Een snelle en doeltreffende methode om te ontleden pop vleugels van Drosophila geschikt voor Immunodetections of PCR-testen
30 december 2017
De mogelijkheid om nauwkeurig detecteren afschriften of eiwitten in Drosophila weefsels is essentieel voor de studie van hun overvloed en localisatie gerelateerde aan het ontwikkelingsproces. Hier is de beschrijving van een eenvoudige procedure om te ontleden pop vleugels. Deze vleugels kunnen worden gebruikt als de monsters in verschillende technieken (PCR assay, immunohistochemistry, enz.).
Het algemene doel van deze procedure is een snelle en efficiënte methode om popvleugels van Drosophila te dissecteren, geschikt voor immunodetectie of PCR-assays. De hier beschreven procedure werd ontwikkeld op verzoek van een snelle en efficiënte methode om popvleugelmonsters te verkrijgen die geschikt zijn om PCR-assays of immunodetectieprotocollen uit te voeren. Gebruik een vochtige penseel om de nul-uur APF popa voorzichtig uit de kweekbuisjes te verwijderen en plaats ze in nieuwe buisjes om de ontwikkelingsperiode te voltooien.
Bijvoorbeeld, als je een popa gebruikt die 24 uur APF is, blijft er nog 22 uur over. Na 22 uur, zet de popa over op de microscoopplaat met het dubbelzijdige plakband eraan. Deze overdracht kan worden gedaan met een penseel om schade aan de popa te voorkomen.
De popa moet worden gepositioneerd in een rij met de dorsale zijden omhoog en de cephale uiteinden in dezelfde richting. Hierna de microscoopplaat terugbrengen naar een constante temperatuur en de popa laten voltooien van de juiste ontwikkelingstijd. In dit geval zou dat 24 uur zijn.
De microscoopplaat met het dubbelzijdige plakband zal een tijdelijke dissectieplatform zijn om de popbehuizing te verwijderen. Gedurende de twee uur op de microscoopplaat zal de popbehuizing drogen, waardoor deze gemakkelijk breekbaar wordt met pincetten. De eerste stap in de dissectie is om de popa uit het karkas te verwijderen.
Vervolgens wordt de popa overgebracht naar een andere plaat met dubbelzijdig plakband. Het karkas blijft achter. Deze popa wordt vastgeplakt met de ventrale zijde naar boven, in het midden van het plakband geplaatst.
Voordat de vleugel wordt gesneden, moet de popa worden bedekt met een oplossing volgens de procedure met behulp van immunohistologie. Deze oplossing zal de vleugel bevestigen en vrijmaken van de cuticula. Gebruik pincetten om voorzichtig het operculum uit de popbehuizing te verwijderen.
Breek de behuizing met pincetten, door een lijn te maken langs de zijkant van de popa tot aan het caudale uiteinde. Met de juiste verlichting is het mogelijk om de interne vorm van de popa te visualiseren, waardoor een duidelijke ruimte net boven de scharnier van de popvleugel ontstaat. Deze ruimte dient als gids om de opening uit te voeren zonder de popa te beschadigen.
Naarmate de behuizing lateraal wordt geopend, zal het mogelijk zijn om delen ervan te verwijderen, ze op te pakken bij de open rand en ze naar de tegenoverliggende kant te brengen waar het dubbelzijdige plakband ze vasthoudt. Aan het einde van de dissectie zal de popa bijna naakt zijn. Slechts een stuk van de behuizing zal de achterste punt bedekken.
Met behulp van pincetten, duw voorzichtig het resterende deel van de behuizing naar beneden. Deze beweging zal het binnenste uiteinde van de popa omhoog duwen, waardoor zowel het hoofd als het borststuk in een voorkeurspositie blijven om in het volgende stap vast te blijven zitten. Neem een nieuwe plaat met dubbelzijdig plakband en draai hem om op de popa.
Druk vervolgens lichtjes om de popa aan het plakband te laten plakken en schuif voorzichtig de plaat om de popa van de rest van de behuizingen te verwijderen. Draai de microscoopplaat om. De popa zal op de dorsale zijde plakken op het niveau van hun hoofd- of borstgebied.
Voor gebruik in immunohistologie, bedek de hele naakte popa met 4% paraformaldehyde. Laat na 10 minuten in de bevestigingsvloeistof, met behulp van een schaar, een kleine incisie maken in de scharnierregio van de vleugel of daar vlakbij. Laat de bevestigingsvloeistof het vleugelepitheel bereiken.
Dan, na vijf minuten, scheur met pincetten vanaf de cuticularanden, verbreed het gat en maak de vrijlating van het vleugelepitheel uit de cuticulazak mogelijk. Zodra het vleugetweefsel is vrijgemaakt, laat het 30 minuten in de paraformaldehyde-oplossing liggen om de fixatie te voltooien. De in deze video beschreven dissectiemethode kan worden gebruikt om hoogwaardige monsters van Drosophila-popvleugels uit verschillende ontwikkelingsstadia voor te bereiden voor vele soorten technieken.
Het protocol kan worden uitgevoerd om één popa of meerdere popae tegelijk te dissecteren. Dit helpt om de procedure te versnellen, waardoor het gemakkelijker wordt om een groot aantal gedissekteerde vleugels te bereiken. Om de naakte popa uit de geopende behuizing te verwijderen, is het belangrijk dat de achterste punt klein genoeg is.
Hoewel het mogelijk is om een rij van vier of vijf naakte popae tegelijk te verwijderen, is dit geen relevant punt, omdat degenen die nog aan hun behuizing zijn bevestigd, in volgende stappen kunnen worden verwijderd met behulp van een enkele dubbelzijdige tape. Dit is een confocale afbeelding van een 24 tot 30 uur APF vleugel. De kleuring toont de expressie van het gepatchte eiwit, de canonieke receptor van hedgehog, de kernen en actinefilamenten.
Een soortgelijk dissectieproces kan worden gebruikt om grotere vleugelmonsters te verkrijgen om mRNA te isoleren. Dit mRNA kan worden gebruikt om cDNA te synthetiseren dat kan worden gebruikt in PCR-reacties. Hier laten we de producten zien die zijn verkregen om de expressie van gepatchte en actine te detecteren.
Het protocol biedt een eenvoudige methode voor het verkrijgen van popvleugelmonsters die de vertrouwde morfologie van de vleugel behouden. Uit deze preparaten is het mogelijk om stapels beelden te verkrijgen die als 2D- of 3D-beelden kunnen worden geprojecteerd om de verdeling en/of de verrijking van eiwitten tijdens de differentiatie van de vleugel te onderzoeken. Een soortgelijk protocol kan worden gebruikt om een groot popvleugelmonster te verzamelen dat noodzakelijk is om cDNA te synthetiseren, een molecuul dat essentieel is in PCR-reacties.
Deze procedure biedt een alternatieve en complementaire aanpak voor de reeds gepubliceerde methoden voor popvleugeldissectie.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een snelle en efficiënte methode voor het dissekeren van popvleugels van Drosophila, wat essentieel is voor diverse technieken zoals immunodetectie en PCR-assays. De procedure is erop gericht de studie van transcript- en eiwitlokalisatie tijdens de ontwikkeling te vergemakkelijken.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Genetica
Achtergrond
- Het begrijpen van de lokalisatie van transcripten en eiwitten is cruciaal in ontwikkelingsstudies.
- Drosophila dient als modelorganisme voor genetisch en ontwikkelingsonderzoek.
- Een efficiënte monsterpreparatie is noodzakelijk voor nauwkeurige experimentele resultaten.
- Immunodetectie en PCR zijn veelgebruikte technieken in biologisch onderzoek.
Doel van de studie
- Het bieden van een eenvoudige procedure voor het dissekeren van popvleugels.
- Het verhogen van de efficiëntie bij het verkrijgen van monsters voor immunodetectie en PCR-assays.
- Het ondersteunen van onderzoek naar transcript- en eiwitlokalisatie tijdens de ontwikkeling van Drosophila.
Gebruikte methoden
- Gebruik van een natte penseel om pupae voorzichtig te hanteren.
- Overbrengen van pupae naar microscoopglaasjes met dubbelzijdige tape.
- Het timen van de overdracht op basis van de leeftijd van de pop.
- Minimaliseren van schade aan de pop tijdens het dissectieproces.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt het mogelijk om intacte monsters van popvleugels te verzamelen.
- De verkregen monsters zijn geschikt voor diverse downstream-toepassingen.
- De procedure is snel en minimaliseert de stress op de monsters.
- Vergemakkelijkt nauwkeurige lokalisatiestudies in Drosophila.
Conclusies
- De beschreven methode is effectief voor het dissekeren van popvleugels.
- Het ondersteunt de studie van ontwikkelingsprocessen bij Drosophila.
- De techniek kan worden aangepast aan verschillende experimentele behoeften.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Efficiënte monstervoorbereiding van pupale vleugels van Drosophila maakt betrouwbare detectie van transcript- en eiwitexpressie mogelijk, wat bijdraagt aan doelwitvalidatie en mechanistische risicoreductie in vroege discovery-fasen. Deze methode biedt een snelle, reproduceerbare workflow voor het genereren van hoogwaardig biologisch materiaal dat geschikt is voor downstream-assays, waardoor de variabiliteit in fenotypische screening en assayontwikkeling wordt verminderd. Door de dissectie van vleugels te standaardiseren, kunnen onderzoeksteams het voorspellende vertrouwen in pathway-analyse verbeteren en prioriteit geven aan doelwitten met een sterkere mechanistische rationale.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door gelokaliseerde detectie van eiwitten zoals patched, een canonieke hedgehog-receptor, in ontwikkelend vleugelweefsel.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicovermindering door consistente bemonstering over ontwikkelingsstadia heen mogelijk te maken voor verduidelijking van signaalpaden.
- Voorspellende waarde: Faciliteert de beoordeling van target-interactie en expressiepatronen die essentieel zijn voor de identificatie van lead-verbindingen en portfoliotriage.
Screening & assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert intacte monsters van vleugels in het popstadium die geschikt zijn voor immunodetectie en PCR-assays, wat kwantitatieve read-outs van gen- en eiwitexpressie mogelijk maakt.
- Operationele waarde: Standaardiseert de monstervoorbereiding, waardoor de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid voor high-throughput screeningcampagnes worden verbeterd.
- Assay-gereedheid: Genereert materiaal dat compatibel is met downstream moleculaire analyse, wat betrouwbare evaluatie van verbindingen in fenotypische screens ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Biedt een ziekterevlevant systeem voor het bestuderen van morfogenese, met directe toepasbaarheid op de modellering van ontwikkelingspaden.
- Mechanische risicoreductie: Maakt visualisatie van eiwitdistributie en verrijking tijdens differentiatie mogelijk, wat bijdraagt aan de betrouwbaarheid van het target.
- Preklinische afstemming: Ondersteunt biomarker-beoordeling via detecteerbare expressie van markers zoals actin en patched in het vleugelepithelium.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie via assayontwikkeling tot preklinische evaluatie, en biedt een herbruikbare monsterpreparatietechniek voor studies met Drosophila.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten en pathway-verduidelijking door detectie van communicatie tussen adercellen en de vorming van dwarsaders tijdens de popontwikkeling mogelijk te maken.
- Screening: Levert assay-klare monsters met een consistente morfologie, wat de betrouwbaarheid van immunodetectie en PCR-gebaseerde read-outs verhoogt.
- Analytics: Maakt kwantitatieve meting van transcript- en proteïneniveaus mogelijk, wat bijdraagt aan vergelijkende analyses tussen genetische of experimentele condities.
- Translational Research: Verbindt vroege ontdekkingen met preklinische validatie via geconserveerde ontwikkelingsmechanismen die waarneembaar zijn in de vleugelmorfogenese.
- Enterprise Reuse: Vestigt een gestandaardiseerd dissectieprotocol dat toepasbaar is op meerdere projecten die de ontwikkelingsgenetica van Drosophila bestuderen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door mechanische ambiguïteit in ontwikkelingspaden te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van de monstervoorbereiding, wat bijdraagt aan consistente assayprestaties.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door betrouwbare gegevens te verschaffen over targetexpressie en lokalisatie.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk door kwalitatief hoogwaardigere mechanische gegevens uit reproduceerbare monsters.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist basisexpertise in het hanteren van Drosophila en microscopie.
- Maakt gebruik van standaardinstrumenten: een natte penseel, pincetten, objectglazen met dubbelzijdige tape en 4% paraformaldehyde.
- Vereist nauwkeurige timing op basis van de uren na popvorming (APF) om overeen te komen met de ontwikkelingsstadia.
- Aanpasbaar voor verschillende stadia van vleugelontwikkeling, maar geoptimaliseerd voor poppen van 24–30 uur APF.
- Beperkt door de noodzaak van zorgvuldige handmatige dissectie om weefselschade te voorkomen, hoewel de vaardigheid met oefening toeneemt.
