Kwantificering van buikpigmentatie in Drosophila melanogaster
1 juni 2017
Dit werk biedt een methode om de abdominale pigmentatie van Drosophila melanogaster snel en nauwkeurig te kwantificeren met behulp van digitale beeldanalyse . Deze methode stroomlijnt de procedures tussen fenotype-acquisitie en data-analyse en omvat voorbeeldmontage, beeldverzameling, pixelwaarde-extractie en eigenschappen van eigenschappen.
Het algemene doel van deze methodologie is om de abdominale pigmentatie in de fruitvlieg Drosophila melanogaster snel te kwantificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van evolutionaire biologie, zoals het identificeren van de genetische loci die ten grondslag liggen aan trustspecifieke variatie in morfologie en het begrijpen van de ontwikkeling en evolutie van morfologische fenotipen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het gebruikers in staat stelt om niet-destructief verschillende aspecten van abdominale pigmentatie te meten, inclusief de verspreiding en diepte van pigmentatie.
Hoewel deze methode inzicht kan geven in de abdominale pigmentatie van Drosophila melanogaster, kan deze ook worden toegepast op andere Drosophila-soorten en gemakkelijk worden aangepast om pigmentatiepatronen bij andere insecten en diertaxonomieën te meten. Voorafgaand aan het beeldvormen kunnen de vliegen in 70% ethanol worden bewaard om hun pigmentatie te behouden. Visualisatie vereist een montagepad.
Laad een 60 millimeter Petri-schaal met ongeveer 10 milliliter 1,25% agar in water. Gebruik onder een microscoop een fijne pincet om een 20 millimeter lange, twee millimeter brede, één millimeter diepe greppel in de gel te graven. Er kunnen meerdere greppels in één schaal worden gemaakt.
Plaats vervolgens vliegen in de greppel met het te analyseren oppervlak net boven het geloppervlak. In dit geval is de dorsale zijde van belang. Vul nu de schaal met 70% ethanol totdat de vliegen volledig ondergedompeld zijn.
Dit vermindert reflecties van de cuticula die het pigmentatiepatroon kunnen verbergen. Start nu de beeldvormingssoftware en de digitale camera die op de microscoop is aangesloten. Voor een lichtbron is koud licht van een dubbele gooseneck-apparaat voldoende.
Stel in de beeldanalysesoftware het beeldtype in op 8-bit. Zet vervolgens in de beeldopnamesoftware de Live-instelling om een weergavevenster van de camera te openen. Stel het beeldtype in op grijswaarden.
Stel nu de lichtbron op zijn maximale intensiteit en plaats de lampen op ongeveer 120 millimeter van het podium. Stel de microscoop in op 60 keer vergroting zodat het gezichtsveld drie millimeter breed is. Plaats vervolgens de twee millimeter podiummicrometer in het gezichtsveld en focus erop.
Keer terug naar de software, pas de belichtingstijd aan om de micrometer te bekijken met behulp van het veld in het belichtingsvak. Stel vervolgens de schaal in. Open de gereedschapsbalk met rechte lijnen en teken de lengte van twee millimeter langs de podiummicrometer.
Voer vervolgens die lengte in onder de optie Schaal instellen. Het venster moet dan de schaal weergeven in pixels per micron. Let op de schaal en bevestig de aanpassingen met OK.
Keer nu terug naar de beeldopnamesoftware en gebruik de commando's Stop en Snap om een afbeelding van de podiummicrometer vast te leggen. Keer vervolgens terug naar de beeldanalysesoftware en sla de afbeelding op als een Tiff-bestand. Focus nu op de dorsale middenlijn van een gemonteerde vlieg.
De middenlijn moet recht omhoog staan voor de beste beeldresultaten. Schuif de vleugels en andere uitsteeksels opzij en pas de verlichting aan om de cuticula het beste te verlichten. Stel vervolgens de belichting in de beeldopnamesoftware in met behulp van de pixelwaardehistogram als richtlijn om het volledige pixelbereik van het beeld vast te leggen zonder verzadiging, waardoor het contrast wordt gemaximaliseerd.
Behoud deze belichting en verlichting gedurende het hele experiment. Zorg er nu voor, voordat u een afbeelding vastlegt, dat de abdominale segmenten van belang in beeld zijn. Leg vervolgens een afbeelding vast en sla de afbeelding op met het monster-ID-nummer in de bestandsnaam.
Gebruik het formaat dat in het schriftelijke protocol is beschreven. Deze analyse maakt gebruik van een macro die door de auteurs is geleverd. De beeldserie voor analyse moet allemaal in dezelfde map staan.
Start nu de macro en volg de aangegeven opdrachten. Identificeer eerst de locatie van de opgeslagen bestanden. Identificeer vervolgens de locatie waar de analysegegevens moeten worden opgeslagen.
Voer vervolgens het aantal tekens in dat in de bestandsnamen is gebruikt, zodat de software de beeldserie correct leest. De volgende prompt is voor de breedte van het gebied van belang. Voer hier het aantal pixels in langs de anterieur-posterieure strook die moet worden geanalyseerd.
Kies nu bij de prompt om de eerste afbeelding van de serie te analyseren. De andere opties zijn om de volgende afbeelding in de serie te analyseren of om de analyse te beëindigen. Het lijngereedschap wordt automatisch geselecteerd.
Gebruik het om de middenlijn op de afbeelding te identificeren door een lijn langs deze in de anterieure tot posterieure richting te tekenen. Volg vervolgens de macro-prompts om de posterieure rand van Tergite4 te identificeren met behulp van het lijngereedschap. Het lijngereedschap is beschikbaar om de lijn vanaf de posterieure middenlijnrand naar de rechterlaterale rand te tekenen, zodat het midden van de lijn net posterieur aan de posterieure rand van de pigmentband zit.
Definieer vervolgens de anterieure rand van Tergite4 met behulp van het lijngereedschap. Teken een lijn vanaf de anterieure middenlijnrand naar de rechterlaterale rand. Het midden van de lijn gedefinieerd door een wit vierkant moet op de anterieure rand van de licht gepigmenteerde cuticula zitten.
Met deze informatie genereert de macro nu een pigmentatieprofiel. Het profiel kan echter onnauwkeurig zijn als borstelharen of andere onzuiverheden de strook kruisen langs waar het profiel wordt gemeten. Selecteer om dit te corrigeren de Live-voorvertoning op het histogramvenster en pas de lijn aan zodat het profiel glad is.
Voor de beeldanalysestrook om de verschillende aspecten van pigmentatie nauwkeurig vast te leggen, is het essentieel om een analysegebied te identificeren dat minimale ruis veroorzaakt door beeld- of monsterstoringen. Ga nu verder met het analyseren van Tergite3 in dezelfde afbeelding en ga vervolgens verder met de volgende afbeelding. De beschreven procedure werd gebruikt om een bekende verandering in abdominale pigmentatie te onderzoeken die wordt veroorzaakt door de temperatuur waarbij de vliegen zijn grootgebracht.
De derde en vierde tergieten werden meerdere
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit werk presenteert een methode om de abdominale pigmentatie van Drosophila melanogaster snel en nauwkeurig te kwantificeren met behulp van digitale beeldanalyse. Deze techniek maakt niet-destructieve meting van de verspreiding en diepte van de pigmentatie mogelijk, wat inzicht biedt in de evolutionaire biologie.
Belangrijkste Onderzoeksonderdelen
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Evolutionaire biologie
- Genetica
Achtergrond
- Drosophila melanogaster is een modelorganisme in genetica- en evolutiestudies.
- Inzicht in pigmentatie kan genetische loci onthullen die gerelateerd zijn aan morfologische variatie.
- Niet-destructieve beeldvormingstechnieken zijn essentieel voor een nauwkeurige fenotypeanalyse.
- Voorafgaande bewaring in 70% ethanol helpt de pigmentatie te behouden voor beeldvorming.
Doel van de studie
- Om een snelle methode te ontwikkelen voor het kwantificeren van abdominale pigmentatie.
- Om de studie van genetische en evolutionaire vraagstukken bij Drosophila te vergemakkelijken.
- Om een techniek aan te bieden die toepasbaar is op andere Drosophila-soorten en insecten.
Gebruikte methoden
- Digitale beeldanalyse voor het kwantificeren van pigmentatie.
- Bevestiging van het specimen op een visualisatiepad.
- Beeldverwerving en extractie van pixelwaarden.
- Meting van pigmentatiekenmerken.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt een nauwkeurige kwantificering van pigmentatiekenmerken mogelijk.
- Het stroomlijnt het proces van fenotypeverwerving tot data-analyse.
- De resultaten kunnen worden gebruikt voor studies naar morfologische evolutie.
- De techniek is aanpasbaar voor gebruik in diverse insectentaxa.
Conclusies
- Deze methodologie verbetert de studie van abdominale pigmentatie bij Drosophila.
- Het biedt een kader voor toekomstig onderzoek in de evolutionaire biologie.
- De aanpak kan worden uitgebreid naar andere soorten en morfologische kenmerken.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Kwantitatieve fenotypische analyse maakt een nauwkeurige meting van morfologische kenmerken mogelijk, wat targetvalidatie en mechanische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase ondersteunt. Deze methode biedt reproduceerbare en schaalbare data-extractie voor pigmentatiepatronen, wat crossfunctionele samenwerking en voorspellende betrouwbaarheid in genotype-fenotype studies faciliteert. De aanpasbaarheid over verschillende insectentaxa verbetert de translationele continuïteit en de relevantie van de portfolio in fenotypische screening-workflows.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om genetische loci die ten grondslag liggen aan morfologische variatie te onderzoeken via kwantitatieve meting van kenmerken.
- Operationele waarde: Biedt niet-destructieve, high-throughput beeldvorming die compatibel is met genetische screening-pipelines.
- Strategische waarde: Ondersteunt hypothesetoetsing voor ontwikkelingspaden die de fenotypische expressie beïnvloeden.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde, kwantitatieve resultaten voor pigmentatie-intensiteit en bandbreedte over verschillende specimens.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van open-source softwaremacro's voor consistente data-extractie over verschillende imagingsystemen.
- Strategische waarde: Maakt assay-gereedheid mogelijk voor het screenen van genetische modifiers van pigmentatiepaden.
Translationeel en preklinisch onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert systeemmodellering die relevant is voor ziekten door adaptieve morfologische kenmerken te kwantificeren.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid tussen laboratoria door gestandaardiseerde protocollen voor montage en beeldvorming.
- Strategische waarde: Ondersteunt risicogebaseerde beslissingen voor verdere ontwikkeling door genotype te correleren met meetbare fenotypische output.
Integratie van Pijplijn en Workflow
De methode kan worden geïntegreerd in workflows voor discovery biology door kwantitatieve keneksanalyse mogelijk te maken na genetische perturbatie of omgevingsmodulatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van pathways via nauwkeurige morfologische kwantificering.
- Screening: Zorgt voor assay-standaardisatie en reproduceerbare kwantitatieve resultaten voor de evaluatie van verbindingen of genetische modifiers.
- Analytics: Biedt pixelgebaseerde metingen en statistische outputs voor het vergelijken van fenotypische distributies.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit via meetbare, evolutionair relevante kenmerken.
- Enterprise hergebruik: Functioneert als een herbruikbaar imaging- en analyseplatform voor diverse morfologische screeningapplicaties.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid van genotype-fenotype-relaties door objectieve, kwantificeerbare meting van kenmerken.
- Operationele waarde: Hoge reproduceerbaarheid en schaalbaarheid, met beeldvorming van 50 specimens/uur en analyse van 70 beelden/uur.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen door verminderde ambiguïteit bij de fenotypische beoordeling.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering van genetische targets mogelijk met behulp van kwantitatieve fenotypische drempels.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van Drosophila, microscopie en software voor beeldanalyse.
- Afhankelijk van gestandaardiseerde verlichting, vergroting en schaalkalibratie voor nauwkeurige metingen.
- Noodzaak tot naleving van het protocol door alle teams voor consistente montage van preparaten en opslag in ethanol.
- Overwegingen bij aanpassing omvatten het aanpassen van de breedte van het interessegebied (region-of-interest) voor verschillende soorten of weefseltypen.
- Praktische beperkingen omvatten gevoeligheid voor ruis door borstelharen of onregelmatigheden in het preparaat, waardoor handmatige profielcorrectie noodzakelijk is.
