Het omgekeerde hartmodel voor de interstitiële transudate-collectie van het Geïsoleerde Rat Hart

Het algemene doel van dit omgekeerde hartmodel is om cardiaal interstitieel transudaat te verzamelen van een geïsoleerd rattenhart. Binnen het kloppende hart geeft de individuele zin van het hart paracriene factoren af en deze worden vrijgelaten in de omringende interstitiële vloeistofruimte. Dit is belangrijk, omdat de interstitiële vloeistofruimte informatie draagt voor de communicatie tussen de hartcellen.

En dat is vooral belangrijk onder omstandigheden van ontsteking en regeneratie van het geïnfargeerde myocardium. In deze video zullen mijn medewerkers, Dr.Ding en Tan, u de technieken laten zien waarmee we hier, in deze ooh-liefde, interstitiële vloeistof verzamelen van het oppervlak van een geïsoleerd geperfundeerd rattenhart. Om de latexhartafdekking, of dop, te maken, heb je een aluminium mal die overeenkomt met de gemiddelde grootte van een rattenhart en die is gepolijst met superfijn schuurpapier.

Bevestig verticaal de hals van de mal aan de freesmachine en begin langzaam de mal te draaien. Giet vervolgens 20 milliliter vloeibare latex in een glasbeker van 50 milliliter en laat de roterende mal in de latex zakken tot hij is ondergedompeld. Til het dan langzaam uit en blijf de mal 15 minuten draaien tot de latex is gestold.

De rotatie is essentieel om deze mousse te maken en om een gelijkmatige laag vloeibare latex op het oppervlak van de mal te verdelen. Zorg er dus voor dat de mal draait terwijl deze uit de latex wordt getild. Zodra de latex droog is, bedek de latex met talkpoeder om schade aan de latex te voorkomen.

Stop de rotatie en maak de mal voorzichtig los van de machine. Verwijder voorzichtig de latex van de mal. Bevestig nu een 25 centimeter lange siliconen slang aan de uitlaat op de latexdop.

Deze buis wordt gebruikt om de interstitiel cardiale transudaat, of CT, te verzamelen. Bevestig vervolgens de rattenmaat ventrikelballon stevig aan een L-vormige metalen canule, verbonden met een spuit gevuld met één milliliter water. En vul de rattenmaat ventrikelballon met water. Zorg ervoor dat de ballon luchtdicht is door hem meerdere keren op te blazen en te leegmaken met behulp van de spuit.

Verbind vervolgens de canule met een druktransducer via een driewegstop. Maak ten slotte een merkteken op de spuit waar de ballon de ventrikelholte zal vullen voor de meting van de intraventriculaire druk. Voordat u doorgaat met de voorbereiding van het hart, bereidt u het Langendorff-perfusiesysteem voor volgens het tekstprotocol.

Nu, na het volledig verdoven van een mannelijke Wistar-rat van 300 tot 350 gram, brengt u deze over naar een operatietafel op kamertemperatuur. Met ervaring zouden de volgende stappen die leiden tot het canuleren van het hart slechts ongeveer drie minuten moeten duren. Til de huid en spier net onder het borstbeen op met behulp van een pincet en snijd rond de onderrand van de ribben met een zwaar schaar.

Maak vervolgens met een fijne schaar een kleine snede in het diafragma bij de ribrand. Snijd vervolgens de ribben naar de staart toe om een flap van de hele ventrale borstwand te maken. Neem nu voorzichtig het hart vast en til het langzaam op tot de hartvaten beginnen te strekken.

Vervolgens verwijdert u het hart tot de aorta volledig is blootgelegd en brengt u het hart over in een beker van 100 milliliter die 50 milliliter ijskoud KHB bevat. Neem het hart nu onmiddellijk naar het perfusieapparaat en bevestig de aorta aan een druipende canule. Bevestig deze stevig met een 4-0 hechtdraad, zodat er geen luchtbellen in het hart kunnen komen.

Breng vervolgens een constante perfusiedruk of een perfusiestroom aan. Om de omgekeerde hartopstelling te maken, draait u eerst voorzichtig de aortacanule tot de achterste wand van het hart recht voor u ligt. Knip vervolgens het bindweefsel weg om de opening naar het linker atrium bloot te leggen.

Pak vervolgens voorzichtig het hart vast en draai het ondersteboven. Bevestig het hart aan de voorbereide ventrikelballon, met de ballon ontspannen, en voer het de linker ventrikel in. Het hart is nu mechanisch gestabiliseerd in een rechtopstaande positie, met behulp van de ballonkatheterassemblage als ondersteuning.

Blaas de ballon op totdat deze de hele ventrikelholte vult, door de zuiger naar de vulmarkering te verschuiven. Bevestig het hart zodat er minimale stress op de aortawortel komt. Dit deel van de procedure vergt oefening.

Bekijk nu de meter op de ballon en pas de diastolische druk aan op drie tot vijf millimeter kwik. Er zouden kleine druppeltjes op het epicardium moeten verschijnen als de druk correct is ingesteld. Trek vervolgens voorzichtig de latexdop over het hart.

Zelfs de meest ventrikeloppervlakken moeten bedekt zijn. Controleer voordat u doorgaat op luchtbellen in de dop. Gebruik voorzichtige zuiging vanuit de spuit om eventuele luchtbellen te verwijderen.

Plaats nu het uiteinde van de afvoerbuis 10 centimeter onder het hart. Verzamel het druipende CT in een buis van 1,5 milliliter en houd de buis onder de vier graden Celsius door deze in een 1:1 mengsel van ijs en natriumchloride te bedden. Verzamel tussen 0,15 en 1,5 milliliter CT en bepaal het gewicht van het monster en bevriest het snel in vloeibare stikstof.

Bewaar het bij minus 80 graden Celsius totdat het kan worden verwerkt. Bij retroperfusie van het omgekeerde hartmodel bij een constante druk van 100 centimeter water, kon tussen 1/10 tot 1% van het coronaire veneuze effluent worden verzameld. Het eiwitgehalte van de CT werd gemeten met de BCA-test en bedroeg gemiddeld 1,1 milligram per milliliter.

Eenvoudige gelelektroforese onthulde een breed spectrum van eiwitten. Normale monsters werden vergeleken met monsters van harten die 50 minuten ischemische reperfusion ondergingen met behulp van 2D DIGE. Er werden verschillende eiwitten gevonden die werden opgereguleerd in het CT van de ischemische harten.

Proteomanalyse werd uitgevoerd op de opgereguleerde eiwitten. Purines waren ook van groot belang. Purines zijn cruciale signaal