Atoomschaal structurele Studies van macromoleculaire samenstellen door Solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie

Het algemene doel van dit protocol is om de structuren van onoplosbare en niet-kristallijne supramoleculaire eiwitcomplexen op atomair niveau te bestuderen met behulp van magic angle spinning solid-state NMR-spectroscopie. Wij presenteren de essentiële methodologische stappen voor het bestuderen van atomaire structuren van biomoleculaire eiwitcomplexen via solid-state NMR. Het bestuderen van de atomaire structuren van deze complexen is uiterst uitdagend omdat ze inherent onoplosbaar en niet-kristallijn zijn.

Solid-state NMR is een opkomende techniek waarmee moleculaire structuur en dynamiek op atomair niveau kunnen worden bestudeerd, zonder beperkt te worden door de grootte van het geassembleerde object of door de oplosbaarheid ervan. We illustreren hier de belangrijkste stappen om atomaire structuren van biomoleculaire eiwitcomplexen te visualiseren met solid-state NMR, inclusief de bereiding van isotopisch gelabelde monsters, de verzameling en de analyse van structurele gegevens uit solid-state NMR. De eerste stap in een solid-state NMR-workflow is de productie van C13 N15 gelabelde eiwitsubeenheden en hun in vitro assemblage.

Inoculeer 15 ml preconcultuur van voorverwarmd LB-medium met één kolonie getransformeerde E.coli-cellen. Incubeer dit gedurende de nacht bij 37 °C met schudden op 200 RPM. Om de hoofdcultuur te inoculeren, brengt u de gehele preconcultuur over in één liter voorverwarmd N9-medium dat de benodigde isotoopgelabelde koolstof- en stikstofbronnen bevat.

Hiervoor kunnen N15-gelabeld ammoniumchloride, uniform C13-gelabelde glucose, selectief C13-gelabelde glucose of selectief C13-gelabeld glycerol worden gebruikt. Incubeer bij 37 °C en meet de optische dichtheid bij 600 nm zodra de cultuur troebel wordt. Wanneer de OD een waarde van 0,8 heeft bereikt, induceer dan de eiwitexpressie met 0,75 mM IPTG gedurende vier uur. Let op dat de optimale inductiecondities per eiwit kunnen variëren.

Verzamel de cellen door centrifugatie gedurende 30 minuten bij 6.000 G en vier graden. Na zuivering van de eiwit-subunits worden deze in vitro geassembleerd. Concentreer het eiwit tot ongeveer één mini molar in een centrifugeerfiltereenheid.

Om dit te doen, brengt u het monster over in de filtereenheid en centrifugeert u dit bij 4,000 G gedurende 30 minuten. Meng de oplossing in de filtereenheid tussen de centrifugatiestappen voorzichtig met een pipet om eiwitneerslag op het filtermembraan te voorkomen. Herhaal deze procedure totdat de gewenste concentratie is bereikt.

Hanteer het monster naar een falcon-buis en incubeer dit gedurende één week bij kamertemperatuur onder agitatie. Normaal gesproken gaat de polymerisatie van de subunits tot filamenten gepaard met een troebeling van de oplossing. Voeg 0,02% gewicht per volume natriumazide toe om bacteriële contaminatie te voorkomen.

Om het eiwitcomplex te oogsten, centrifugeert u het monster gedurende één uur bij 20.000 G en vier graden. Aspireer het grootste deel van het supernatant, waarbij slechts genoeg vloeistof wordt achtergelaten om het oppervlak te bedekken om uitdroging van het monster te voorkomen, en bewaar het monster bij vier graden tot aan de meting. We zullen de essentiële experimenten presenteren voor een structurele analyse middels solid state NMR.

Eendimensionale kruispolarisatie-experimenten (CP) en INEPT-experimenten gedetecteerd op C13-kernen worden respectievelijk gebruikt om rigide en flexibele eiwitsegmenten in het complex te detecteren, en om de graad van structurele homogeniteit en lokaal polymorfisme te schatten. Hier gebruiken we standaard experimentele waarden.

Typische parameterbereiken zijn aangegeven in het protocol. Plaats de rotor in de NMR-magneet en start de magic angle spinning zoals beschreven in het protocol. Stel de gewenste spinfrequentie in en zorg voor stabilisatie binnen plus of min 10 hertz.

Registreer een enkel gepulseerd, eendimensionaal protonspectrum met 16 scans. Stel een 1D proton-koolstof CP-experiment in. CP-experimenten tonen de signalen die voortkomen uit residuen in een rigide conformatie. De initiële experimentparameters zijn afgeleid van een standaard optimalisatieprocedure op een referentieverbinding.

Pulskalibratie- en ontkoppelingsparameters kunnen in het monster worden geoptimaliseerd wanneer de gevoeligheid hoog genoeg is. Hier registreren we een CP met 16 scans. De CP-contacttijd en het vermogensniveau zijn gekozen op basis van de maximale signaalintensiteit, zoals hier wordt gedemonstreerd voor de optimalisatie van de CP-contacttijd.

De maximale intensiteit in dit voorbeeld wordt bereikt bij 800 milliseconden. De ontkoppelingsparameters moeten ook opnieuw worden ingesteld ten opzichte van de oorspronkelijke instellingen van de kalibratie met de referentieverbinding. Observeer tot slot zorgvuldig de lokalisatie van de spinning side bands bij de gegeven magic angle spinning-frequentie, hier weergegeven op 18 kilohertz, om overlap met het signaal te voorkomen.

Registreer een referentie 1D proton-koolstof CP-spectrum dat dient als een eendimensionale spectrale vingerafdruk. Hierbij verzamelen we 128 scans met een CP-contacttijd van 800 milliseconden, een ontkoppelingsterkte van 100 kilohertz, een recycle-vertraging van drie seconden en een acquisitietijd van 20 milliseconden. Verwerk het CP-experiment zonder apathi-zatie.

Kies en isoleer een piek om de C39 binnen het monster te schatten, wat indicatief is voor de structurele orde en homogeniteit. Hier is de lijnbreedte, gemeten als de volledige breedte op halve hoogte, ongeveer 60 tot 70 hertz, wat duidt op een goed geordende proteïnestructuur in het complex. Stel een eendimensionaal proton-carbon INEPT-experiment in om te zoeken naar zeer mobiele delen van het proteïnecomplex.

Neem een referentie-INEPT-experiment op om als vingerafdruk voor de mobiele eiwitsegmenten te dienen. Typische parameters zijn 128 scans en een acquisitietijd van 25 milliseconden. Verwerk het proton-koolstof INEPT-experiment.

Het aantal signalen en hun posities zijn respectievelijk indicatief voor de mate van mobiliteit van de residuen en de aminozuursamenstelling. Hier wordt alleen het signaal van de twist buffer CH2 merit-y waargenomen, aangezien het gehele eiwit zich in een rigide regime bevindt in de assemblage-structuur. Conformationele analyse van de eiwitstructuur is gebaseerd op de solid-state NMR-resonantietoewijzingen voor alle rigide residuen van de assemblage.

Dit is mogelijk omdat chemische verschuivingen zeer gevoelige probes zijn voor de lokale chemische omgeving en kunnen worden gebruikt om de secundaire structuur van het eiwit te voorspellen. Een volledige 3D-structuurbepaling is vervolgens gebaseerd op de verzameling van structurele gegevens, zoals afstandsbeperkingen die zowel intra- als intermoleculaire atoomnabijheden tot negen angstrom coderen. Hier zullen we laten zien hoe de basis tweedimensionale experimenten worden geregistreerd en een voorbeeld geven van een sequentiële toewijzing.

Vervolgens geven we een korte demonstratie over hoe afstandbeperkingen kunnen worden verzameld uit experimenten die zijn opgenomen op selectief C13-gelabelde monsters. Stel het tweedimensionale koolstof-koolstof PDSD-experiment in met een korte mengingstijd om intra-residuele koolstof-koolstofcorrelaties te detecteren. Kopieer de waarden voor de initiële proton-koolstof cross-polarisatiestap van het eendimensionale CP-experiment.

Voor uniform met C13 gelabelde monsters kan de mengtijd worden ingesteld op 50 milliseconden. In dit geval hebben we gekozen voor een acquisitietijd van respectievelijk 15 en 20 milliseconden in de indirecte en directe dimensies. Om het PDSD-spectrum te verwerken, gebruiken we een QSINE-windowfunctie met een sine-bell shift van 3,5.

Om residuspecifieke toewijzing mogelijk te maken, gebruikten u de instellingen van de PDSD met korte mengtijd om een PDSD met een gemiddelde mengtijd van 100 tot 200 milliseconden op te nemen. Let op dat aanvullende spectra, inclusief experimenten met stikstofdetectie, vaak nodig zijn voor een volledige resonantietoewijzing; deze worden verder uitgewerkt in het protocol. Kies een NMR-analyseprogramma, zoals CCPNMR Analysis.

Laad de 2D-spectra in de software en maak een molecuulobject aan met de primaire eiwitsequentie. Begin met de identificatie van de aminozuurtypes die zichtbaar zijn in het PDSD-spectrum met korte mengtijd. Door de koolstofatomen van de spin-systemen te verbinden, kunnen residuetypespecifieke toewijzingen worden gedaan.

Hier wijzen we het spinsysteem van een threonine-residu toe. De polarisatieoverdrachten tussen de C-alpha, C-beta en C-gamma kernen leiden tot fysieke cross-peaks in het PDSD-spectrum. Probeer zoveel mogelijk residuen te identificeren met deze procedure.

Leg het PDSD-spectrum van zowel de korte als de gemiddelde mengtijd over elkaar heen. De aanvullende pieken die zichtbaar zijn in het PDSD-spectrum met de gemiddelde mengtijd ontstaan gewoonlijk door contact tussen opeenvolgende residuen. Markeer de resonantiepieken van een spin-systeem en zoek in het PDSD-spectrum met de gemiddelde mengtijd naar correlaties met resonantiefrequenties van andere spin-systemen.

We tonen de sequentiële toewijzing van thenium 33 naar isolutaan 32 in onze filamenteuze eiwitassemblage. De resonantiefrequenties van het thenium-spin-systeem zijn zichtbaar op een koolstofsequentie van de isoluten in 32, en vice versa. Procedures voor toewijzing met stikstofgedetecteerde spectra en voor het bepalen van de secundaire eiwitstructuur op basis van de toewijzingen worden in het protocol beschreven.

Na een grondige resonantietoewijzing kunnen we overgaan tot de identificatie van long-range restraints. Long-range restraints zijn intra- of intermoleculaire koolstof-koolstofnabijheden tussen verafgelegen residuen die zowel de tertiaire vouwing van de monomere subeenheden als de rangschikking van de subeenheden binnen het complex bepalen. Hierbij zijn selectief C13-gelabelde monsters van bijzonder belang.

Leg een PDSD met een gemiddelde mengtijd over een koolstof-koolstof PDSD met een lange mengtijd, opgenomen met een mengtijd tussen 400 milliseconden en één seconde op een selectief C13-gelabeld monster. Indien mogelijk moeten beide PDSD's op hetzelfde selectief gelabelde monster zijn opgenomen. Aanvullende pieken ontstaan door correlaties tussen meer afgelegen C13-atomen.

Houd bij de toekenning van resonanties rekening met het schema voor selectieve markering. In dit geval 1-3-glycerol. Hier hebben we een voorbeeld gemarkeerd van een piek voor een contact over lange afstand met een eenduidige toekenning in beide dimensies.

Thenium 33 C-beta met proteïne 45 C-alpha. Na het voltooien van de identificatie van langeafstandscontacten worden de restraints geclassificeerd als eenduidig of ambigu, en als intra- of intermoleculair. De lijsten met restraints die moeten worden voorbereid voor de structurele modellering zijn opgenomen in het protocol.

Handleidingen voor structurele modellering met behulp van verschillende programma's zijn online te vinden. Solid state NMR-gegevens, zowel op zichzelf als in combinatie met complementaire gegevens, kunnen de determinatie van de structuur op atomair niveau van supramoleculaire complexen mogelijk maken. De voordelen van solid state NMR zijn enerzijds de mogelijkheid om zowel informatie over de secundaire structuur als atomaire afstandbeperkingen van intramoleculaire interfaces te verkrijgen, die in het modelleringsproces kunnen worden geïntegreerd.

Aan de andere kant ligt de unieke eigenschap van vaste-stof NMR-spectroscopie in het vermogen om atomaire afstandbeperkingen te verzamelen bij intermoleculaire interfaces van intacte supermoleculaire assemblages. De detectie en het onderscheid tussen intra- en intermoleculaire toewijzingen van beperkingen kan echter een tedious proces zijn en vereist doorgaans de bereiding van selectief C13-gelabelde monsters. Met nieuwe ontwikkelingen in selectieve labelingsstrategieën, het ontwerp van spectrometerhardware en vaste-stof NMR-methodologieën is de techniek echter steeds vaker in staat om haar theoretische potentieel te benutten door moleculaire informatie op atomair niveau te verschaffen, zonder beperkingen wat betreft objectgrootte, langeafstandsorde of kristalliniteit.

Deze methode stelt ons in staat om de atomaire structuur van biomoleculaire assemblages te bestuderen. Het is zeer belangrijk om het monster zorgvuldig voor te bereiden om de NMR-condities te optimaliseren en zo gegevens met een hoge resolutie te verkrijgen. Met dit protocol kunnen we atomaire resoluties bereiken die informatie verschaft over eiwitassemblages.

En deze techniek kan worden gecombineerd met andere technieken in de structurele biologie om driedimensionale modellen te verkrijgen.