Monitoring ER / SR Calciumvrijstelling met de gerichte Ca ²⁺ Sensor CatchER ⁺

Het algemene doel van dit experiment is om onze protocollen weer te geven voor de cultuur en transfectie van HEK293 en C2C12 cellen met CatchER plus en de toepassing ervan voor het monitoren van ERSR receptor-gemedieerde calcium-transienten bij de meting van de NC2KD. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over calciumsignalering en beeldvorming, zoals de basale calciumconcentratie en de snelle veranderingen in de ERSR van specifieke cellen en hoe biosensor CatchER plus voor deze metingen kan worden toegepast. Het grote voordeel van deze techniek is dat de fluorescentierespons van enkele cellen in realtime met snelle kinetica kan worden geregistreerd.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar de diagnose van ERSR calcium-gerelateerde ziekten omdat CatchER plus abnormale calcium-transienten in deze organellen kan monitoren die ontstaan door disfunctionele calcium-signaleringselementen. De visuele demonstratie voor deze methode is cruciaal, omdat de stapsgewijze cellentransfectie en fluorescentiebeeldvorming moeilijk te leren zijn omdat celcultuur en microscopie meerdere foutenbronnen hebben. De procedure zal worden gedemonstreerd door Florence Reddish, een post-doc uit ons laboratorium.

Om dit experiment te beginnen, zaai HEK293 cellen op gesteriliseerde glazen microscoopglazen in de zes centimeter schalen en kweek ze één tot twee dagen totdat ze op de dag van de transfectie ongeveer 70% confluent zijn. Vervolgens leegt u DMEM uit de schaal en voegt u drie milliliter van het verminderde serummedium toe. Voeg dan het DNA-transfectie reagens mengsel toe aan de schaal en incubeer gedurende vier tot zes uur bij 37 graden Celsius.

Transfectie van HEK293 cellen is over het algemeen eenvoudiger dan andere cellijnen, maar de cellen zijn minder veerkrachtig tegen barre omstandigheden. Daarom is het belangrijk om ze slechts vier tot zes uur bloot te stellen aan transfectiereagentia om apoptose te voorkomen. Na vier tot zes uur wast u de cellen met vijf tot zes milliliter HBSS.

Gooi de HBSS uit de schaal en vervang deze door drie milliliter vers DMEM. Vervolgens incubeer de cellen gedurende 48 uur bij 37 graden Celsius om de expressie van GECI toe te staan. Voor C2C12 myoblast cellen, trypsiniseer de cellen door één tot twee milliliter trypsine toe te voegen om de bodem van de schaal te bedekken.

Plaats vervolgens de schaal in een 37 graden Celsius incubator gedurende twee tot zes minuten om het trypsine de cellen van de bodem van de schaal te laten losmaken. Zodra de incubatie voltooid is, verwijdert u het trypsine en aspireert u de cellen in acht milliliter DMEM. Pipetteer de cellen grondig met DMEM om de cellen gelijkmatig te verdelen en opnieuw op te suspenderen.

Zaai ze vervolgens op de steriele dekglasjes in zes centimeter kweekschalen en voeg vervolgens drie milliliter DMEM toe om een ​​uiteindelijke confluentie van 60% te bereiken. Vervolgens transfecteert u de cellen op dezelfde dag. Incubeer ze gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius. Na incubatie wast u de cellen met vijf tot zes milliliter HBSS.

Gooi de HBSS uit de schaal en vervang deze door drie milliliter vers DMEM. Vervolgens incubeert u ze gedurende 48 uur bij 37 graden Celsius om de expressie van de GECI toe te staan. Zet in deze procedure de microscoop en lichtbron aan en open vervolgens het eenvoudige PCI-programma.

Bedek met een wattenstaafje de bodem van de laagprofiel open-diamant bad beeldvormingskamer met een dunne laag sealant. Neem vervolgens een schuifje met de getransfecteerde cellen uit de incubator en spoel het voorzichtig drie keer met ongeveer één milliliter Ringer's buffer met 10 millimolair glucose en 1,8 millimolair calcium voorverwarmd tot 37 graden Celsius. Laat ongeveer één milliliter Ringer's buffer in de schaal achter om te voorkomen dat de cellen uitdrogen en gebruik een pincet om de schuif uit de schaal te halen.

Absorbeer overtollig oplossing door de rand van de schuif aan te raken met een laboratoriumdoekje. Plaats het vervolgens op de zijkant van de kamer met de cellen naar de vet. Bevestig vervolgens de kamer op de podiummontage met een schroevendraaier.

Voeg ongeveer één milliliter Ringer's buffer toe aan de kamer om te voorkomen dat de cellen uitdrogen terwijl deze op het podium wordt gemonteerd en de microscoopopstelling wordt voltooid. Schakel het microscoopobjectief naar het 40 keer olie-immersie objectief. Voeg een druppel van de immersie olie toe aan het objectief.

Plaats vervolgens de montage op het microscooppodium. Plaats vervolgens de vacuümtip in de kamer om het oplossingsniveau gelijkmatig te houden en te voorkomen dat deze overvuld raakt. Verhoog vervolgens het objectief met behulp van de grove aanpassing totdat het olie op het objectief de bodem van de schuif raakt.

Gebruik de lichtveldmodus, pas de versterking aan op 175 en de belichtingstijd op 0,03 seconden om de cellen te focussen. Zodra de cellen scherp staan, schakelt u over naar de fluorescentiemodus met 488 nanometer excitatie en wijzigt u de belichtingstijd in 0,07 seconden. Zoek een gezichtsveld dat voldoende gezonde cellen heeft met voldoende fluorescentie voor beeldvorming.

Neem vervolgens foto's in fluorescentie- en lichtveldmodus. Cirkel een gebied van belang in de cellen of cirkel de hele cel om de intensiteit van het gekozen gebied te registreren. Start nu de intensiteitsmeting met een framefrequentie ingesteld op één om de vijf seconden.

Laat de basislijnintensiteit 20 tot 30 frames stabiliseren. Bereken vervolgens de hoeveelheid 4-CMC die nodig is vanuit een 20 millimolair voorraad op basis van het uiteindelijke kamervolume van 450 microliter om een ​​uiteindelijke concentratie van 200 micromolair te bereiken. Breng vervolgens voorzichtig 60 microliter Ringer's buffer over vanuit de kamer naar een microcentrifugebuis.

Verdun de berekende hoeveelheid 4-CMC met deze oplossing en voeg deze terug toe aan de kamer om het beoogde antwoord van de geïmageerde cellen op te roepen. Laat de