats zit. Druk vervolgens in de softwareomgeving op start om de signalen te visualiseren.Selecteer in het hoofdvenster Spikes, Detection, Automatic, wijzig de waarde van de standaarddeviatie naar min vijf, en klik op Refresh om de drempelwaarde opnieuw in te stellen. Nadat de signalen zijn gevisualiseerd, klikt u op Stop, Record en Play om met het registreren van de activiteit te beginnen. Embryonale muizneuronen worden geplaatst op 60-kanaals MEA's, die de gelijktijdige registratie van de neuronale activiteit over het netwerk vanuit elke elektrode mogelijk maken.Hier is een representatieve rasterplot van de activiteit van acht elektroden als reactie op stimulatie vóór en na de training. De verticale rode lijn geeft het tijdstip van de stimulus aan en de zwarte streepjes geven actiepotentialen aan. Vóór de training is er in alle kanalen een onmiddellijke reactie op de stimuluspuls.Na de training vertoont het netwerk een meer langdurige activiteitsrespons, naast de onmiddellijke respons op de stimulatie. Hier wordt het gemiddelde getoond van 12 getrainde en 10 controle-netwerken; de getrainde netwerken vertonen significant gewijzigde spike-frequenties. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u neuronaal weefsel van embryonale muizen kunt isoleren en associëren, en in staat moeten zijn om neuronale netwerken op micro-elektrode-arrays te kweken, te registreren en te stimuleren.

time-dependent-increase-network-response-to-stimulation-neuronal-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit protocol biedt de nodige informatie voor het opzetten, zorg voor, opname van en elektrisch stimuleren van culturen op MMO's.

Hoe te Cultuur, Record en het stimuleren van neuronale netwerken op de Micro-elektrode arrays (MEA&#39;s)

Een krachtige manier om de neuronale lawines, dat wil zeggen schaal-invariant spatio-temporele activiteit uitbarstingen, indicatief van kritieke toestand dynamiek in cortex te bestuderen. Lawines ontstaan ​​spontaan in de ontwikkeling van oppervlakkige lagen van gekweekte hersenschors, die voor de lange termijn metingen van de activiteit mogelijk maakt met vlakke geïntegreerde multi-elektrode arrays (MEA) onder nauwkeurig gecontroleerde omstandigheden.

Multi-electrode array Opnamen van neuronale Lawines in organotypische culturen

The video demonstrates how to use a microelectrode array (MEA) to record the electrophysiological activity of neurons derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Electrophysiological activity from a multiwell MEA containing a neuron-astrocyte co-culture is recorded to detect action potentials from multiple neurons in the network, confirming the successful differentiation of hiPSCs into neurons.

Measuring the Electrophysiological Activity of Neuronal Networks Using Micro-Electrode Arrays

This video demonstrates the procedure of using the multielectrode array (MEA) to measure synaptic physiology in 3D coculture spheres. This method allows to understand the neural network dynamics and synaptic network burst activity within the 3D spheres.

Utilizing Multielectrode Arrays to Measure Synaptic Physiology in 3D Coculture Spheres

In dit werk wordt een nieuw experimenteel model gepresenteerd waarin 3D neuronale culturen gekoppeld zijn aan vlakke Micro-Elektrode Array's (MEA's). 3D netwerken worden gebouwd door neuronen te zaaien in een schaal gemaakt van glazen microbeads waarop neuronen groeien en onderling verbonden 3D structuren vormen.

Interfacing 3D Engineered neuronale culturen op micro-elektrode arrays: een innovatieve<em&gt; In Vitro</em&gt; Experimental Model

We presenteren een protocol om primaire murine spiraalvormige ganglion neuron explantaten te kweken op multi-elektrode arrays om neuronale responsprofielen te bestuderen en stimulatieparameters te optimaliseren. Dergelijke studies zijn gericht op het verbeteren van de neuron-elektrode interface van cochleaire implantaten om het gehoor bij patiënten te verbeteren evenals het energieverbruik van het apparaat.

Spiraal Ganglion Neuron Explantatie Cultuur en elektrofysiologie op Multi Electrode Arrays

Blootstelling aan milieu-toxines kan acuut ontwikkelende embryo's beïnvloeden. Hormoonontregelende chemische stoffen zoals Bisfenol is bekend dat een nadelige invloed op het zenuwstelsel. Hier beschrijven we een protocol met behulp van een in vitro gewerveld dier (chick embryo) neuronale netwerkmodel te bestuderen van de functionele gevolgen van toxine blootstelling op vroege embryo's.

Beoordeling van de effecten van hormoonontregelende stoffen op de ontwikkeling van de gewervelde neuraal netwerkfunctie met behulp van meerdere elektrode Arrays

Dit protocol heeft tot doel om aan te tonen hoe te in vitro micro-elektrode-arrays combineren met microfluidic apparaten voor het bestuderen van de actiepotentiaal transmissie in neuronale culturen. Data-analyse, namelijk de opsporing en karakterisering van teeltmateriaal van de actie potentieel, is uitgevoerd met behulp van een nieuwe geavanceerde, nog gebruikersvriendelijk en vrij beschikbaar zijn, computationele gereedschap.

Interfacing Microfluidics met micro-elektrode Arrays voor het bestuderen van de neuronale communicatie- en axonale signaal vermeerdering

Dit artikel bevat een set van protocollen voor de ontwikkeling van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide hartspier (hipsc-cm) netwerken gekweekt op multi well mea platen om reversibel elektroporate de celmembraan voor actie potentiële metingen. Opnamen met hoge doorvoer worden via dezelfde cellocaties herhaaldelijk over dagen verkregen.

Humane iPSC-afgeleide cardiomyocyte netwerken op multi well micro-elektrode arrays voor terugkerende actie potentiële opnames

3D-printen op micrometerschaal maakt snelle prototyping mogelijk van polymere apparaten voor neuronale celculturen. Als proof-of-principle werden structurele verbindingen tussen neuronen beperkt door barrières en kanalen te creëren die de uitgroei van neurieten beïnvloedden, terwijl de functionele gevolgen van dergelijke manipulatie werden waargenomen door extracellulaire elektrofysiologie.

Twee-foton polymerisatie 3D-printen van neuronale celkweekapparaten op microschaal

Dit protocol heeft tot doel dorsaal-ventrale gefuseerde assembloids stabiel te plaatsen op multi-elektrode-arrays voor het modelleren van epilepsie in vitro.

Een multi-elektrode array platform voor het modelleren van epilepsie met behulp van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide hersenassemboïden

Leer hoe je neuronale netwerken van E17 muizenweefsel kweekt en stimuleert op micro-elektrode arrays. Deze methode biedt betere ruimtelijke en temporele resolutie voor het bestuderen van leer- en geheugendynamica.

Tijdafhankelijke toename in het netwerkrespons bij de stimulatie van neuronale celculturen op micro-elektrode arrays

Meer video's verkennen