Atoomschaal structurele Studies van macromoleculaire samenstellen door Solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie
September 17th, 2017
Structuren van supramoleculaire eiwit samenstellingen met atomaire resolutie zijn van groot belang vanwege hun cruciale rol in een verscheidenheid van biologische fenomenen. Hierin presenteren wij een protocol voor het uitvoeren van high-resolution structurele studies op onoplosbare en niet-kristallijne macromoleculaire eiwit samenstellen door magie-angle spinning solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (MAS SSNMR).
Het algemene doel van dit protocol is om de structuren van onoplosbare en niet-kristallijne supramoleculaire eiwitassemblages te bestuderen met atomaire resolutie door middel van magneethoek draaiende vaste toestand NMR-spectroscopie. We zullen de essentiële methodologische stappen presenteren voor het bestuderen van atomaire structuren van biomoleculaire eiwitassemblages door vaste toestand NMR. Het bestuderen van atomaire structuren van deze assemblages is uiterst uitdagend omdat ze inherent onoplosbaar en niet-kristallijn zijn.
Vaste toestand NMR is een opkomende techniek die in staat is om moleculaire structuur en dynamica met atomaire resolutie te bestuderen zonder beperkt te worden door de grootte van het geassembleerde object of door de oplosbaarheid. We illustreren hier de belangrijkste stappen om atomaire structuren van biomoleculaire eiwitassemblages te visualiseren door middel van vaste toestand NMR, inclusief de bereiding van isotopisch gelabelde monsters, het verzamelen en de analyse van structurele gegevens uit vaste toestand NMR. De eerste stap in een vaste toestand NMR-workflow is de productie van C13 N15 gelabelde eiwitsubeenheden en hun in vitro assemblage.
Inoculeer een 15 mil voorcultuur van voorverwarmd LB-medium met een kolonie getransformeerde E.coli-cellen. Incubeer bij 37 graden Celsius met 200 RPM schuddend gedurende de nacht. Om de hoofdcultuur te inoculeren, breng de volledige voorcultuur over in één liter voorverwarmd N9-medium dat noodzakelijke isotopisch gelabelde bronnen van koolstof en stikstof bevat.
Deze kunnen N15 gelabeld ammoniumchloride, uniform C13 gelabelde glucose, selectief C13 gelabelde glucose of selectief C13 gelabeld glycerol omvatten. Incubeer bij 37 graden en meet de optische dichtheid bij 600 nanometer zodra de cultuur troebel wordt. Wanneer de OD een waarde van 0,8 heeft bereikt, induceer eiwitexpressie met een 0,75 minimolair IPTG gedurende vier uur. Merk op dat optimale inductiecondities kunnen variëren van het ene eiwit tot het andere.
Herstel de cellen door centrifugatie gedurende 30 minuten bij 6.000 G en vier graden. Na zuivering van de eiwitsubeenheden worden ze in vitro geassembleerd. Concentreer het eiwit tot ongeveer een minimolair in een centrifugaal filtereenheid.
Om dit te doen, breng het monster in de filtereenheid en centrifugeer bij 4.000 G gedurende 30 minuten. Meng tussen centrifugatiestapjes voorzichtig de oplossing in de filtereenheid met een pipet om eiwitafzetting aan het filtermembraan te voorkomen. Herhaal de procedure tot de gewenste concentratie is bereikt.
Breng het monster over in een falconbuis en incubeer onder agitatie gedurende een week bij kamertemperatuur. Gewoonlijk gaat de polymerisatie van de subeenheden in filamenten gepaard met het troebel worden van de oplossing. Voeg 0,02% gewicht per volume natriumazid toe om bacteriële contaminatie te voorkomen.
Om de eiwitassemblage te oogsten, centrifugeer het monster gedurende een uur bij 20.000 G en vier graden. Zuig de meerderheid van het supernatant af en laat slechts genoeg vloeistof over om het oppervlak te bedekken om uitdroging van het monster te voorkomen, en bewaar het monster bij vier graden tot meting. We zullen de essentiële experimenten presenteren voor een structurele analyse door middel van vaste toestand NMR.
Eendimensionaal cross polarisatie, of CP, en inept experimenten gedetecteerd op C13 kernen worden gebruikt om stijve en flexibele eiwitsegmenten in de assemblage te detecteren, respectievelijk. En om de mate van structurele homogeniteit en lokale polymorfisme te schatten. Hier gebruiken we standaard experimentele waarden.
Typische parameterbereiken worden aangegeven in het protocol. Plaats de rota in de NMR-magneet en start de magneethoek draaiende zoals beschreven in het protocol. Stel de gewenste draaisnelheid in en zorg voor stabilisatie binnen plus of min 10 hertz.
Neem een enkel puls, eendimensionaal protonenspectrum op met behulp van 16 scans. Stel een 1D proton koolstof CP op. CP experimenten tonen de signalen die afkomstig zijn van residuen in een stijve conformatie. De initiële experimentparameters worden genomen uit een standaard optimalisatieprocedure op een referentiecompound.
Pulskalibratie en ontkoppelingsparameters kunnen worden geoptimaliseerd in het monster wanneer de gevoeligheid hoog genoeg is. Hier nemen we een CP op met 16 scans. CP-contacttijd en vermogensniveaus worden gekozen op basis van maximale signaalintensiteit, zoals hier gedemonstreerd voor de optimalisatie van de CP-contacttijd.
De maximale intensiteit in dit voorbeeld wordt bereikt bij 800 milliseconden. De ontkoppelingsparameters moeten ook worden aangepast van die oorspronkelijk ingesteld vanuit de kalibratie van de referentiecompound. Let tenslotte zorgvuldig op de lokalisatie van draaiende zijbanden bij de gegeven magneethoek draaiende frequentie, hier getoond bij 18 kilohertz, om overlapping met het signaal te voorkomen.
Neem een referentie 1D proton koolstof CP-spectrum op dat dient als een eendimensionaal spectraal vingerafdruk. Hier accumuleren we 128 scans met 800 milliseconden CP-contacttijd, 100 kilohertz ontkoppelingssterkte, een recycleervertraging van drie seconden en een acquisitietijd van 20 milliseconden. Verwerk het CP-experiment zonder apathi-zation.
Kies een geïsoleerde piek om de C39 binnen het monster te schatten, indicatief voor structurele orde en homogeniteit. Hier is de lijnbreedte, gemeten als de volledige breedte op halfhoogte, ongeveer 60 tot 70 hertz, indicatief voor een goed geordende eiwitstructuur in de assemblage. Stel een eendimensionaal proton koolstof inept experiment op om naar zeer mobiele delen van de eiwitassemblage te onderzoeken.
Neem een referentie inept experiment op om te dienen als vingerafdruk voor de mobiele eiwitsegmenten. Typische parameters zijn 128 scans en een acquisitietijd van 25 milliseconden. Verwerk het proton koolstof inept experiment.
Het aantal signalen en hun posities zijn indicatief voor de mate van residuemobiliteit en de samenstelling van aminozuren, respectievelijk. Hier wordt alleen signaal van de twist buffer CH2 merit-y waargenomen omdat het hele eiwit zich in een stijve regime in de assemblagestructuur bevindt. Conformatiele analyse van de eiwitstructuur is gebaseerd op de vaste toestand NMR resonantietoewijzingen voor alle stijve residuen van de assemblage.
Dit is mogelijk gemaakt omdat chemische verschuivingen zeer gevo
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het bestuderen van de structuren van onoplosbare en niet-kristallijne supramoleculaire eiwitassemblages met atoomresolutie met behulp van magic-angle spinning vaste-toestand nucleaire magnetische resonantiespectroscopie (MAS SSNMR). De methode gaat in op de uitdagingen die worden gesteld door de inherente onoplosbaarheid en niet-kristallijne aard van deze assemblages.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Structurele biologie
- Biochemie
- Nucleaire magnetische resonantiespectroscopie
Achtergrond
- Supramoleculaire eiwitassemblages spelen cruciale rollen in verschillende biologische fenomenen.
- Het bestuderen van hun structuren is essentieel voor het begrijpen van hun functies.
- Vaste-toestand NMR is een krachtige techniek voor het analyseren van deze structuren.
- Uitdagingen omvatten de onoplosbaarheid en niet-kristallijne aard van de assemblages.
Doel van het onderzoek
- Een gedetailleerd protocol bieden voor hoogwaardige structurele studies van eiwitassemblages.
- De belangrijkste methodologische stappen in vaste-toestand NMR te illustreren.
- Onderzoekers in staat te stellen atoomstructuren van biomoleculaire assemblages te visualiseren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van isotopisch gelabelde eiwitmonsters.
- In vitro assemblage van eiwitsubeenheden.
- Magic-angle spinning vaste-toestand NMR spectroscopie.
- Gegevensverzameling en analyse met behulp van standaard experimentele parameters.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van atoomstructuren van eiwitassemblages.
- Identificatie van stijve en flexibele segmenten binnen de assemblages.
- Schatting van structurele homogeniteit en lokaal polymorfisme.
- Demonstratie van de effectiviteit van vaste-toestand NMR bij het bestuderen van complexe eiwitstructuren.
Conclusies
- Het protocol maakt gedetailleerde structurele analyse van uitdagende eiwitassemblages mogelijk.
- Vaste-toestand NMR is een haalbare methode voor het bestuderen van onoplosbare en niet-kristallijne eiwitten.
- Toekomstige toepassingen kunnen ons begrip van eiwitfunctie en -interacties verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Magic-angle spinning solid-state NMR (SSNMR) enables atomic-scale structural elucidation of insoluble, non-crystalline macromolecular assemblies that are inaccessible to traditional structural biology techniques. This capability addresses a critical gap in early discovery and target validation for complex protein assemblies implicated in disease mechanisms. Integrating SSNMR-derived atomic insights enhances predictive confidence and de-risks portfolio decisions for biologics and modality innovation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables atomic-resolution interrogation of supramolecular protein assembly mechanisms relevant to disease pathways.
- Supports functional target validation by revealing structural order, homogeneity, and conformational states.
- Facilitates mechanistic de-risking for assemblies involved in neurodegeneration, infection, or host-pathogen interactions.
- Provides structural benchmarks for triaging targets with limited solubility or crystallinity.
Screening & Assay Development
- Delivers validated spectral fingerprints for rigid and flexible protein segments, supporting assay standardization.
- Enables reproducible detection of structural homogeneity and local polymorphism in complex assemblies.
- Prepares robust, isotope-labeled systems for downstream screening and compound evaluation workflows.
- Supports platform scalability for diverse macromolecular targets beyond soluble proteins.
Translational & Preclinical Research
- Aligns atomic-level structural data with disease-relevant assembly states for translational biomarker development.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation for insoluble or aggregated targets.
- De-risks advancement of biologics by providing direct evidence of assembly architecture and interface contacts.
- Enables integration with complementary structural biology methods for comprehensive 3D modeling.
Pipeline & Workflow Integration
SSNMR integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling atomic-scale structure determination of assemblies that are refractory to X-ray or solution NMR analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for insoluble protein complexes.
- Screening: Provides reproducible, quantitative spectral outputs for assay readiness and system validation.
- Analytics: Delivers chemical shift assignments, distance restraints, and conformational fingerprints for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges atomic structure to disease-relevant assembly states, informing biomarker and therapeutic strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for structural interrogation of diverse macromolecular assemblies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity for complex targets.
- Operational Value: Standardizes workflows for insoluble assemblies, enhancing reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk for novel modalities.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of challenging biologic targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in isotope labeling, sample preparation, and advanced NMR spectroscopy.
- Demands access to high-field NMR instrumentation and specialized analytical software.
- Necessitates cross-team standardization of labeling schemes and spectral analysis protocols.
- Adaptation across different protein assemblies may require optimization of labeling and acquisition parameters.
- Interpretation of intermolecular restraints can be complex and may require selective labeling strategies.
