Gepersonaliseerde naalden voor Microinjections in de hersenen knaagdier

Het algemene doel van deze methodologie is het verfijnen van een protocol voor hersenmicroinjectie met behulp van gepersonaliseerde, herbruikbare kwartznaalden die geen detecteerbare weefselschade veroorzaken en een betrouwbare toediening garanderen, zelfs in diepe regio's. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het vakgebied van de neurowetenschappen, zoals de pathofysiologie van neurodegeneratieve en psychiatrische aandoeningen en de effecten van gen- en celtherapie via virale vectoren en celtransplantaten. Het belangrijkste voordeel is dat deze naalden geen detecteerbare weefselschade veroorzaken, wat een betrouwbare toediening in diepe hersenregio's waarborgt.

Ze zijn kosteneffectief omdat ze gereinigd en hergebruikt kunnen worden. Om deze procedure te starten, worden de kwartscapillairen gereinigd en gesteriliseerd door ze vijf minuten in gedestilleerd water te plaatsen. Daarna volgen vijf minuten in 99% ethanol, gevolgd door vijf minuten in diethylether.

Laat de capillairen vervolgens gedurende ten minste één uur onder de zuigkap staan om volledig te drogen. Bereid in de tussentijd de lange en dunne naalden voor met behulp van een laserpuller. Plaats de naalden vervolgens in een petrischaal die vooraf is gereinigd met 70% ethanol.

Dek de schaal af met een plastic paraffinefolie. Snijd vervolgens de capillairen door met de microdissector. Bevestig de naald stevig op de microscooplaboratastand en positioneer de tip in het midden van het computerscherm.

Klik op de menubalk op het potloodicoon en gebruik dit om een markering te tekenen voor de plek waar de naald moet worden gesneden. Selecteer in de zijbalkfunctie het tabblad met de knop 'Start Cut' om de laser de eerder gemarkeerde plek te laten snijden. Indien nodig kunnen de zijgaten worden gesneden door een markering te tekenen en de snijprocedures te herhalen zonder de naald opnieuw te positioneren.

Sluit de naald na het afsnijden via een plastic slang aan op een vacuümpomp. Zet vervolgens de pomp aan en stel de voorwaartse stroomsnelheid handmatig in op 3 µL per minuut. Aspireer daarna 99% ethanol gevolgd door gedestilleerd water om onzuiverheden als gevolg van het snijden te verwijderen.

Zuig daarna de 99% ethanol opnieuw af om het drogen te vergemakkelijken. Bewaar de naalden vervolgens in een goed afgesloten petrischaal tot de dag van de operatie. Om de naalden opnieuw te gebruiken, moeten ze aan het einde van het experiment worden gereinigd met de geschikte detergentia en 70% ethanol om de geïnjecteerde oplossing en eventuele weefselresten te verwijderen.

Indien nodig kunnen deze naalden zelfs worden gekookt in speciale glazen potten gevuld met gedestilleerd water. Selecteer in deze stap het instellingsmenu om de pomp te kalibreren op basis van de diameter per volume van de microinjectiespuit. Stel de stroomsnelheid in op 0,3 µL per minuut.

Vul vervolgens een spuit van 10 milliliter met steriel water. Gebruik deze om de micro-injectiespuit en de onderdelenkit van de injectie-assemblage voor de handmatige micro-injectiepomp te vullen. Sluit daarna de naald aan op de kit van de handmatige micro-injectiepomp.

Koppel de spuit van 10 milliliter los van de micro-injectiespuit terwijl u de zuiger langzaam indrukt, om zo een druppel water aan de bovenzijde van de micro-injectiespuit achter te laten. Plaats vervolgens de zuiger in de micro-injectiespuit. Sluit nu de micro-injectiespuit aan op de pomp en stel de stroomsnelheid in op 0,3 microliters per minuut.

Verander vervolgens de stroomsnelheid naar 0,1 microliters per minuut en begin met de chirurgische procedure. Om de operatie uit te voeren, scheert u de kop van het dier en maakt u deze schoon met een alcoholdoekje. Plaats daarna de rat in het stereotaxische frame.

Maak met een gesteriliseerd scalpel een longitudinale snede over de schedel. Doe dit voorzichtig om overmatig bloeden te voorkomen. Open vervolgens de hoofdhuid met een platte spatel en bevestig chirurgische klemmen aan de huidflappen om deze open te houden.

Detach zeer voorzichtig het periosteum om het bregma en het gebied van de schedel waar de naald zal worden ingebracht, bloot te leggen. Monteer vervolgens de arm op het stereotaxische frame en beweeg de punt van de naald direct boven het bregma, waarbij u erop let dat de punt niet afbreekt. Noteer de anteroposterieure en medio-laterale coördinaten van het bregma en beweeg de naald naar de gewenste coördinaten.

Laat de naald vervolgens zakken tot de punt de schedel bijna raakt, en markeer de boorlocatie nadat de stereotaxische arm een klein beetje is omhooggehaald. Boor op de gemarkeerde plek in de schedel, waarbij u er voorzichtig op let de meninges en de hersenen niet te beschadigen. Snijd daarna een klein stukje plastic paraffinefolie af en plaats dit op de schedel.

Gebruik de 10 µL pipet om een druppel van de oplossing aan te brengen op de plastic paraffinefolie. Stop de pomp, trek de plunjer van de pomp iets terug en creëer een kleine luchtbel in de capillaire door de zuiger van de micro-injectiespuit voorzichtig naar achteren te trekken. Laat de naaldpunt zakken tot deze de druppel bereikt.

Zuig de monsteropname op door de zuiger van de microinjectiespuit zeer langzaam naar achteren te trekken, waarbij belvorming moet worden vermeden. Plaats de pompduwer opnieuw in contact met de zuiger en schakel de pomp in bij een stroomsnelheid van 0,3 microliters per minuut. Wacht vervolgens tot er een druppel is gevormd voordat u overgaat naar de volgende stap.

Verlaag daarna de stroomsnelheid naar 0,1 microliters per minuut. Maak een inkeping in de dura met een schuine naald van roestvrij staal en breng de naald langzaam naar beneden om in het hersenweefsel door te dringen. Zodra de gewenste positie is bereikt, gaat u nog 0,1 millimeter verder naar beneden en stopt u vervolgens de pomp.

Verhoog de stereotactische arm met 0,1 millimeters en start de pomp opnieuw op 0,3 microliters per minuut. Start daarna de timer en de injectie. Houd de beweging van de luchtbel tijdens het injecteren in de gaten.

Stop aan het einde de pomp en wacht vijf minuten voordat u de naald langzaam terugtrekt. Wanneer de kwartsnaald volledig is geëxtraheerd, start u de pomp opnieuw en controleert u of er een druppel aan de punt van de naald wordt gevormd. Seal vervolgens de opening in het schederoppervlak met botwas.

Verwijder de homeostatische klemmen en hecht de hoofdhuid. Smeer het gebied rondom de wond in met een antibiotische crème en plaats het dier terug in de thuiskooi. Dit zijn de coronale doorsneden van acht micrometer van de rattenhersenen op het niveau van het striatum.

Deze afbeelding toont de schade veroorzaakt door de injectie van twee microliters ACSF, met gebruik van een stomp-geëinde roestvrijstalen naald van 26 gauge. Omgekeerd vertoonde het striatum dat met een kwartznaald was geïnjecteerd, geen detecteerbare schade. Deze overige afbeeldingen tonen de schade veroorzaakt door de twee naalden op het niveau van de dorsale hippocampus.

De kwartsnaald veroorzaakte echter geen detecteerbare schade. Succesvolle injecties met beide naalden werden aangetoond door de verspreiding van Trypan blue. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in twee uur worden uitgevoerd, mits deze correct wordt uitgevoerd.

Na het volgen van deze procedures kunnen alle relevante vervolgstappen, zoals aanvullende chirurgische ingrepen, worden uitgevoerd om verschillende vragen te beantwoorden, zoals het effect van geneesmiddelen. Na deze ontwikkeling heeft deze techniek onderzoekers op het gebied van neurowetenschappen de weg vrijgemaakt om het effect van toxines en geneesmiddelen en, meer recentelijk, gen- en celtherapieproducten in diermodellen te onderzoeken. Na het bekijken van deze video moet u een goed begrip hebben van hoe u micro-injecties in dieper gelegen hersengebieden kunt uitvoeren zonder detecteerbare laesies met behulp van gepersonaliseerde kwartznaalden.

Vergeet niet dat het gebruik van laser-gedissecteerde reagentia en/of pathogenen uiterst gevaarlijk kan zijn. Er moeten altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals laserveiligheidsprocedures en het gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen, bij het uitvoeren van deze procedure.