Uitbreiding en Adipogenese Inductie van Adipocyt Progenitors van Perivasculaire Adipose Weefsel Geïsoleerd door Magnetische Geactiveerde Cell Sorting

De algemene doelen van deze isolatie- en differentiatieprotocollen zijn om adipocyten-voorlopercellen te verkrijgen uit perivasculare vetweefsels en om hun differentiatie in volwassen adipocyten te induceren. Deze methode maakt de analyse mogelijk van specifieke en gedefinieerde adipocyten-voorlopercelpopulaties uit perivascular vetweefsel, met minimale impact op hun morfologie, levensvatbaarheid en potentieel om te prolifereren en te differentiëren. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een verhoogde isolatie van antigeen-presenterende cellen per gram vetweefsel mogelijk maakt, vergeleken met fluorescentie-geactiveerde celsortering.

Na bevestiging van een gebrek aan reactie op teenprik, maak een verticale middenlijn incisie langs het borstbeen tot aan het perinale gebied van de rat, om toegang te krijgen tot de buikholte. Blootstel de superieure mesenterische slagader, de kleine mesenterische weerstandvaten en de thoracale aorta, en snijd alle verbindingen naar het mesenterium en de aorta door. Verzamel het gonadale vetweefsel en breng de geïsoleerde vetkussens over in een nieuwe container met Krebs-Ringer bicarbonaat buffer, of KRBB-oplossing, aangevuld met 10 millimolaren hoopjes.

Breng de vaten over naar een petrischaal met KRBB-oplossing en plaats de schotel onder een dissectiemicroscoop. Verwijder perivascular vetweefsel van de kleine mesenterische weerstandvaten en aorta. Breng in een bioveiligheidskast ongeveer 50 milligram weefsel over naar een 1,7 milliliter buis met 1 milliliter collagenase type I-oplossing en hak het weefsel in stukken van 1 tot 3 millimeter.

Het is belangrijk om het vetweefsel voldoende te hakselen om de collagenase toe te laten het bindweefsel volledig te infiltreren. Incubeer de fragmenten bij 37 graden Celsius met schudden gedurende 1 uur. Filter vervolgens het verteerde materiaal achtereenvolgens door individuele 100- en 40-micron celfilters in een 50-milliliter buis.

Verzamel het resulterende filtraat door centrifugatie en resuspendeer de pellet in 1 milliliter erytrocyt lysis buffer. Breng de celsuspensie over in een nieuwe 1,7 milliliter Microfuge buis voor een incubatie van 5 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Verzamel vervolgens de stromale vasculaire fractie cellen met een andere centrifugatie en resuspendeer de pellet in stromale vasculaire fractie basaal medium voor telling.

Om de adipocyten-voorlopercellen te isoleren door magnetisch-geactiveerde celsortering, verzamel de cellen door centrifugatie en resuspendeer de pellet in magnetisch-geactiveerde celsortering blokkeringsbuffer bij een concentratie van 1 maal 10 tot de 6e cellen per milliliter gedurende een incubatie van 20 minuten bij 4 graden Celsius. Het is essentieel dat alle stappen van de isolatie bij 4 graden Celsius worden uitgevoerd, en niet boven ijs. Incubeer vervolgens de cellen met 5 microliter FITC-geconjugeerd muis anti-CD34 gedurende 30 minuten.

Verzamel de cellen door centrifugatie. Incubeer vervolgens de cellen met 4 microliter anti-FITC MicroBeads in 96 microliter magnetisch-geactiveerde celsortering buffer gedurende 5 minuten in het donker. Terwijl de cellen incuberen, plaats een multi-sort kolom in de magnetische separator met een afvalbuis van 5 milliliter onder de kolom.

Spuit de kolom met 500 microliter magnetisch-geactiveerde celsortering buffer en gooi de effluent en afvalbuis weg. Plaats vervolgens een nieuwe buis onder de kolom en laad de cellen op de bovenkant van de kolom, waarbij de ongelabelde CD34 negatieve cellen in de nieuwe verzamelbuis worden verzameld. Wanneer alle cellen door de bovenkant van de kolom zijn gepasseerd, was de kolom 3 keer met 500 microliter ontgaste magnetisch-geactiveerde celsortering buffer, waarbij het eluaat in de verzamelbuis blijft worden verzameld.

Na de laatste wassing, breng de kolom over in een nieuwe verzamelbuis en gebruik de kolomplunger om 1 milliliter magnetisch-geactiveerde celsortering buffer door de kolom in de buis te spoelen om de CD34 positieve cellen te verzamelen. Verzamel de adipocyten-voorlopercellen door centrifugatie. Incubeer vervolgens de CD34 positieve fractie in 10 microliter konijn anti-plaatjes-afgeleide groeifactor receptor alfa gedurende 30 minuten.

Aan het einde van de incubatie, centrifugeer de cellen opnieuw en incubeer de pellet in 4 microliter anti-konijn IgG MicroBeads in 96 microliter magnetisch-geactiveerde celsortering buffer voor magnetische parelkettingisolatie van de plaatjes-afgeleide groeifactor receptor alfa positieve cellen, zoals zojuist is aangetoond. Om de CD34 positieve plaatjes-afgeleide groeifactor receptor alfa positieve adipocyten-voorlopercellen te kweken, zaai de cellen in afzonderlijke 6-well weefselkweek platen in basaal medium en plaats de platen in een 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide celkweek incubator. Na 3 seriële passages, zaai de cellen in zwarte 96-well weefselkweek platen bij 1 maal 10 tot de 2 cellen per well en evalueer hun proliferatie op 8, 24, 48 en 96 uur bij 5 maal 10 tot de 4 cellen per well, in 24-well assay platen, volgens standaard proliferatie assay protocollen.

Om adipogenese te induceren, wanneer de adipocyten-voorlopercelcultuur confluentie bereikt, voed de cellen met adipocyten-voorloper basaal medium gedurende 48 uur en behandel vervolgens de culturen met botmorfogenetisch eiwit 4 gedurende nog eens 48 uur. Op de derde dag, vervang het medium met adipocyten-voorlopercel inductiemedium, zonder IBMX en eexamethasone gedurende 14 dagen. De mate van adipogenese in de culturen kan vervolgens worden beoordeeld bij 1 maal 10 tot de 4 cellen per well in 48-well weefselkweek platen, volgens standaard adipogenese assay protocollen.

Hoewel beide methoden een vergelijkbare celpopulatiedistributie en levensvatbaarheid laten zien, produceert magnetisch-geactiveerde celsortering isolatie een groter aantal cellen voor kweek, vergeleken met fluorescentie-geactiveerde celsortering. In dit representatieve experiment werd de in vitro proliferatie van magnetisch-geactiveerde cel gesorteerd stromale vasculaire fractie en adipocyten-voorlopercellen, geïsoleerd uit de thoracale aorta, kleine mesenterische weerstandvaten en gonadale vetweefsel van mannelijke ratten, geëvalueerd bij