Tweerichtings retrovirale integratie site PCR methodologie en kwantitatieve data analyse werkstroom
14 juni 2017
Dit manuscript beschrijft de experimentele procedure en software analyse voor een bidirectionele integratie site analyse die tegelijkertijd upstream en downstream vector-host junction DNA kan analyseren. Bidirectionele PCR producten kunnen worden gebruikt voor elk downstream sequencing platform. De resulterende gegevens zijn bruikbaar voor een high-throughput, kwantitatieve vergelijking van geïntegreerde DNA-doelen.
Het algemene doel van deze procedure is om retrovirale vector-integratieplaatsen in het gastheergenoom te identificeren en de relatieve frequenties van clonale celpopulaties die elke plaats delen te kwantificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in retrovirale gentherapie, zoals welk deel van het gastheergenoomvector is geïntegreerd, hoe een genetisch gemanipuleerde cel zich na de transplantatie zal herbevolken, en hoe ze functioneel verschillen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat retro-integratieplaatssequenties met hogere nauwkeurigheid en gevoeligheid kunnen worden geanalyseerd door zowel stroomopwaartse als stroomafwaartse vector-gastheer DNA-verbindingen gelijktijdig te sequencen.
Hoewel deze methode inzicht kan geven in de veiligheid van vectoren en genetisch gemanipuleerde cellen in gentherapiestudies, kan deze ook worden toegepast op andere fundamentele biologiestudies om het gedrag van individuele cellen in vivo te onderzoeken. De eerste stap in deze procedure is om de DNA-concentratie en de verhouding van de absorptie bij 260 en 280 nanometer van het te analyseren genomisch DNA te bepalen. Hierna verdunt u een tot twee microgram van de monster genomisch DNA tot een eindvolume van 170 microliter genomisch DNA-oplossing met nucleasevrij water.
Bereid een 200 microliter PCR-reactie voor door de volgende componenten in een microcentrifugebuis te mengen. 2,5 microliter van elk van de HIV-1-specifieke biotine-primers, of een totaal van 10 microliter voor vier lentivirus-specifieke primers, 20 microliter van 10X thermostabiel DNA-polymerasebuffer, vier microliter van 10 millimolar dNTP's, drie microliter van thermostabiele DNA-polymerase, en 163 microliter van genomisch DNA. Verdeel de oplossing gelijkmatig in vier PCR-buisjes en voer een enkele extensiecyclus uit onder de volgende voorwaarden.
94 graden Celsius gedurende 5 minuten, 56 graden Celsius gedurende 3 minuten, 72 graden Celsius gedurende 5 minuten en 4 graden C voor opslag. Verzamel alle vier PCR-reacties in een twee milliliter microcentrifugebuis. Volg de procedure van de fabrikant van een PCR-zuiveringskit en elueer met 50 microliter elutiebuffer.
Bereid een 100 microliter-digestie voor door de volgende componenten toe te voegen aan een microcentrifugebuis. 50 microliter DNA, 10 microliter van 10X buffer A, twee microliter van RSAI-enzym en 38 microliter van nuclease-vrij water. Incubeer gedurende één uur bij 37 graden Celsius in een thermische cycler.
Voeg vervolgens één microliter van CviQI-enzym toe aan de reactie en incubeer gedurende 30 minuten bij 25 graden Celsius. Wanneer de RSAI en CviQI-digestie voltooid is, ga onmiddellijk door met het afronden van de uiteinden. Bereid een 4,5 microliter-mengsel voor dat 2,5 microliter DNA-polymerase I, Large Fragment, en 2 microliter van 10 millimolar dNTP's bevat.
Breng 1 microliter van het mengsel over naar het DNA-monster. Het totale volume zal 102 microliter zijn. Meng goed door te vortexen en incubeer gedurende één uur bij 25 graden Celsius.
Ga onmiddellijk verder met streptavidine-kraalbinding wanneer de incubatie voltooid is. Bereid de streptavidine-kralen voor door de kraaloplossing kort te vortexen en 50 microliter over te brengen naar een nieuwe twee milliliter microcentrifugebuis. Verwijder het supernatant met behulp van een magnetische stand en was de kralen met 200 microliter bindingsoplossing.
Resuspendeer de kralen in 100 microliter bindingsoplossing en plaats de buis weg van de magnetische stand. Breng 100 microliter van het monster-DNA over naar de 100 microliter resuspendeerde kraaloplossing en meng voorzichtig door te pipetteren om schuimen van de oplossing te voorkomen. Incubeer de buis gedurende 3 uur op kamertemperatuur op een roterende wiel.
Gebruik de magnetische stand om de kralen te vangen en gooi het supernatant weg. Was de kralen twee keer in 400 microliter wasoplossing en twee keer in 400 microliter 1X T4 DNA-ligasebuffer. Resuspendeer de kralen in 200 microliter 1X T4 DNA-ligasebuffer en plaats deze weg van de magnetische stand.
De linker-ligatie moet onmiddellijk na de streptavidine-kraalbinding worden uitgevoerd. Bereid een 400 microliter ligatiereactie-oplossing voor door de volgende componenten in een twee milliliter microcentrifugebuis te mengen. 0,5 microliter van de DNA-linker, 10 microliter van 10X T4 DNA-ligasebuffer, 20 microliter van 5X T4 DNA-ligasebuffer, 5 microliter van T4 DNA-ligase, 164,5 microliter van nucleasevrij water en 200 microliter van de gesuspendeerde kralen.
Plaats de reactiebuis op een roterende wiel bij kamertemperatuur gedurende 3 uur. Was de kralen twee keer met de wasoplossing en twee keer met 1X thermostabiele DNA-polymerasebuffer. Resuspendeer de kralen in 50 microliter 1X thermostabiele DNA-polymerase PCR-buffer en plaats deze weg van de magnetische stand.
Om deze procedure te starten, bereid een 200 microliter PCR-reactie voor door de volgende componenten toe te voegen aan de gesuspendeerde kralen. 10 microliter van een 1L-primer, 10 microliter van een 1R-primer, 20 microliter van primer Link1, 10 microliter van 10X thermostabiele DNA-polymerasebuffer, vier microliter van 10 millimolar dNTP's, acht microliter van thermostabiele DNA-polymerase, en 88 microliter van nucleasevrij water. Verdeel de reactiemix in vier PCR-buisjes en voer PCR uit onder de volgende voorwaarden.
94 graden Celsius gedurende 2 minuten, 25 cycli van 94 graden Celsius gedurende 20 seconden, 56 graden Celsius gedurende 25 seconden, en 72 graden Celsius gedurende twee minuten, en een laatste extensie bij 72 graden Celsius gedurende 5 minuten. Verzamel alle vier PCR-reacties in een 2 ml microcentrifugebuis. Volg de procedure van de PCR-zuiveringskit en elueer met 50 microliter elutiebuffer.
Bepaal de DNA-concentratie en de verhouding van de absorptie bij 260 en 280 nanometer met behulp van een UV-zichtbaar spectrofotometer. Het DNA kan nu worden opgeslagen bij min 20 graden Celsius tot het klaar is voor de volgende stap. Aangezien de procedures voor de linker- en recht
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit manuscript beschrijft een methode voor het identificeren van integratieplaatsen van retrovirale vectoren in het genoom van de gastheer en het kwantificeren van clonale celpopulaties. De techniek maakt gelijktijdige analyse mogelijk van het upstream en downstream vector-gastheer-junction DNA, wat inzicht geeft in de veiligheid van gentherapie en het gedrag van individuele cellen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Gentherapie
- Genomica
Achtergrond
- Retrovirale gentherapie omvat het integreren van vectoren in gastheergenomenen.
- Het begrijpen van integratieplaatsen is cruciaal voor het beoordelen van de veiligheid en werkzaamheid.
- Huidige methoden vertonen onvoldoende gevoeligheid bij het analyseren van integratieplaatsen.
- Deze studie introduceert een bidirectionele assay voor integratieplaatsen.
Doel van de studie
- Om retrovirale vectorintegratieplaatsen nauwkeurig te identificeren.
- Om de frequenties van clonale celpopulaties die integratieplaatsen delen te kwantificeren.
- Om het begrip van het gedrag van genetisch gemodificeerde cellen na transplantatie te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Bepaal de DNA-concentratie en de absorbantieverhoudingen.
- Bereid genomische DNA-monsters voor op analyse.
- Voer bidirectionele PCR uit om integratieplaatsen te amplificeren.
- Sequenceer PCR-producten voor gedetailleerde analyse.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle identificatie van integratieplaatsen met een hoge nauwkeurigheid.
- Kwantitatieve gegevens over clonale populaties verkregen.
- Inzichten in de veiligheid van retrovirale vectoren bij gentherapie.
- Potentiële toepassingen in fundamentele biologische studies.
Conclusies
- De bidirectionele integratieplaats-assay verbetert de analyse van integratieplaatsen.
- Deze methode kan bijdragen aan veiligheidsbeoordelingen in gentherapie.
- Het biedt een kader voor het bestuderen van het gedrag van individuele cellen in vivo.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Nauwkeurige identificatie en kwantificering van integratieplaatsen van retrovirale vectoren zijn essentieel voor het beoordelen van de veiligheid en effectiviteit van gentherapieën. Deze bidirectionele assay verhoogt de detectiegevoeligheid en de reproduceerbaarheid van gegevens, waardoor een betrouwbare karakterisering van clonale stamcelpopulaties mogelijk wordt. De methode ondersteunt preklinische risicoreductie door kwantitatieve inzichten te verschaffen in clonale dynamiek en voorkeuren voor integratieplaatsen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door vectorintegratieplaatsen te koppelen aan regio's van het gastgeenoom.
- Operationele waarde: Biedt functionele validatie van targets via clonale kwantificering en analyse van repopulatiepatronen.
- Voorspellende betrouwbaarheid: Ondersteunt de triage van portfolio's door integratiegebeurtenissen te identificeren die geassocieerd zijn met genotoxisch risico of gunstige expressieprofielen.
Screening en assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde high-throughput gegevens over integratieplaatsen voor downstream screeningstoepassingen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid van assays en de detectiesnelheden door bidirectionele sequencing van vector-gastheerverbindingen.
- Hergebruik van platform: Maakt schaalbare clonale tracking mogelijk over meerdere monsters en tijdspunten in preklinische studies.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Demonstreert de relevantie voor de ziekte door longitudinale tracking van hematopoëtische stamcelclonen in primaatmodellen.
- Operationele waarde: Waarborgt translationele continuïteit door integratiedata uit de ontdekkingsfase te koppelen aan functionele repopulatie-uitkomsten.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Onderbouwt go/no-go-beslissingen door clonale heterogeniteit en verrijking van integratieplaatsen in genen versus repetitieve elementen te kwantificeren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De bidirectionele integratieplaats-assay past binnen het continuüm van discovery tot preklinisch onderzoek en ondersteunt hypothesetoetsing in de vroege discoveryfase, de gereedheid van assays bij screening en mechanistisch risicomanagement in translationeel onderzoek.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten door vectorintegratieplaatsen te identificeren en hun biologische significantie in gastheergenomen te beoordelen.
- Screening: Maakt assays gereed via gestandaardiseerde workflows voor PCR-amplificatie, ligatie en sequenering met kwantitatieve clonale output.
- Analytiek: Maakt vergelijkende analyse mogelijk via een computationele pipeline die integratieplaatsen koppelt aan het referentiegenoom en sequencingfouten corrigeert.
- Translationeel onderzoek: Legt een verbinding met preklinische continuïteit door clonale repopulatiepatronen aan te tonen in rhesusmacaquen na transplantatie van hematopoëtische stamcellen.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Fungeert als een herbruikbare capaciteit voor longitudinale clonale tracking over meerdere gentherapie-kandidaten en ziektemodellen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door mechanische ambiguïteit in vectorintegratie en klonale gedragingen te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van de analyse van integratieplaatsen tussen laboratoria.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door het verstrekken van kwantitatieve gegevens over de klonale frequentie gekoppeld aan veiligheidsprofielen van de integratieplaats.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van gentherapie-kandidaten mogelijk op basis van klonale dominantie en het risico op genotoxiciteit van de integratieplaats.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in moleculaire biologie, PCR-optimalisatie en data-analyse van next-generation sequencing.
- Afhankelijk van toegang tot thermocyclers, zuiveringssystemen met magnetische beads, capillaire elektroforese en sequencingplatforms.
- Necessiteert cross-team standaardisatie van de kwaliteit van de DNA-input, controles voor enzymactiviteit en bio-informatica-pipelines.
- Moet rekening houden met variabiliteit in de detectie van de integratieplaats op basis van de keuze van het restrictie-enzymmotief (bijv. GTAC vs TCGA) en de daarmee gepaard gaande overschatting van de clonale frequentie.
- Beperkt door de PCR-gevoeligheid en potentiële contaminatierisico's tijdens de meerstaps bead-gebaseerde zuiverings- en ligeringsfasen.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
12:09
Conclusion
10:23
Results: The IS Bidirectional Assay Improves Detection Rates and Sequence Quantification Accuracy
1:11
LTR-specific Biotin-primer Extension
2:53
Rsal and CviQI Digestion and Blunt-ending
4:12
Straptavidin Bead Binding
5:31
Linker Ligation
6:39
Pre-amplification of Both Left and Right Junction DNA
8:15
Left- and Right-junction-specific Amplifications
