Name: Atoomschaal structurele Studies van macromoleculaire samenstellen door Solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Leer hoe je atomaire structuren van onoplosbare en niet-kristallijne supramoleculaire eiwitassemblages bestudeert met behulp van magic-angle spinning solid-state NMR-spectroscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk wordt gefinancierd door de ANR (13-PDOC-0017-01 B.H. te ANR-14-CE09-0020-01 tot A.L.), "Investeringen voor de toekomst" programma IdEx Bordeaux/CNRS (PEPS 2016 naar B.H.) verwijst naar ANR-10-IDEX-03-02 tot B.H., de Fondation pour la Recherche Médicale) FRM-AJE20140630090 naar A.L.), het KP7-programma (KP7-mensen-2013-CIG aan A.L.) en de European Research Council (ERC) onder de Europese Unie Horizon 2020 onderzoek en innovatie programma (ERC Starting Grant aan A.L., overeenkomst No 639020) en project " WEAKINTERACT."

De auteurs hebben niets te onthullen.

Solid state NMR (SSNMR) is een methode van keuze voor het karakteriseren van macromoleculaire eiwit assemblages op atomaire niveau. Een van de centrale kwesties in SSNMR gebaseerde structuurbepaling is de spectrale kwaliteit van de onderzochte systeem, waarmee het tot de oprichting van 3D-structurele modellen van verschillende precisie, meestal variërend van lage-resolutie modellen (met de secundaire structuur van de elementen en weinig 3D informatie) aan pseudo-atomaire 3D structuren. De kwantiteit en kwaliteit van structurele gegevens uit multi-dimensionale SSNMR experimenten is de sleutel tot het berekenen van een hoge resolutie NMR-structuur van de vergadering.
Het beschreven protocol is gebaseerd op de detectie van 13C -13C en 15N -13C structurele beperkingen die de opname van verschillende spectra van 2D (en soms 3D) met hoge signaal-ruis. Bij matige MAS frequenties (&#60; 25 kHz), het monster rotoren met maten van 3.2-4 mm doorsnede waardoor eiwitten hoeveelheden tot ~ 50 mg, afhankelijk van de hydratatie van de steekproef is binnengebracht. De hoeveelheid monster binnen de rotor is recht evenredig met de signal-to-noise verhouding in SSNMR spectra, een beslissende factor voor de detectie van lange-afstands afstand beperkingen en hun ondubbelzinnige toewijzing.
De spectrale resolutie is een cruciale parameter tijdens de opeenvolgende resonantie-toewijzing en de beperkingen-collectie. Voor het verkrijgen van optimale resultaten, moeten de steekproef voorbereiding parameters worden geoptimaliseerd, met name in de zuivering van de subeenheid en de voorwaarden van de vergadering (pH, buffer, schudden, temperatuur, enz.). Voor de optimalisatie van de steekproef, het verdient om labelloze monsters voor verschillende afzonderlijke voorwaarden die vergadering heeft waargenomen, te bereiden en het opnemen van een 1D 1H -13C CP spectrum (beschreven in stap 2.1) op elke voorbereide monster. De spectra dienen te vergelijken spectrale resolutie en spreiding tussen de verschillende preparaten, gebaseerd op de optimale omstandigheden kunnen u vaststellen.
De kwaliteit van de gegevens van de SSNMR hangt sterk af van de keuze van de NMR overname parameters, met name voor de polarisatie overdracht stappen. Het gebruik van hoge magnetische Veldsterkten (frequentie ≥600 MHz 1H) is essentieel voor de hoge gevoeligheid en spectrale resolutie, vereist wanneer geconfronteerd met complexe doelen zoals macromoleculaire eiwit assemblages.
Een beperkende factor in veel gevallen is de beschikbaarheid van de spectrometer. Daarom een verstandige keuze van de monsters worden voorbereid moet voorafgaan aan de spectrometer-sessie. In ieder geval, een uniform 13C, 15N-geëtiketteerden monster is een voorwaarde voor het uitvoeren van de sequentiële en intra residuele resonantie-toewijzing. Zie71voor eiwitten toegewezen door Solid state NMR technieken. Structuurbepaling van macromoleculaire assemblages op gematigde MAS frequenties vereist selectief 13C-gelabeld monsters; voor de detectie van lange-afstands 13C -13C en 13C -15N monsters op basis van 1,3 contacten -13C- en 2 -13C-gylcerol en/of 1 -13C- en 2 -13C-glucose labeling zijn gebruikte, zoals hierboven beschreven. De keuze tussen de twee stelsels van labeling is gebaseerd op de spectrale signal-to-noise verhouding en resolutie. Om deze te onderscheiden van intra- en intermoleculaire lange-afstands contacten, is gemengd met het label en het verdunde monsters efficiënt gebleken.
Kortom, de kritische stappen voor een atomaire SSNMR structurele studie zijn: (i) de voorbereiding van de subeenheden en de noodzaak van de vergadering moet worden geoptimaliseerd voor uitstekende monster kwantiteit en kwaliteit, (ii) spectrometer veldparameters sterkte en overname moeten worden gekozen zorgvuldig; (iii) selectieve labeling strategieën zijn nodig voor de bepaling van een 3D-structuur en het bedrag van de vereiste gegevens is afhankelijk van de kwaliteit van de gegevens en de beschikbaarheid van aanvullende gegevens.
Ondanks de toepasbaarheid op een breed scala van supramoleculaire systemen, variërend van membraaneiwitten op homomultimeric nano-objecten, wordt de SSNMR vaak beperkt door de behoefte aan mg-hoeveelheden ionenpaar gelabelde materiaal. De recente technologische ontwikkelingen in ultra-snelle MAS (≥100 kHz) SSNMR de laan op 1H-gedetecteerd NMR openstellen, en duw de limiet van minimal steekproef hoeveelheid tot en met sub-mg 72,73,74. Voor gedetailleerde structurele studies zijn 13C-gelabeld monsters echter onmisbaar, die de toepassing van SSNMR aan monsters geassembleerd in vitro of systemen uitgedrukt in organismen die op een minimale voedingsbodem waar beperkt overleven in cel SSNMR is een opkomende methode (Zie voor de beoordelingen 75,76,77,78).
Een belangrijke factor in SSNMR aanvraag tot het verkrijgen van hoge resolutie 3D structuren is de spectrale resolutie: intrinsieke conformationele heterogeniteit in een vergadering spectrale resolutie en spectra analyse kunt beperken. Labelen van residu-specifieke 13C kan in sommige gevallen een alternatief bieden specifieke afstand om informatie te verkrijgen over strategische residuen met het oog op de structurele modellen (voor een recente voorbeelden Zie 79,80).
SSNMR voor 3D structuurbepaling vereist nog steeds de collectie van verschillende datasets met vaak lange gegevens collectie keer op geavanceerde instrumenten, afhankelijk van de benadering en het systeem enkele dagen tot weken op een 600-1000 MHz (1H/bClk frequentie) spectrometer. Daarom kunnen de toegang tot de spectrometer tijd een beperkende factor in een diepgaande studie van de SSNMR.
In het geval van homomultimeric eiwit assemblages, leidt tot SSNMR gegevens van voldoende kwaliteit om te identificeren van een groot aantal structurele beperkingen zoals in 3,57,64,,70, SSNMR geeft nog steeds geen toegang tot de microscopische afmetingen. Daarom, in een DOVO SSNMR structuurbepaling van een vergadering van de homomultimeric, EM of massa-per-(MPL) lengtegegevens ideaal aanvullen SSNMR gegevens afleiden van de symmetrie-parameters. SSNMR gegevens alleen bieden de atomaire intra- en intermoleculaire interfaces
SSNMR is uiterst complementair met structurele technieken zoals EM of MPL metingen, maar de gegevens kan ook perfect gecombineerd worden met atomaire structuren die zijn verkregen door middel van röntgendiffractie of oplossing NMR op gemuteerde of afgekapte subeenheden. Een toenemend aantal studies kan worden gevonden in de literatuur waar de combinatie van de verschillende structurele gegevens is toegestaan voor de bepaling van de atomaire 3D-modellen van macromoleculaire assemblages (Zie Figuur 6 voor representatieve voorbeelden).
Op het gebied van Structural Biology, SSNMR komt te voorschijn als veelbelovende techniek om te studerenonoplosbare en niet-kristallijne assemblages op het atomaire niveau, dat wil zeggen met structurele gegevens op de atoomschaal. In dit opzicht is SSNMR de hanger oplossing NMR en röntgendiffractie voor moleculaire assembly's, met inbegrip van membraaneiwitten in hun inheemse milieu en eiwit assemblages zoals virale enveloppen, bacteriële filamenten of amyloids, evenals RNA en RNA-eiwitcomplexen (zie bijvoorbeeld81). De uiterst veelzijdige toepassingen in vitro en in de cellulaire context, zoals het bijhouden van secundaire, tertiaire en quaternaire structurele wijzigingen, interactie oppervlakken te identificeren met partner moleculen op de atoomschaal (bijvoorbeeld 82) en moleculaire dynamica van de toewijzing in het kader van de geassembleerde complexen, aangeven welke belangrijke mogelijkheden SSNMR in toekomstige structurele studies over complexe biomoleculaire assemblages.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Component</td>
			<td>M9 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>0,5 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>3 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NB2HPO4</td>
			<td>6,7 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>10 ΜM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3</td>
			<td>1 ΜM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>100 ΜM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM vitamine mix 100 X</td>
			<td>10 mL/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 C-glucose</td>
			<td>2 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 NH4Cl</td>
			<td>1 g/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabel 1: Samenstelling van minimale expressie medium voor recombinante eiwitten productie in E. coli BL21 cellen.

Vooruitgang in de magie-hoek spinnen solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (SSNMR) bieden een efficiënt instrument is om de structurele karakterisering van macromoleculaire eiwit assemblages op een atomaire resolutie. Deze eiwit-assemblages zijn alomtegenwoordige systemen die spelen een essentiële rol in vele biologische processen. Hun moleculaire structuren, interacties en dynamiek zijn toegankelijk door SSNMR studies, zoals is gebleken voor virale (capsids1) en mechanismen van bacteriële infectie (secretie systemen2,3, pili4), membraan eiwit complexen5,6,7,8 en functionele amyloids 9,10,11. Dit type van moleculaire vergadering kan ook provoceren pathologieën zoals in neurodegeneratieve ziekten waar eiwitten monteren in misfolded, amyloïde Staten en leiden tot afwijkend cel gedrag of 12,13van de dood van de cel. Eiwit assemblages zijn vaak gebouwd door de symmetrische oligomerisatie van veelvouden kopieën van eiwit subeenheden in grote supramoleculaire objecten van verschillende vormen, met inbegrip van fibrillen, door samensmelting van filamenten, poriën, buizen of nanodeeltjes. De quaternaire structuur wordt gedefinieerd door zwakke interacties tussen eiwitten subeenheden te organiseren van de vergadering van de ruimtelijke en temporele en toe te staan voor de verfijnde biologische functies. Structurele onderzoeken op atomaire schaal op deze vergaderingen zijn een uitdaging voor hoge resolutie technieken sinds hun intrinsieke oplosbaarheid en heel vaak hun niet-kristalliniteit beperkt het gebruik van conventionele röntgendiffractie of oplossing NMR benaderingen. Magic-hoek spinnen (MAS) SSNMR is een opkomende techniek atomaire resolutie op onoplosbare macromoleculaire verzamelingen gegevens en haar efficiëntie te lossen 3D atomaire modellen voor een toenemend aantal complexe biomoleculaire systemen waaronder heeft bewezen bacteriële filamenten, amyloïde assemblages en virale deeltjes 14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Technische vooruitgang op hoge magneetvelden, methodologische ontwikkelingen en bereiding van de monsters opgezet MAS SSNMR in een robuuste methode te onderzoeken van onoplosbare eiwitten in verschillende omgevingen, met name in hun biologisch relevante macromoleculaire in de cellulaire membranen, waardoor de techniek zeer complementair aan cryo-elektronenmicroscopie of staat gemonteerd. In veel gevallen kenmerkt een zeer hoge graad van symmetrie deze eiwit-assemblages. MAS SSNMR exploiteert deze functie, zoals alle eiwit subeenheden in een homomolecular vergadering dezelfde lokale structuur zou hebben en dus vrijwel dezelfde SSNMR handtekening, drastisch verminderen van de complexiteit van de analyse.
Een efficiënt protocol voor structurele studies van macromoleculaire eiwit samenstellen door matige MAS (&#60; 25 kHz) SSNMR wordt gepresenteerd in deze video en kan worden onderverdeeld in verschillende stappen (Figuur 1). Zullen we laten zien van de kritische fasen van de workflow van een SSNMR structurele studie wordt geïllustreerd op een draadvormige proteïne vergadering (Zie gemarkeerd stappen in Figuur 1), met uitzondering van de subeenheid EiwitReiniging, verschillen voor elk eiwit vergadering maar van cruciaal belang voor structurele studies, en zonder in te gaan op de technische/methodologische details van SSNMR berekening van de spectroscopie en structuur voor welke gespecialiseerde tutorials zijn online beschikbaar. Terwijl dit protocol zich voornamelijk op Solid state NMR experimenten uitgevoerd onder voorwaarden van MAS richten zal, het gebruik van biologische omgevingen 23,24,25,26 uitgelijnd , 27, zoals uitgelijnde bicelles, voorzien in het onderzoek van eiwitten bevleesdheid en dynamische eiwit-eiwit interactie in membraan-achtige media zonder MAS technologie. We zullen laten zien de eiwituitdrukking en montage stappen, evenals de opname van de cruciale SSNMR spectra en hun analyse en interpretatie. Ons doel is om het inzicht verwerven in de structurele analyse pijpleiding waardoor de lezer een structurele studie van de atomaire resolutie van een macromoleculaire vergadering uitvoeren door SSNMR technieken.
Het protocol omvat 3 secties:
1. Solid state NMR monster productie
Als een voorwaarde voor een solid state NMR-analyse, de proteïne componenten macromoleculaire vergadering moet worden uitgedrukt, isotope-label, gezuiverd en gemonteerd in vitro in de native-achtige complexe toestand (voor een voorbeeld Zie Figuur 2) . Om ervoor te zorgen de hoge gevoeligheid van de NMR, is isotope verrijking in 13C en labelen van 15N vereist door het gebruik van minimale bacteriële expressie media aangevuld met 13C en 15N bronnen, zoals uniform 13 C-label glucose/glycerol en 15NH4Cl respectievelijk. In de latere fase van het protocol, selectief 13C-gelabeld monsters geproduceerd met selectief 13C-gelabeld bronnen zoals (1,3 -13C)- en (2 -13C)-glycerol (of (1 -13C)- en (2 -13C)- glucose) worden gebruikt om de analyse van de NMR. Gemengd gelabelde monster overeenkomt met een mengsel mengsel van ofwel 50% 15N- en 50% 13C-label of 50% (1,3 -13C)- en 50% (2 -13C)-glucose worden ingevoerd om te beschrijven de detectie van intermoleculaire interacties. Een hoge mate van zuiverheid van de proteïne evenals strenge voorwaarden tijdens de vergadering stap zijn belangrijke factoren om te verzekeren van een homogene structurele orde van het eindmonster.
2. preliminaire structurele karakterisering op basis van een eendimensionale (1D) Solid state NMR
We presenteren de essentiële experimenten voor een structurele analyse per SSNMR. Eendimensionale (1D) kruis-polarisatie (CP) en INEPT / RINEPT28 experimenten, ontdekt op 13C kernen worden gebruikt voor het detecteren van stijve en flexibele eiwit segmenten in de vergadering, respectievelijk, en schatting van de mate van structurele homogeniteit en lokale polymorfisme (voor een voorbeeld Zie Figuur 3).
<st></st>Rong > 3. Bepaling van de structuur van de Conformationele analyse en 3D
Onderafdelingen 1 en 2 hebben betrekking op de Conformationele analyse, die is gebaseerd op de SSNMR resonantie toewijzing van alle starre residuen van de eiwit-vergadering, zoals de chemische shifts zeer gevoelige sondes voor de plaatselijke omgeving zijn en kunnen worden gebruikt voor het voorspellen van de phi/psi dihedrale hoeken en daarmee de secundaire structuur te bepalen. Figuur 4 illustreert een voorbeeld van een toewijzing van de sequentiële resonantie in de stijve kern van een eiwit vergadering. De bepaling van de 3D-structuur is gebaseerd op de verzameling van structurele gegevens zoals afstand beperkingen codering sluiten proximities (&#60; 7-9 Å), die zowel intra- als intermoleculaire informatie bevatten. Subsecties 3 en 4 beschrijven lange-afstands verre terughoudendheid collectie en interpretatie. Lange-afstands contacten worden gedefinieerd als intramoleculaire 13C -13C proximities als gevolg van residuen ik j, met | i-j | ≥4, waardoor de tertiaire eiwit Vouw de monomere subeenheid of als intermoleculaire 13C -13C proximities definiëren, definiëren de intermoleculaire interfaces tussen eiwit subeenheden in de vergadering. Intra- en intermoleculaire interfaces worden geïllustreerd in Figuur 5. SSNMR beperkingen gedetecteerd via 13C -13C en 15N -13C schade experimenten meestal coderen voor internuclear afstanden &#60; 1 nm. Onderafdeling 4 verklaart de detectie van intermoleculaire afstand beperkingen. In de symmetrische eiwit vergaderingen, het gebruik van homogeen gelabelde monsters (d.w.z. 100% uniform of selectief label) identificeren intermoleculaire subeenheid-subunit interacties is beperkt, als beide intra - en intersite - molecular contacten leiden tot detecteerbare signalen. De ondubbelzinnige detectie van intermoleculaire proximities wordt bereikt met behulp van gemengde gelabelde monsters, die een mengsel mengsel van twee anders gelabelde monsters, gecombineerd vóór aggregatie. Subsectie 5 introduceert kort structuur modellering.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig1.jpg"> 
Figuur 1 : Workflow van een structurele studie van de atomaire resolutie van Solid state NMR. 13 C, 15N isotoop label eiwitproductie, subeenheid zuivering, de assemblage van de subeenheid, controle van vergadering formatie, SSNMR-experimenten, SSNMR experiment analyse en extractie van afstand beperkingen en modellering van de structuur worden weergegeven. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

<table><tbody><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NMR Spectrometer (> 11.7 Tesla)</td><td>Bruker</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>triple resonance MAS SSNMR probehead&nbsp;</td><td>Bruker</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>SSNMR rotors 4mm</td><td>Bruker</td><td>K1910</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5804 R&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5805000629</td><td></td></tr><tr><td>GeneQuant 1300 spectrometer</td><td>Dutscher</td><td>28-9182-13</td><td></td></tr><tr><td>IGS60 INCUBATEUR HERATHERM 75 L</td><td>Dutscher</td><td>228001</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 4450 bench top orbital shaker</td><td>Dutscher</td><td>78376</td><td></td></tr><tr><td>Tube Revolver Agitator</td><td>Dutscher</td><td>79547</td><td></td></tr><tr><td>sonopuls HD 3100</td><td>Bandelin</td><td>3680</td><td></td></tr><tr><td>MicroPulser electroporator</td><td>Biorad</td><td>165-2100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>mini-PROTEAN tetra cell system</td><td>Biorad</td><td>165-8000</td><td></td></tr><tr><td>AKTA pure system</td><td>GE Healthcare</td><td>29-0182-24</td><td></td></tr><tr><td>capillary microman M25 pipet</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>F148502</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>amiconR ultra-15</td><td>sigma</td><td>Z740199-8EA</td><td></td></tr><tr><td>capillaries and pistons</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>F148112</td><td></td></tr><tr><td>spatula</td><td>Fisher</td><td>13263799</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-glucose 13C6</td><td>Sigma</td><td>389374</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium-15N-chloride</td><td>Sigma</td><td>299251</td><td></td></tr><tr><td>1,3 13C2 glycerol</td><td>Sigma</td><td>492639</td><td></td></tr><tr><td>2 13C glycerol</td><td>Sigma</td><td>489484</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma</td><td>K1876</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Sigma</td><td>C3416</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>calcium chloride</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate</td><td>Sigma</td><td>208094</td><td></td></tr><tr><td>Iron Chloride</td><td>Sigma</td><td>157740</td><td></td></tr><tr><td>Zinc chloride</td><td>Sigma</td><td>793523</td><td></td></tr><tr><td>MEM Vitamin Solution (100&times;)</td><td>Sigma</td><td>M68954</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Fisher</td><td>BP1755</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>sodium azide</td><td>sigma</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>178837</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unicorn 6.3</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Akta systems</td></tr><tr><td>ccpNMR</td><td>CCPN&nbsp;</td><td></td><td>spectrometer systems</td></tr></tbody></table>

atoomschaal structurele studies van macromoleculaire samenstellen door solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Supramoleculaire eiwit assembly's spelen een fundamentele rol in biologische processen, variërend van host-pathogen interactions, virale infectie tegen verspreiding van neurodegeneratieve aandoeningen. Deze assemblages bestaan uit meerdere eiwit subeenheden georganiseerd in een niet-covalente manier vormen grote macromoleculaire objecten die kunnen uitvoeren van een verscheidenheid van cellulaire functies of nadelige gevolgen veroorzaken. Atomaire inzicht in de mechanismen van de vergadering en de werking van deze macromoleculaire vergaderingen sinds hun inherente oplosbaarheid vaak schaars blijven en niet-kristalliniteit vaak drastisch vermindert de kwaliteit van de gegevens die zijn verkregen van de meeste technieken gebruikt in structurele biologie, zoals röntgendiffractie en oplossing nucleaire magnetische resonantie (NMR). Hier presenteren we de magie-hoek spinnen solid-state NMR spectroscopie (SSNMR) als een krachtige methode om te onderzoeken structuren van macromoleculaire samenstellingen met atomaire resolutie. SSNMR kan onthullen atomaire details op de geassembleerde complex zonder grootte en oplosbaarheid beperkingen. Het hier gepresenteerde protocol beschrijft de essentiële stappen van de productie van 13C /15N isotoop-geëtiketteerden macromoleculaire eiwit assembly's voor de verwerving van standaard SSNMR spectra en hun analyse en interpretatie. Als voorbeeld laten we de pijpleiding van een structurele analyse van de SSNMR van een draadvormige proteïne-vergadering.

De doorsnee werkstroom voor SSNMR omvat verschillende stappen aangegeven in Figuur 1. Meestal zijn de subeenheden eiwit geproduceerd door in vitro heterologe expressie in E. coli, gezuiverd en geassembleerd onder schudden, maar soms ook in statische toestand. Meningsuiting en zuivering van de eiwit-subeenheid worden gevolgd door SDS gel chromatografie (figuur 2A). De vorming van macromoleculaire assembly's kan vervolgens worden bevestigd door middel van elektronenmicroscopie (EM) analyse (Zie figuur 2B voor een voorbeeld van een draadvormige vergadering).
Na invoering van de vergadering van de eiwitten in de rotor van de SSNMR, de rotor de spectrometer wordt ingevoegd en de frequentie van de MAS en temperatuur worden geregeld de spectra worden geregistreerd. Eerste inzichten kunnen worden verkregen door 1D SSNMR technieken. Figuur 3 toont een typische SSNMR FID aangetroffen op het 13C-kanaal op een structureel homogene eiwitSteekproef, een 1H -13C CP spectrum, onthullen de13C resonanties aanwezig in de stijve kern van de subeenheid van de eiwitten in de vergadering, en een 2D 1H -13C ONBEHOLPEN spectrum, vertegenwoordigen de mobiele residuen. Voor atomaire inzichten in de harde kern van de verzamelingsstructuur moeten multidimensionale SSNMR experimenten worden opgenomen op uniform en selectief label monsters om eerst de SSNMR resonanties toewijzen en vervolgens het detecteren van lange-afstands proximities (zie figuur 4 ).
Alle spectra worden verwerkt en geanalyseerd met voldoende software voor het toewijzen van de SSNMR resonanties en uitpakken van de intra- en intermoleculaire afstand beperkingen (Figuur 5). De SSNMR afstand beperkingen dienen hetzij alleen of in combinatie met gegevens van complementaire technieken, die kunnen worden geïntegreerd in het programma van de modellering.
Figuur 6 illustreert voor representatieve atomaire structuren van macromoleculaire assembly's opgelost door SSNMR technieken verschillende filamenteuze assemblages van bacteriële aanhangsels en amyloïde fibrillen.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2.jpg"> 
Figuur 6:filamenteuze macromoleculaire structuur bepaald door een solid-state NMR-aanpak: bacteriële filamenten en amyloïde eiwitten fibrillen. A) Type 1 pilus van uropathogenic E. coli, VOB code 2N7H 4; B) ASC gloeidraad, VOB code 2N1F 63; C) Type III secretie systeem naalden, VOB codes 2MME, 2LPZ en 2MEX 2,3,64; D) Amyloid-bèta AB42 fibrillen, VOB code 2NAO, 5KK3, 2MXU 65,66,,67 en Osaka mutant VOB code 2MVX 57, Iowa mutant VOB code 2MPZ 58; E) Alpha-synuclein fibrillen, VOB code 2N0A 68; F) HET-s prion domein, VOB code 2RNM, 2KJ3 69,70. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Structuren van supramoleculaire eiwit samenstellingen met atomaire resolutie zijn van groot belang vanwege hun cruciale rol in een verscheidenheid van biologische fenomenen. Hierin presenteren wij een protocol voor het uitvoeren van high-resolution structurele studies op onoplosbare en niet-kristallijne macromoleculaire eiwit samenstellen door magie-angle spinning solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (MAS SSNMR).

Atoomschaal structurele Studies van macromoleculaire samenstellen door Solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Het algemene doel van dit protocol is om de structuren van onoplosbare en niet-kristallijne supramoleculaire eiwitcomplexen op atomair niveau te bestuderen met behulp van magic angle spinning solid-state NMR-spectroscopie. Wij presenteren de essentiële methodologische stappen voor het bestuderen van atomaire structuren van biomoleculaire eiwitcomplexen via solid-state NMR. Het bestuderen van de atomaire structuren van deze complexen is uiterst uitdagend omdat ze inherent onoplosbaar en niet-kristallijn zijn.Solid-state NMR is een opkomende techniek waarmee moleculaire structuur en dynamiek op atomair niveau kunnen worden bestudeerd, zonder beperkt te worden door de grootte van het geassembleerde object of door de oplosbaarheid ervan. We illustreren hier de belangrijkste stappen om atomaire structuren van biomoleculaire eiwitcomplexen te visualiseren met solid-state NMR, inclusief de bereiding van isotopisch gelabelde monsters, de verzameling en de analyse van structurele gegevens uit solid-state NMR. De eerste stap in een solid-state NMR-workflow is de productie van C13 N15 gelabelde eiwitsubeenheden en hun in vitro assemblage.Inoculeer 15 ml preconcultuur van voorverwarmd LB-medium met één kolonie getransformeerde E.coli-cellen. Incubeer dit gedurende de nacht bij 37 °C met schudden op 200 RPM. Om de hoofdcultuur te inoculeren, brengt u de gehele preconcultuur over in één liter voorverwarmd N9-medium dat de benodigde isotoopgelabelde koolstof- en stikstofbronnen bevat.Hiervoor kunnen N15-gelabeld ammoniumchloride, uniform C13-gelabelde glucose, selectief C13-gelabelde glucose of selectief C13-gelabeld glycerol worden gebruikt. Incubeer bij 37 °C en meet de optische dichtheid bij 600 nm zodra de cultuur troebel wordt. Wanneer de OD een waarde van 0,8 heeft bereikt, induceer dan de eiwitexpressie met 0,75 mM IPTG gedurende vier uur. Let op dat de optimale inductiecondities per eiwit kunnen variëren.Verzamel de cellen door centrifugatie gedurende 30 minuten bij 6.000 G en vier graden. Na zuivering van de eiwit-subunits worden deze in vitro geassembleerd. Concentreer het eiwit tot ongeveer één mini molar in een centrifugeerfiltereenheid.Om dit te doen, brengt u het monster over in de filtereenheid en centrifugeert u dit bij 4,000 G gedurende 30 minuten. Meng de oplossing in de filtereenheid tussen de centrifugatiestappen voorzichtig met een pipet om eiwitneerslag op het filtermembraan te voorkomen. Herhaal deze procedure totdat de gewenste concentratie is bereikt.Hanteer het monster naar een falcon-buis en incubeer dit gedurende één week bij kamertemperatuur onder agitatie. Normaal gesproken gaat de polymerisatie van de subunits tot filamenten gepaard met een troebeling van de oplossing. Voeg 0,02% gewicht per volume natriumazide toe om bacteriële contaminatie te voorkomen.Om het eiwitcomplex te oogsten, centrifugeert u het monster gedurende één uur bij 20.000 G en vier graden. Aspireer het grootste deel van het supernatant, waarbij slechts genoeg vloeistof wordt achtergelaten om het oppervlak te bedekken om uitdroging van het monster te voorkomen, en bewaar het monster bij vier graden tot aan de meting. We zullen de essentiële experimenten presenteren voor een structurele analyse middels solid state NMR.Eendimensionale kruispolarisatie-experimenten (CP) en INEPT-experimenten gedetecteerd op C13-kernen worden respectievelijk gebruikt om rigide en flexibele eiwitsegmenten in het complex te detecteren, en om de graad van structurele homogeniteit en lokaal polymorfisme te schatten. Hier gebruiken we standaard experimentele waarden.Typische parameterbereiken zijn aangegeven in het protocol. Plaats de rotor in de NMR-magneet en start de magic angle spinning zoals beschreven in het protocol. Stel de gewenste spinfrequentie in en zorg voor stabilisatie binnen plus of min 10 hertz.Registreer een enkel gepulseerd, eendimensionaal protonspectrum met 16 scans. Stel een 1D proton-koolstof CP-experiment in. CP-experimenten tonen de signalen die voortkomen uit residuen in een rigide conformatie. De initiële experimentparameters zijn afgeleid van een standaard optimalisatieprocedure op een referentieverbinding.Pulskalibratie- en ontkoppelingsparameters kunnen in het monster worden geoptimaliseerd wanneer de gevoeligheid hoog genoeg is. Hier registreren we een CP met 16 scans. De CP-contacttijd en het vermogensniveau zijn gekozen op basis van de maximale signaalintensiteit, zoals hier wordt gedemonstreerd voor de optimalisatie van de CP-contacttijd.De maximale intensiteit in dit voorbeeld wordt bereikt bij 800 milliseconden. De ontkoppelingsparameters moeten ook opnieuw worden ingesteld ten opzichte van de oorspronkelijke instellingen van de kalibratie met de referentieverbinding. Observeer tot slot zorgvuldig de lokalisatie van de spinning side bands bij de gegeven magic angle spinning-frequentie, hier weergegeven op 18 kilohertz, om overlap met het signaal te voorkomen.Registreer een referentie 1D proton-koolstof CP-spectrum dat dient als een eendimensionale spectrale vingerafdruk. Hierbij verzamelen we 128 scans met een CP-contacttijd van 800 milliseconden, een ontkoppelingsterkte van 100 kilohertz, een recycle-vertraging van drie seconden en een acquisitietijd van 20 milliseconden. Verwerk het CP-experiment zonder apathi-zatie.Kies en isoleer een piek om de C39 binnen het monster te schatten, wat indicatief is voor de structurele orde en homogeniteit. Hier is de lijnbreedte, gemeten als de volledige breedte op halve hoogte, ongeveer 60 tot 70 hertz, wat duidt op een goed geordende proteïnestructuur in het complex. Stel een eendimensionaal proton-carbon INEPT-experiment in om te zoeken naar zeer mobiele delen van het proteïnecomplex.Neem een referentie-INEPT-experiment op om als vingerafdruk voor de mobiele eiwitsegmenten te dienen. Typische parameters zijn 128 scans en een acquisitietijd van 25 milliseconden. Verwerk het proton-koolstof INEPT-experiment.Het aantal signalen en hun posities zijn respectievelijk indicatief voor de mate van mobiliteit van de residuen en de aminozuursamenstelling. Hier wordt alleen het signaal van de twist buffer CH2 merit-y waargenomen, aangezien het gehele eiwit zich in een rigide regime bevindt in de assemblage-structuur. Conformationele analyse van de eiwitstructuur is gebaseerd op de solid-state NMR-resonantietoewijzingen voor alle rigide residuen van de assemblage.Dit is mogelijk omdat chemische verschuivingen zeer gevoelige probes zijn voor de lokale chemische omgeving en kunnen worden gebruikt om de secundaire structuur van het eiwit te voorspellen. Een volledige 3D-structuurbepaling is vervolgens gebaseerd op de verzameling van structurele gegevens, zoals afstandsbeperkingen die zowel intra- als intermoleculaire atoomnabijheden tot negen angstrom coderen. Hier zullen we laten zien hoe de basis tweedimensionale experimenten worden geregistreerd en een voorbeeld geven van een sequentiële toewijzing.Vervolgens geven we een korte demonstratie over hoe afstandbeperkingen kunnen worden verzameld uit experimenten die zijn opgenomen op selectief C13-gelabelde monsters. Stel het tweedimensionale koolstof-koolstof PDSD-experiment in met een korte mengingstijd om intra-residuele koolstof-koolstofcorrelaties te detecteren. Kopieer de waarden voor de initiële proton-koolstof cross-polarisatiestap van het eendimensionale CP-experiment.Voor uniform met C13 gelabelde monsters kan de mengtijd worden ingesteld op 50 milliseconden. In dit geval hebben we gekozen voor een acquisitietijd van respectievelijk 15 en 20 milliseconden in de indirecte en directe dimensies. Om het PDSD-spectrum te verwerken, gebruiken we een QSINE-windowfunctie met een sine-bell shift van 3,5.Om residuspecifieke toewijzing mogelijk te maken, gebruikten u de instellingen van de PDSD met korte mengtijd om een PDSD met een gemiddelde mengtijd van 100 tot 200 milliseconden op te nemen. Let op dat aanvullende spectra, inclusief experimenten met stikstofdetectie, vaak nodig zijn voor een volledige resonantietoewijzing; deze worden verder uitgewerkt in het protocol. Kies een NMR-analyseprogramma, zoals CCPNMR Analysis.Laad de 2D-spectra in de software en maak een molecuulobject aan met de primaire eiwitsequentie. Begin met de identificatie van de aminozuurtypes die zichtbaar zijn in het PDSD-spectrum met korte mengtijd. Door de koolstofatomen van de spin-systemen te verbinden, kunnen residuetypespecifieke toewijzingen worden gedaan.Hier wijzen we het spinsysteem van een threonine-residu toe. De polarisatieoverdrachten tussen de C-alpha, C-beta en C-gamma kernen leiden tot fysieke cross-peaks in het PDSD-spectrum. Probeer zoveel mogelijk residuen te identificeren met deze procedure.Leg het PDSD-spectrum van zowel de korte als de gemiddelde mengtijd over elkaar heen. De aanvullende pieken die zichtbaar zijn in het PDSD-spectrum met de gemiddelde mengtijd ontstaan gewoonlijk door contact tussen opeenvolgende residuen. Markeer de resonantiepieken van een spin-systeem en zoek in het PDSD-spectrum met de gemiddelde mengtijd naar correlaties met resonantiefrequenties van andere spin-systemen.We tonen de sequentiële toewijzing van thenium 33 naar isolutaan 32 in onze filamenteuze eiwitassemblage. De resonantiefrequenties van het thenium-spin-systeem zijn zichtbaar op een koolstofsequentie van de isoluten in 32, en vice versa. Procedures voor toewijzing met stikstofgedetecteerde spectra en voor het bepalen van de secundaire eiwitstructuur op basis van de toewijzingen worden in het protocol beschreven.Na een grondige resonantietoewijzing kunnen we overgaan tot de identificatie van long-range restraints. Long-range restraints zijn intra- of intermoleculaire koolstof-koolstofnabijheden tussen verafgelegen residuen die zowel de tertiaire vouwing van de monomere subeenheden als de rangschikking van de subeenheden binnen het complex bepalen. Hierbij zijn selectief C13-gelabelde monsters van bijzonder belang.Leg een PDSD met een gemiddelde mengtijd over een koolstof-koolstof PDSD met een lange mengtijd, opgenomen met een mengtijd tussen 400 milliseconden en één seconde op een selectief C13-gelabeld monster. Indien mogelijk moeten beide PDSD's op hetzelfde selectief gelabelde monster zijn opgenomen. Aanvullende pieken ontstaan door correlaties tussen meer afgelegen C13-atomen.Houd bij de toekenning van resonanties rekening met het schema voor selectieve markering. In dit geval 1-3-glycerol. Hier hebben we een voorbeeld gemarkeerd van een piek voor een contact over lange afstand met een eenduidige toekenning in beide dimensies.Thenium 33 C-beta met proteïne 45 C-alpha. Na het voltooien van de identificatie van langeafstandscontacten worden de restraints geclassificeerd als eenduidig of ambigu, en als intra- of intermoleculair. De lijsten met restraints die moeten worden voorbereid voor de structurele modellering zijn opgenomen in het protocol.Handleidingen voor structurele modellering met behulp van verschillende programma's zijn online te vinden. Solid state NMR-gegevens, zowel op zichzelf als in combinatie met complementaire gegevens, kunnen de determinatie van de structuur op atomair niveau van supramoleculaire complexen mogelijk maken. De voordelen van solid state NMR zijn enerzijds de mogelijkheid om zowel informatie over de secundaire structuur als atomaire afstandbeperkingen van intramoleculaire interfaces te verkrijgen, die in het modelleringsproces kunnen worden geïntegreerd.Aan de andere kant ligt de unieke eigenschap van vaste-stof NMR-spectroscopie in het vermogen om atomaire afstandbeperkingen te verzamelen bij intermoleculaire interfaces van intacte supermoleculaire assemblages. De detectie en het onderscheid tussen intra- en intermoleculaire toewijzingen van beperkingen kan echter een tedious proces zijn en vereist doorgaans de bereiding van selectief C13-gelabelde monsters. Met nieuwe ontwikkelingen in selectieve labelingsstrategieën, het ontwerp van spectrometerhardware en vaste-stof NMR-methodologieën is de techniek echter steeds vaker in staat om haar theoretische potentieel te benutten door moleculaire informatie op atomair niveau te verschaffen, zonder beperkingen wat betreft objectgrootte, langeafstandsorde of kristalliniteit.Deze methode stelt ons in staat om de atomaire structuur van biomoleculaire assemblages te bestuderen. Het is zeer belangrijk om het monster zorgvuldig voor te bereiden om de NMR-condities te optimaliseren en zo gegevens met een hoge resolutie te verkrijgen. Met dit protocol kunnen we atomaire resoluties bereiken die informatie verschaft over eiwitassemblages.En deze techniek kan worden gecombineerd met andere technieken in de structurele biologie om driedimensionale modellen te verkrijgen.

atomic-scale-structural-studies-macromolecular-assemblies-solid-state

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

This video describes the nuclear magnetic resonance spectroscopy technique to study protein-protein interactions between 15N-labeled wild-type and mutant envoplakin proteins and the unlabeled vimentin protein. The successful interaction between wild-type envoplakin and vimentin leads to extensive line broadening and peak disappearance in the NMR spectra, whereas the absence of an interaction between the mutated envoplakin and vimentin results in well-resolved peaks in the NMR spectra.

Nuclear Magnetic Resonance to Study Atomic Level Protein-Protein Interactions

De NMR-oplossingsstructuur van een metallochaperone modelpeptide met Cu (I) werd bepaald, en een gedetailleerd protocol van monstersvoorbereiding en 1D en 2D dataverzameling tot een driedimensionale structuur wordt beschreven.

Structuur- en coördinatiebepaling van peptide-metaalcomplexen met behulp van 1D en 2D 1H NMR

Hier presenteren we een protocol om te beschrijven van ex situ en in situ onderzoeken van structurele transformaties in metalen bril. Wij dienst nucleaire gebaseerde analysemethoden die hyperfine interacties keuren. We tonen de toepasselijkheid van Mössbauer spectrometrie en nucleaire voorwaartse verstrooiing van synchrotronstraling tijdens temperatuur gestuurde experimenten.

Methoden van Ex Situ en In Situ onderzoeken van structurele transformaties: het geval van kristallisatie van metalen bril

Hier presenteren we hoe kleine Angle X-Ray Scattering (SAXS) kan worden gebruikt om informatie op lage resolutie enveloppen die vertegenwoordigen de macromoleculaire structuur te verkrijgen. Wanneer gebruikt in combinatie met hoge resolutie structurele technieken zoals röntgendiffractie en nucleaire magnetische resonantie, bieden SAXS gedetailleerde inzichten in multidomain eiwitten en macromoleculaire complexen in-oplossing.

Structurele Studies van macromoleculen in oplossing met behulp van kleine Angle X-Ray Scattering

Een protocol voor het voorbereiden van 13C,15N-geëtiketteerden schimmel en plant monsters voor multidimensionale Solid state NMR spectroscopie en dynamische nucleaire polarisatie (DNP) onderzoeken wordt gepresenteerd.

Voorbereiding van schimmel en plantaardig materiaal voor structurele opheldering met behulp van dynamische nucleaire polarisatie Solid state NMR

De moleculaire structuren en dynamiek van vaste stoffen, vloeistoffen, gassen en mengsels zijn van cruciaal belang voor verschillende wetenschappelijke gebieden. Hoge temperatuur, hoge druk in situ MAS NMR maakt detectie van de chemische omgeving van bestanddelen in gemengde fase systemen onder strak gecontroleerde chemische omgevingen mogelijk.

Hoge temperatuur en hoge druk in situ magische hoek spinnen nucleaire magnetische resonantie spectroscopie

Een protocol voor de toepassing van paramagnetische relaxatieverbetering NMR-spectroscopie om zwakke en voorbijgaande inter- en intramoleculaire interacties in intrinsiek ongeordende eiwitten te detecteren, wordt gepresenteerd.

Paramagnetische relaxatieverbetering voor het detecteren en karakteriseren van zelfassociaties van intrinsiek ongeordende eiwitten

Neutronenbackscattering spectroscopie biedt een niet-destructieve en labelvrije toegang tot de ps-ns dynamiek van eiwitten en hun hydratatiewater. De workflow wordt gepresenteerd met twee studies over amyloïde eiwitten: over de tijd-opgeloste dynamiek van lysozym tijdens aggregatie en over de hydratatiewaterdynamiek van tau op vezelvorming.

Neutronenspectroscopie met hoge resolutie om picoseconde-nanosecondedynamiek van eiwitten en hydratatiewater te bestuderen

Nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie kan de structurele eiwitdynamica op een residuspecifieke manier karakteriseren. We bieden een hands-on protocol voor het opnemen van NMR 15N, R1 en R2 relaxatie en {1H}-15N heteronucleair Overhauser effect (hetNOE) experimenten, gevoelig voor de picoseconden tot nanoseconden tijdschaal.

NMR 15N relaxatie-experimenten voor het onderzoek van de picoseconde tot nanoseconde structurele dynamica van eiwitten

We beschrijven hier een methode om meerdere fosforylaties van een intrinsiek ongeordend eiwit te identificeren door middel van Kernspinresonantiespectroscopie (NMR), met behulp van het Tau-eiwit als casestudie. Recombinant Tau wordt isotopisch verrijkt en gemodificeerd in vitro door een kinase voorafgaand aan gegevensverwerving en analyse.

Nucleaire magnetische resonantie spectroscopie voor de identificatie van verschillende fosforyleringen van intrinsiek ontvouwen eiwitten

Leer hoe je atomaire structuren van onoplosbare en niet-kristallijne supramoleculaire eiwitassemblages bestudeert met behulp van magic-angle spinning solid-state NMR-spectroscopie.

Atoomschaal structurele Studies van macromoleculaire samenstellen door Solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (Video) | JoVE Journal

Atoomschaal structurele Studies van macromoleculaire samenstellen door Solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie

Meer video's verkennen