Name: Modelleren van neuronale dood en degeneratie in muis primaire cerebellaire submodule neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-06T16:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Ontdek hoe je primaire cerebellaire korrelneuronen uit muizen isoleert en kweekt voor het modelleren van neuronale celdood door excitotoxiciteit, oxidatieve stress en DNA-schade. Deze methode ondersteunt genetische manipulatie en onderzoek naar neurodegeneratieve mechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada en de Canadese instituten van gezondheidsonderzoek verleent aan A.J.-A.

dit protocol is gebaseerd op wijzigingen van de procedures die zijn beschreven eerder 18 , 24 , 25 , 26 , 27. dit protocol is goedgekeurd door de Commissie van de zorg van het dier aan de McGill University.
 1. experimental voorbereiding Opmerking: de onderstaande voorraadoplossingen kunnen worden voorbereid en onderhouden tot gebruik.
<ol><li>Dissectie oplossing <ol><li>Los 3.62 g natriumchloride (NaCl), 0.2 g van kaliumchloride (KCl), 0.069 g natriumfosfaat (NaH 2 PO 4 &#8729; H 2 O), en 1.306 g D-(+)-Glucose in 500 mL gedestilleerd H 2 O. Voeg dan 12,5 mL HEPES-Buffer, 450 µL van fenol red oplossing, en 20 mL van BSA breuk V aan de oplossing. Aanpassen op een pH van 7,4 met behulp 1 N van natriumhydroxide (NaOH).</li>
		<li>Sterilize met een 0,22 µm filter en bewaren bij 4 ° C. Deze oplossing zal stabiel blijven voor maximaal een week tot 10 dagen.</li>
	</ol></li> <li>Trypsine <ol><li>bereiden een stockoplossing met een concentratie van 25 g/L trypsine in natriumchloride 0,9%. Opslaan van de oplossing bij -20 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Trypsine remmer <ol><li>bereiden een materieel met een concentratie van 10 mg/mL door ontbinding van 1 g van kip-ei wit trypsine remmer in 100 mL 1 mM HCl. winkel deze oplossing bij -20 ° C.</li>
	</ol></li> <li>DNase <ol><li>los 100 mg DNase 1 in 10 mL steriel water voor het genereren van een voorraad van 10 mg/mL. Opslaan van de oplossing bij -20 ° C.</li>
	</ol></li> <li>MgSO 4 <ol><li>6.02 g magnesiumsulfaat (MgSO 4) toevoegen aan 50 mL gedestilleerd water (H 2 O) voor het genereren van een voorraad van 1 M. De oplossing bewaren bij 4 ° C.</li>
	</ol></li> <li>CaCl 2 <ol><li>Los 0.735 g van calciumchloride (CaCl 2 &#8729; 2 H 2 O) in 50 mL gedestilleerd H 2 O een voorraad concentratie van 100 mM. Oplossing bewaren bij 4 ° C.</li>
	</ol></li> <li>KCl <ol><li>Los 3.7275 g van KCl in 50 mL gedistilleerd H 2 O een voorraad concentratie van 1 M. winkel oplossing bij 4 ° C.</li>
	</ol></li> <li>D-(+)-Glucose <ol><li>los 1.802 g D-(+)-glucose in 50 mL gedistilleerd H 2 O een voorraad concentratie van 100 mM. Oplossing bewaren bij 4 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Cel voedingsbodems <ol><li>bereiden van voedingsbodems van de cel als volgt: 5 mL warmte geïnactiveerd dialyzed foetale runderserum, 500 µL van 200 mM L-Glutamine, 100 µL van 50 mg/mL gentamycine en 1 mL van 1,0 M KCL moet worden toegevoegd aan 45 mL voor filter gesteriliseerde Eagle &#39; s minimale essentiële media (E-MEM) dat wordt aangevuld met 1.125 g/L D-Glucose voor het genereren van 50 mL cerebellaire submodule neuron voedingsbodems. Media bewaren bij 4 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Cytosine Beta-D-Arabino Furanoside <ol><li>los 48 mg cytosine beta-D-arabino furanoside in 10 mL groei media een voorraad concentratie van 20 mM. Opslaan van de oplossing bij -20 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Poly-D-Lysine <ol><li>voor het genereren van een 2 mg/mL poly D-lysine voorraad, voeg toe 10 mL steriele H 2 O met 20 mg poly D-lysine. Voorraad poly D-lysine moet worden opgeslagen bij-80 ° C in 100 µL aliquots.</li>
	</ol></li> <li>Opmerking: de volgende oplossingen moeten worden voorbereid voordat dissectie en onderhouden bij 4 ° C tot gebruik.</li>
	<li>MgSO 4 Supplemented dissectie oplossing <ol><li>toevoegen 300 µL van voorraad MgSO 4 tot 250 mL van de oplossing van de dissectie.</li>
	</ol></li> <li>Trypsine dissectie oplossing <ol><li>Voeg 100 µL van voorraad trypsine en 12 µL van voorraad MgSO 4 tot 10 mL van de oplossing van de dissectie.</li>
	</ol></li> <li>Trypsine remmer oplossing 1 <ol><li>toevoegen 164 µL van voorraad trypsine-remmer, 250 µL van voorraad DNase 1 en 12 µL van voorraad MgSO 4 tot 10 mL van de oplossing van de dissectie.</li>
	</ol></li> <li>Trypsine remmer oplossing 2 <ol><li>toevoegen 1040 µL van voorraad trypsine-remmer, 750 µL van voorraad DNase 1 en 12 µL van voorraad MgSO4 tot 10 mL van de oplossing van de dissectie.</li>
	</ol></li> <li>CaCl 2 aangevuld dissectie oplossing <ol><li>toevoegen 10 µL van voorraad CaCl 2 en 25 µL van voorraad MgSO 4 tot 10 mL van de oplossing van de dissectie.</li>
	</ol></li> <li>Poly D-Lysine gecoat cultuur gerechten <ol><li>om de jas cultuur gerechten, Verdun 100 µL van voorraad poly D-lysine in 40 mL steriele H 2 O. Voor 35 mm Nunc cultuur gerechten, voeg 2 mL verdunde poly D-Lysine oplossing. Voor 4 goed platen, voeg 300 µL van verdunde poly D-Lysine aan elk putje.</li>
		<li>Laat de zitten van de poly-D-lysine voor 1 h voor zuigen en wassen elk goed met 4 mL of 600 µL (voor 35 mm cultuur gerechten of 4 goed, respectievelijk platen) van steriele H 2 O. Vervolgens gecombineerd de H 2 O en laat de gerechten lucht drogen voor 1 h.</li>
	</ol></li></ol> 2. Brain extractie en isolatie van Cerebellum <ol><li>Decapitate per 6-7 dagen oude muis pup met onthoofding schaar. Uitvoeren van de dissectie van de hersenen in de kap van een steriele weefselkweek.</li>
	<li>Als u wilt verwijderen de hersenen, het hoofd met behulp van een paar pincet te begrijpen en snijden door de huid naar de voorste van het hoofd met behulp van microdissection-schaar, zoals aangetoond in Figuur 1. Vervolgens snijden door het bot van de schedel met behulp van een nieuw paar van schaar om risico van besmetting te minimaliseren. Verwijderen van de schedel die betrekking hebben op de hersenen met behulp van Tang en plagen uit de hersenen met behulp van pincet of een spatel.
	<ol><li>Zo nodig het doorsnijden van de oogzenuw te vergemakkelijken om de hersenen uit als een geheel.</li>
	</ol></li> <li>Plaats van de hersenen in de dissectie-oplossing die is aangevuld met MgSO 4. Houd de oplossing en de hersenen op ice.</li>
	<li>Volgende brain verwijdering, onder een Microscoop dissectie, ontleden uit het cerebellum van de hersenen terwijl nog in MgSO 4 aangevuld dissectie oplossing en verwijderen van de hersenvliezen die met behulp van fijne pincet. Draai het cerebellum aan de ventrale zijde en verzekeren van de verwijdering van de plexus choroideus.</li>
	<li>De cerebella bundelen in een 35-mm-schotel met ~ 1 mL MgSO 4 aangevuld dissectie oplossing.</li>
	<li>Hak van het weefsel in kleine stukjes en breng kwantitatief over in een tube van 50 mL met MgSO 4 gebufferde dissectie oplossing 30 mL.</li>
</ol> 3. Muis cerebellaire submodule Neuron isolatie en Culturing <ol><li>centrifugeren van de tube van 50 mL, met de gehakte cerebrale weefsel voor 5 min op 644 x g en 4 ° C.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en voeg toe 10 mL trypsine dissectie oplossing. Schud vervolgens de buis op hoge snelheid gedurende 15 minuten bij 37 ° C.</li>
	<li>Voeg 10 mL trypsine remmer oplossing 1 om de buis en rock gedurende 2 min. zachtjes</li>
	<li>Centrifugeren van de buis gedurende 5 minuten op 644 x g- en 4 ° C.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en voeg toe 2 mL trypsine remmer oplossing 2, en dan overdracht aan een tube van 15 mL.</li>
	<li>Triturate het weefsel in de tube van 15 mL tot de oplossing troebel wordt. Vervolgens laat regelen voor 5 min.</li>
	<li>Verwijderen van het supernatans dat duidelijk en het supernatant overbrengen in een nieuwe buis met 1 mL CaCl 2 aangevuld dissectie oplossing.</li>
	<li>Toevoegen een ander mL trypsine remmer oplossing 2 aan de onderkant van de buis met de pellet uit stap 3.6. Triturate weer en laat regelen voor 5 min. de bovendrijvende vloeistof verwijderen en toevoegen aan de buis met het supernatant uit stap 3.7 (dat is een herhaling van stappen 3.6-3.7). Herhaal dit proces totdat het grootste deel van het weefsel is mechanisch losgekoppeld.</li>
	<li>Toevoegen 0.3 mL CaCl 2 aangevuld dissectie oplossing aan de supernatant collectie voor elke mL van het supernatans.</li>
	<li>Meng de inhoud van de tube en vervolgens gedurende 5 min op 644 x g. centrifugeren</li>
	<li>De bovendrijvende vloeistof verwijderen en toevoegen van 10 mL verse media aan de pellet en meng.</li>
	<li>Cellen kunnen vervolgens worden geteld en verdund tot een concentratie van 1,5 x 10 6 cellen/mL. Houd er rekening mee dat het 10 miljoen cellen in het algemeen worden verwacht van elke ontleed hersenen, afhankelijk van de tijd van de trypsinebehandeling en de efficiëntie van de dissectie. Plaat cellen op eerder gemaakte poly D-lysine platen. Plaat voor 4-Wells-platen, 0,5 mL, geven van 7,5 x 10 5 cellen per putje. Plaat voor 35-mm gerechten, 4 mL, 6 x 10 6 cellen per plaat geven.</li>
	<li>Na 24 h, cytosine-β-arabino furanoside (AraC) aan de platen ter beperking van verontreiniging gliale toevoegen. Voor elke media mL is 0,5 µL van 20 mM AraC vereist. Toevoeging van AraC is niet vereist voor een wijziging van de media. Als cellen worden gehandhaafd voor 7-8 dagen, herhaal deze behandeling op dag 3.</li>
	<li>Onderhouden culturen in een 5% CO 2 incubator bij 37 ° C en diervoeders met 100 µL van 100 mM glucose toegevoegd aan de cultuur voor elke 2 mL van media om de 2 dagen afgelopen 5 dagen. Een volledige media-verandering is niet vereist.</li>
</ol> 4. Lentivirus verpakking, zuivering en titratie Opmerking: het protocol voor de verpakking, de concentratie, de zuivering en de titratie van lentivirus is eerder beschreven in detail zonder het gebruik van een kit 28, met inbegrip van alternatieve methoden voor titratie, zoals stroom cytometry 29. Hier presenteren we kort het protocol dat wordt gebruikt in ons lab voor de productie van lentivirus te bestuderen van neuronale schade met behulp van snelle virus zuivering oplossing en een qPCR lentivirale titratie kit.
<ol><li>Plaat Hek293T cellen in 10 cm cultuur gerechten met Dulbecco &#39; s bewerkt Eagle &#39; s minimaal essentiële medium (DMEM) aangevuld met 10% FBS. Voor het verkrijgen van een hoge virale titer, groeien ten minste 5 platen van Hek293T cellen voor elk transfectie. Zorg ervoor dat op de dag van de transfectie cellen zijn 70% heuvels. Wijzigen van media drie uur voor Transfectie.</li>
	<li>Voor elke transfectie, bereiden twee buizen. In buis Voeg 1 1,5 mL serum MEM verminderde media en 41 µL van transfectiereagens, meng goed. Toevoegen in buis 2, 1,5 mL serum MEM verminderde media en 6 µg overdracht plasmide, 6 µg van pCMV-dR8.2 vector (verpakking plasmide) 3 µg pCMV-VSV-G-vector (envelop plasmide) en 35 µL van p3000 enhancer reagens (meegeleverd met lipofectamine). Meng goed, en combineren buizen 1 en 2, vortex en incubeer gedurende 15 min.</li>
	<li>50% van de media verwijderen uit Hek293T platen en lipide-DNA complexen aan cellen toevoegen. Incubeer gedurende 6 uur bij 37 ° C, 5% CO 2. Media verwijderen en vervangen door verse DMEM 5 mL, na een nacht bebroeden.</li>
	<li>Op 24 h na transfectie, verzamelen de eerste partij van virale supernatant van elke plaat. Het virale medium bewaren bij 4 ° C en 5 mL van de verse media toe te voegen in elke plaat van Hek293T cellen. Na een nacht bebroeden.</li>
	<li>48 h na transfectie, verzamelen de tweede partij van virale supernatans, Combineer het met de eerste partij en centrifugeer gecombineerde virale bovendrijvende vloeistof gedurende 10 minuten op 600 x g.</li>
	<li>De bovendrijvende vloeistof filteren door een filter met 45 µm poriegrootte.</li>
	<li>Zuiveren het virus met behulp van een snelle virus zuivering oplossing. Voor elke 45 mL van het supernatans dat virale, voeg 5 mL lentivirale bindoplossing, mix en Centrifugeer gedurende 10 min op &#62; 5000 x g- en 4 ° C.</li>
	<li>Zorgvuldig bovendrijvende vloeistof verwijderen dus niet te verstoren de pellet.</li>
	<li>Toevoegen van 20-40 µL van medium en resuspendeer de pellet. Aliquot en winkel op -80 ° C.</li>
	<li>Om de lentivirale titer, een qPCR lentivirale titratie kit wordt gebruikt. Verdun 2 µL van gezuiverde virus in 500 µL van PBS. Voeg 2 µL van het verdunde virus aan 18 µL van virus lysis buffer (meegeleverd in de kit).</li>
	<li>Set van drie verschillende RT-q-PCR reacties in triplicates en labelen hen als virale lysate, positieve controle 1 (STD1) en 2 (STD2) als positieve controle. Voor elke reactie toevoegt, 12,5 µL van 2 x qPCR MasterMix, 2.5 µL van een virale lysate of STD1 (meegeleverd in de kit) of STD2 (meegeleverd in de kit) en 10 µL van reagens-mix (meegeleverd in de kit) in 0,2 mL PCR buizen.</li>
	<li>De PCR-programma als volgt instellen: 20 min op 42 ° C voor omgekeerde transcriptie, 10 min bij 95 ° C gedurende enzymactivering, 40 cycli van 15 s bij 95 ° C voor denaturatie en 1 minuut bij 60 ° C gedurende gloeien/extensie.</li>
	<li>Berekenen de virale titer met behulp van deze formule: 
	Titer van virale lysate = 5 x 10, 7 / 2 3(Ctx-Ct1)/(Ct2-Ct1). 
	CTX = gemiddelde Ct waarde van onbekende monster, Ct1 = gemiddelde waarde van STD1, Ct2 = gemiddelde waarde van STD2. 
	Opmerking: CGNs kan worden best getransduceerde met lentivirussen of geïnfecteerd met adenovirussen afhankelijk van de modus van letsel bestudeerd. Toevoeging van lentivirussen bij een MOI voor 2-3 tot oplossing van de cultuur van de cel op het moment van beplating wordt gebruikt om te studeren NMDA geïnduceerde signalering op dag 7 van de cultuur. Dit resulteert in meer dan 80% transductie en is geschikt om na te streven met biochemische analysen van deze neuronen ( Figuur 2). Toevoeging van adenovirussen op dag 5 van cultuur (op MOI 50) en het bestuderen van de NMDA geïnduceerde signalering op dag 7-8 wordt gebruikt voor andere technieken, zoals beeldvorming. Deze behandeling leidt tot minder dan 10% infectie van neuronen, waardoor het ideaal is voor beeldvorming en co lokalisatie van eiwitten. Adenovirussen kunnen worden gebruikt op het moment van de beplating te bestuderen van celdood van DNA schade veroorzaakte door toevoeging van camptothecine op dag 2-3 of oxidatieve stress door toevoeging van waterstofperoxide. De aanwezigheid van eiwitten van de fluorescentie (GFP, RFP, GVB of YFP) gelabeld naar het gen van belang kan worden gebruikt om te schatten percentage transductie en potentiële toxiciteit. Met de aanbevolen MOI, zien we de toxiciteit van de minimale en maximale transductie ( Figuur 3).</li>
</ol> 5. Modelleren van neuronale schade <ol><li>voor het opwekken van NMDA geïnduceerde neuronale excitotoxicity, na 7 dagen in vitro, behandelen van CGNs met 100 µM NMDA en 10 µM glycine voor 1 h. vervangt alle het medium met geconditioneerde medium uit parallelle culturen met neen behandeling. Deze concentratie resulteert in de dood van de cel van 50% op 24 h na de behandeling ( Figuur 3 c). Mitochondriale fragmentatie blijkt op 6-8 uur na de behandeling (Zie Jahani-Asl et al. 26 , 27).</li> <li>om te induceren ROS-veroorzaakte celdood (oxidatieve stress), behandeling van neuroNS met 75-100 µM waterstofperoxide (H 2 O 2) en overschakelt naar geconditioneerd media van parallelle culturen na 5 minuten blootstelling aan H 2 O 2. Opmerking, als gevolg van de instabiliteit van de H 2 O 2, optimaliseren de concentratie tot een niveau dat 50-70% celdood in cultuur na 24 h behandeling induceert.</li>
	<li>Voor het opwekken van DNA schade veroorzaakte celdood, CGNs met 10 µM camptothecine behandelen. Deze concentratie induceert meer dan 50% van de celdood in 24 h. mitochondriale fragmentatie en vroege signalering van apoptotic vindt plaats van 2-3 h na toevoeging van camptothecine op deze concentratie (Zie Jahani-Asl et al. 18)</li> <li>wijzigen om te induceren lage K + geïnduceerde neuronale apoptosis in CGNs, medium met 25 mM K + te lage kalium media met 5 mM K + na 7 dagen in vitro.</li></ol>

<ol><li>Goldowitz, D., Hamre, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cells+and+molecules+that+make+a+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The cells and molecules that make a cerebellum.</a> Trends in Neurosciences. 21 (9), 375-382 (1998).</li>
<li>Contestabile, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+granule+cells+as+a+model+to+study+mechanisms+of+neuronal+apoptosis+or+survival+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro.</a> Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).</li>
<li>Bilimoria, P. M., Bonni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultures+of+cerebellar+granule+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cultures of cerebellar granule neurons.</a> CSH Protoc. , (2008).</li>
<li>Kramer, D., Minichiello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+of+primary+cerebellar+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell culture of primary cerebellar granule cells.</a> Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).</li>
<li>Burgoyne, R. D., Cambray-Deakin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+neurobiology+of+neuronal+development%3A+the+cerebellar+granule+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The cellular neurobiology of neuronal development: the cerebellar granule cell.</a> Brain Res. 472 (1), 77-101 (1988).</li>
<li>Hatten, M. E., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+neural+patterning+and+specification+in+the+developing+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum.</a> Annu Rev Neurosci. 18, 385-408 (1995).</li>
<li>Evans, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+signalling+in+cerebellar+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Synaptic signalling in cerebellar plasticity.</a> Biol Cell. 99 (7), 363-378 (2007).</li>
<li>Hunt, D. L., Castillo, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+of+NMDA+receptors%3A+mechanisms+and+functional+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications.</a> Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 496-508 (2012).</li>
<li>Arundine, M., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+calcium-dependent+neurodegeneration+in+excitotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of calcium-dependent neurodegeneration in excitotoxicity.</a> Cell Calcium. 34 (4-5), 325-337 (2003).</li>
<li>Szydlowska, K., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium%2C+ischemia+and+excitotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium, ischemia and excitotoxicity.</a> Cell Calcium. 47 (2), 122-129 (2010).</li>
<li>Jahani-Asl, A., Germain, M., Slack, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+joining+forces+to+thwart+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: joining forces to thwart cell death.</a> Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 162-166 (2010).</li>
<li>Rego, A. C., Oliveira, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+reactive+oxygen+species+in+excitotoxicity+and+apoptosis%3A+implications+for+the+pathogenesis+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and reactive oxygen species in excitotoxicity and apoptosis: implications for the pathogenesis of neurodegenerative diseases.</a> Neurochem Res. 28 (10), 1563-1574 (2003).</li>
<li>Wei, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proapoptotic+BAX+and+BAK%3A+a+requisite+gateway+to+mitochondrial+dysfunction+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death.</a> Science. 292 (5517), 727-730 (2001).</li>
<li>Doyle, K. P., Simon, R. P., Stenzel-Poore, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+ischemic+brain+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of ischemic brain damage.</a> Neuropharmacology. 55 (3), 310-318 (2008).</li>
<li>Coyle, J. T., Puttfarcken, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress%2C+glutamate%2C+and+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders.</a> Science. 262 (5134), 689-695 (1993).</li>
<li>Cole, K., Perez-Polo, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+trauma+model%3A+in+search+of+Thanatos%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal trauma model: in search of Thanatos.</a> Int J Dev Neurosci. 22 (7), 485-496 (2004).</li>
<li>Cheung, E. C., McBride, H. M., Slack, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+in+the+regulation+of+neuronal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics in the regulation of neuronal cell death.</a> Apoptosis. 12 (5), 979-992 (2007).</li>
<li>Jahani-Asl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitofusin+2+protects+cerebellar+granule+neurons+against+injury-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitofusin 2 protects cerebellar granule neurons against injury-induced cell death.</a> J Biol Chem. 282 (33), 23788-23798 (2007).</li>
<li>Gallo, V., Kingsbury, A., Balazs, R., Jorgensen, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+depolarization+in+the+survival+and+differentiation+of+cerebellar+granule+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of depolarization in the survival and differentiation of cerebellar granule cells in culture.</a> J Neurosci. 7 (7), 2203-2213 (1987).</li>
<li>Miller, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bax+deletion+further+orders+the+cell+death+pathway+in+cerebellar+granule+cells+and+suggests+a+caspase-independent+pathway+to+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bax deletion further orders the cell death pathway in cerebellar granule cells and suggests a caspase-independent pathway to cell death.</a> J Cell Biol. 139 (1), 205-217 (1997).</li>
<li>Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+analysis+of+cerebellar+granule+neurons+undergoing+apoptosis+by+potassium%2Fserum+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation.</a> Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).</li>
<li>Piccioli, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+nuclear+factor-kappaB+activation+induces+apoptosis+in+cerebellar+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of nuclear factor-kappaB activation induces apoptosis in cerebellar granule cells.</a> J Neurosci Res. 66 (6), 1064-1073 (2001).</li>
<li>D'Mello, S. R., Galli, C., Ciotti, T., Calissano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+apoptosis+in+cerebellar+granule+neurons+by+low+potassium%3A+inhibition+of+death+by+insulin-like+growth+factor+I+and+cAMP%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Induction of apoptosis in cerebellar granule neurons by low potassium: inhibition of death by insulin-like growth factor I and cAMP.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (23), 10989-10993 (1993).</li>
<li>Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+release+of+glutamate+from+cerebellar+granule+cells+differentiating+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7919-7923 (1982).</li>
<li>Messer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maintenance+and+identification+of+mouse+cerebellar+granule+cells+in+monolayer+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture.</a> Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).</li>
<li>Jahani-Asl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDK5+phosphorylates+DRP1+and+drives+mitochondrial+defects+in+NMDA-induced+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">CDK5 phosphorylates DRP1 and drives mitochondrial defects in NMDA-induced neuronal death.</a> Hum Mol Genet. 24 (16), 4573-4583 (2015).</li>
<li>Jahani-Asl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+inner+membrane+GTPase%2C+optic+atrophy+1+%28Opa1%29%2C+restores+mitochondrial+morphology+and+promotes+neuronal+survival+following+excitotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial inner membrane GTPase, optic atrophy 1 (Opa1), restores mitochondrial morphology and promotes neuronal survival following excitotoxicity.</a> J Biol Chem. 286 (6), 4772-4782 (2011).</li>
<li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J Vis Exp. (63), e4031(2012).</li>
<li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Lentivirus production.</a> J Vis Exp. (32), (2009).</li>
<li>Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+post-natal+mouse+cerebellar+granule+neuron+progenitor+cells+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons.</a> J Vis Exp. (23), (2009).</li>
<li>Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+cerebellar+granule+neurons+in+vitro+and+in+vivo+to+study+neuronal+morphology+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Wij bieden hier een eenvoudige methode voor het kweken van primaire muisknop cerebellaire submodule neuronen (CGNs), verlies en aanwinst van functie studies, en modelleren van verschillende vormen van dood van de cel. Verschillende factoren beïnvloeden de reproduceerbaarheid van de resultaten met behulp van deze procedure waarvoor nauwlettend te worden gevolgd. Het gaat hierbij om de zuiverheid van de cultuur, waaronder de verwijdering van gliale cellen in de cultuur, de samenvloeiing van de cultuur, en het behoud van ge...

Cerebellaire submodule neuronen (CGNs) worden ook gekenmerkt in cultuur en hebben gediend als een effectieve model om te studeren neuronale dood en ontwikkeling 1,2,3,4,5, 6. de vroege expressie van N-methyl-D-aspartaat (NMDA)-receptoren in de CGN culturen in vitro maakt hen een aantrekkelijk model te bestuderen NMDA-geïnduceerde signalering. Activering van deze receptoren met NMDA in combinatie met membraan depolarisatie wordt gebruikt voor het modelleren van fysiologische Neuronale activiteit stimulatie, en heeft toegestaan voor onderzoek naar de mechanismen van synaptische plasticiteit 7,8. Integendeel, kan overmatige stimulatie van deze receptoren door NMDA ligand worden gebruikt voor het model van excitotoxicity, een grote mechanisme van neuronale schade in acute schade aan de hersenen en neurodegeneratieve ziekten 9. Een mechanisme voor de inductie van excitotoxicity is door middel van ATP honger met verminderde zuurstof, zoals gezien bij acute neuronale schade. Dit leidt tot membraan depolarisatie en verhoogde niveaus van glutamaat vrij in de synaps. De daaropvolgende overstimulatie van de NMDA-receptor door verhoogde glutamaat resulteert in buitensporige Ca2 + toestroom via deze receptoren, die op zijn beurt activeert verschillende trajecten met inbegrip van Ca2 +-geactiveerd proteasen, phospholipases, en enzym, resulterend in de ongecontroleerde afbraak van kritische cellulaire componenten en celdood. Bovendien, leidt hoge intracellulaire Ca2 + tot de generatie van zuurstof vrije radicalen en mitochondriale schade 10,11.
Terwijl de meerderheid van de neuronale verlies na NMDA-geïnduceerde neuronale excitotoxicity te wijten aan de calcium toestroom is en Bax/Bak onafhankelijk is, kunnen niet andere mechanismen van celdood worden uitgesloten van dit model. Het uiterlijk van beide necrotische en apoptotic zoals celdood als gevolg van excitotoxicity gedeeltelijk te wijten aan de generatie van reactieve zuurstof soorten (ROS) en DNA-schade veroorzaakt doorhoge intracellulaire Ca 2 + niveaus 12 is. DNA-beschadiging resulteert in neuronale dood door middel van apoptotic mechanismen, worden gecorreleerd met kenmerken van apoptotic celdood, zoals het uiterlijk van de chromatine massa's en de apoptotic organen. Inductie van apoptosis is bemiddeld door de vrijlating van cytochroom c uit de mitochondriën, en heeft aangetoond dat Bax/Bak oligomerisatie 13afhankelijk te zijn. Bax/Bak oligomerisatie bevordert porie vorming in de buitenste mitochondriale membraan, wat resulteert in cytochroom c release en de activering van de regelgevers van de pro-apoptotic zoals gezien met milde ischemische schade 14.
Generatie van ROS is een belangrijke kwestie in de hersenen als gevolg van de lage endogene niveaus van antioxidanten, gekoppeld aan de eis van de grote zuurstof voor neuronale functionerende 15. Wanneer blootgesteld aan een ischemische gebeurtenis, is stikstofoxide synthase upregulated, productie van stikstofmonoxide en het vergroten van reactieve zuurstof soorten 14. De verhoogde concentratie van zuurstof radicalen kan resulteren in DNA-beschadiging en niet indirect veroorzaken energie honger. Hoge niveaus van DNA double-stranded pauzes worden verholpen door de activering van poly ADP-ribose polymerase-1 (PARP-1), een eukaryote chromatine-gebonden eiwit dat verantwoordelijk is voor het katalyseren van de overdracht van ADP-ribose eenheden van NAD+, een proces dat integraal deel uitmaakt van 16van de reparatie van DNA. Met buitensporige schade als gevolg van oxidatieve stress, PARP-1 activering kan echter leiden tot energie honger als gevolg van de verhoogde afvoer op NAD+, een noodzakelijke substraat voor ATP productie door middel van oxidatieve fosforylering. Uiteindelijk, oxidatieve stress zal leiden tot apoptosis in een Bax/Bak afhankelijke wijze leidt tot mitochondriale cytochroom c release, en is gebleken voor het opwekken van mitochondriale reorganisatie in CGNs 17.
Ten slotte, veranderingen in de concentratie van kaliumchloride (KCl) in CGN culturen kunnen worden gebruikt om model te lage kalium/depolarisatie gemedieerde apoptosis 18,19,20. Wanneer blootgesteld aan lage niveaus van K+, ondergaan CGNs verschillende fysiologische veranderingen, wat resulteert in kortingen van mitochondriale ademhaling zowel glycolyse, toegeschreven aan verminderde cellulaire vraag 21, evenals vermindering van nucleaire factor-recombination (NFκB) die activiteiten, met inbegrip van ontsteking en synaptische transmissie 22regelt. Dit model is van bijzonder belang voor het bestuderen van celdood tijdens neuronale ontwikkeling. De lage K+ environment nauwer lijkt op fysiologische omstandigheden en kenmerken van celdood gezien tijdens neuronale ontwikkeling 23veroorzaakt.
Kortom bieden CGNs een langdurige model voor het onderzoek naar de moleculaire mechanismen van neuronale dood en degeneratie. Het volgende protocol kan isolatie en kweken van CGNs, expressie of onderdrukking van een bepaalde genetische traject met behulp van virussen en de inductie van neuronale dood via verschillende mechanismen die neuronale schade en degeneratie.

<table><tbody><tr><td>qPCR lentivitral titratiekit&nbsp;</td><td>ABM</td><td>#LV900</td><td></td></tr><tr><td>speedy virus zuiveringsoplossing&nbsp;</td><td>ABM</td><td>#LV999</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-dR8.2</td><td>Addgene</td><td>#8455</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-VS.VG</td><td>Addgene</td><td>#8454</td><td></td></tr><tr><td>Gedestilleerd water&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>#15230162</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamine&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>#25030081</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Nunc kweekschalen</td><td>Gibco</td><td>#174913</td><td></td></tr><tr><td>PowerUP SYBR green master mix</td><td>life technologies</td><td>#A25742</td><td></td></tr><tr><td>BSA V Oplossing</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#A-8412</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 &bull; 2H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#C-7902&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Camptothecine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#C-9911</td><td></td></tr><tr><td>Chicken Egg White Trypsin Inhibitor&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#10109878001</td><td></td></tr><tr><td>Cytosine beta-D-Arabino Furanoside</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#C-1768</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#G-7528</td><td></td></tr><tr><td>DNase1&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#11284932001</td><td></td></tr><tr><td>Eagle-minimaal essentieel medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#M-2279</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#G-5417</td><td></td></tr><tr><td>Inactief dialyseerd foetaal bovien serum&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#F-0392</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Buffer&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#H-0887</td><td></td></tr><tr><td>Waterstofperoxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#216763</td><td></td></tr><tr><td>50 mg/mL Gentamycin&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#G-1397</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#M-2643</td><td></td></tr><tr><td>N-Methyl-D-aspartic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#M-3262</td><td></td></tr><tr><td>Fenol Rode Oplossing&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#P-0290</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#T-4549</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000-008</td><td></td></tr><tr><td>p3000 versterkerreagens</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000-008</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Gereduceerd Serum Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>KCl&nbsp;</td><td>VWR</td><td>#CABDH9258</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>VWR</td><td>#CABDH9286</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4H2O&nbsp;</td><td>VWR</td><td>#CABDH9298</td><td></td></tr><tr><td>Poly D-lysine&nbsp;</td><td>VWR</td><td>#89134-858</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Wisent</td><td>#319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Wisent</td><td>#080-450</td><td></td></tr></tbody></table>

modelleren van neuronale dood en degeneratie in muis primaire cerebellaire submodule neuronen

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellaire submodule neuronen (CGNs) zijn een veelgebruikte neuronale model, vormen een overvloedige homogene bevolking in het cerebellum. In het licht van hun postnatale ontwikkeling, overvloed en toegankelijkheid zijn CGNs een ideaal model om neuronale processen, met inbegrip van neuronale ontwikkeling, neuronale migratie en fysiologische Neuronale activiteit stimulatie te bestuderen. Daarnaast bieden de CGN culturen een uitstekend model voor het bestuderen van de verschillende vervoerswijzen met inbegrip van excitotoxicity en apoptosis van de dood van de cel. Binnen een week in cultuur express CGNs N-methyl-D-aspartaat (NMDA)-receptoren, een specifieke ionotropic glutamaat-receptor met vele kritische functies in neuronale gezondheid en ziekte. De toevoeging van lage concentraties van NMDA in combinatie met membraan depolarisatie knaagdier primaire CGN culturen is gebruikt voor het modelleren van fysiologische Neuronale activiteit stimulatie, terwijl de toevoeging van hoge concentraties van NMDA kan worden gebruikt om het model excitotoxic neuronale schade. Hier, worden een methode van isolement en kweken van CGNs van 6 dag oud pups, alsmede de genetische manipulatie van CGNs door adenovirussen en lentivirussen beschreven. Wij ook aanwezig geoptimaliseerde protocollen over hoe NMDA-geïnduceerde excitotoxicity, laag-kalium-veroorzaakte apoptosis, oxidatieve stress en DNA-schade na transductie van deze neuronen te stimuleren.

Met zorgvuldige dissectie, moet de hersenen intact worden verwijderd met minimale schade, zoals te zien in figuur 1A-B. Inspanning moet worden genomen om het minimaliseren van schade aan de hersenen tijdens verwijderen, met name schade aan het cerebellum. Het cerebellum schadelijk maakt voor moeilijker identificatie en volledige verwijdering van de hersenvliezen, en verhoogt de kans op besmetting van de neuronale cultuur. Zodra de hersenvliez...

Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om te isoleren en primaire muisknop cerebrale submodule neuronen (CGNs) van 6-7 dag oud pups, efficiënte transductie van CGNs voor verlies en winst van functie studies, kweken en modellering NMDA-geïnduceerde neuronale excitotoxicity, lage-kalium-veroorzaakte celdood, DNA-schade en oxidatieve stress met behulp van de zelfde cultuur-model.

Modelleren van neuronale dood en degeneratie in muis primaire cerebellaire submodule neuronen

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Het algemene doel van deze procedure is het produceren van gezonde, zuivere populaties van cerebellaire granulecellen, om deze genetisch te manipuleren en verschillende mechanismen van neuronale beschadiging in de primaire kweek in vitro te modelleren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van neuronale beschadiging. Wij gebruiken dit protocol om de onderliggende moleculaire mechanismen van neurale beschadigingen na acuut hersenletsel en neurodegeneratieve ziekten te onderzoeken.Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat we met behulp van het culturesysteem verschillende mechanismen van celdood kunnen modelleren, zoals excitotoxiciteit, oxidatieve stress, DNA-schade en ontwikkelingsprocessen. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in neuronale beschadiging, kan ze ook worden toegepast op cerebellaire neuronen van ratten om de neuronale activiteit en morfogenese te bestuderen in reactie op groeifactoren en nevengebeurtenissen. Om de hersenen van een muis van zes tot zeven dagen oud te extraheren, gebruikt u een pincet om de kop vast te pakken en knipt u met micro-dissectieschaartjes de huid anterieur richting de kop door.Duw de huid naar achteren om de schedel bloot te leggen. Penetreer vervolgens de schedel met de punt van de schaar en snijd anterieur en lateraal. Pas op dat het cerebellum niet beschadigd raakt en vergemakkelijk de identificatie en verwijdering van de hersenvliezen, gebruik daarna een pincet om de schedel openspreidend te verwijderen zodat de hersenen zichtbaar worden.Gebruik een pincet of spatel om de hersenen voorzichtig in een koele dissectieoplossing te brengen. Om het cerebellum te isoleren, plaatst u de hersenen in de dissectieoplossing aangevuld met magnesiumsulfaat en houdt u zowel de oplossing als de hersenen op ijs. Verwijder onder de dissectiemicroscoop de hersenvliezen met een fijn pincet en dissecteer vervolgens het cerebellum uit de hersenen in de met magnesiumsulfaat aangevulde dissectieoplossing.Dit helpt bij het afpellen van de resterende hersenvliezen en maakt het mogelijk om tussen de lagen te komen om de cerebellaire plooien te reinigen. De aanwezigheid van hersenvliezen in neuronale culturen leidt tot ongezonde cellen en uiteindelijk tot celdood. Daarom is het belangrijk om volledige verwijdering van de hersenvliezen te garanderen voordat men voortgaat met de cultuur.Draai daarna het cerebellum om naar de ventrale zijde en zorg ervoor dat de plexus choroideus is verwijderd. Plaats de cerebella vervolgens in een schaal van 35 millimeter met één milliliter dissectie-oplossing aangevuld met magnesiumsulfaat. Snijd de weefsels in kleine stukjes en breng deze over in een buis van 50 milliliter met 30 milliliter gebufferde dissectie-oplossing met magnesiumsulfaat.Centrifugeer in deze stap de 15 milliliter buis met het fijngehakte cerebrale weefsel gedurende vijf minuten bij 644 ×g en 4 °C. Verwijder daarna het supernatant en voeg 10 milliliter trypsine-dissectieoplossing toe. Schud de tafel vervolgens gedurende 15 minuten op hoge snelheid bij 37 °C.Voeg twee milliliter trypsinremmingsoplossing één toe aan de buis en schud deze voorzichtig gedurende twee minuten. Centrifugeer de buis vervolgens vijf minuten bij 644 ×g en vier °C. Verwijder na vijf minuten het supernatant en voeg twee milliliter trypsinremmingsoplossing twee toe voordat u het overbrengt naar een buis van 15 milliliter.Tritureer vervolgens het weefsel in de buis van 15 milliliter totdat de oplossing troebel wordt. Laat het vijf minuten bezinken. Verwijder daarna de heldere supernatant en breng deze over naar een nieuwe buis met één milliliter dissectie-oplossing aangevuld met calciumchloride.Voeg nog twee milliliter trypsineremmeroplossing twee toe aan de bodem van de buis met het pellet. Homogeniseer dit opnieuw en laat het vijf minuten bezinken. Verwijder het supernatant en voeg dit toe aan de buis met het supernatant uit de vorige stap.Herhaal dit proces totdat het grootste deel van het weefsel mechanisch is gedissocieerd. Voeg 0,3 milliliters calciumchloride-gesupplementeerde dissectie-oplossing toe aan de supernatantcollectie voor elke milliliter supernatant. Meng de inhoud van de buis en centrifugeer deze vervolgens gedurende vijf minuten bij 644 ×g bij kamertemperatuur.Verwijder daarna het supernatant. Voeg 10 milliliters vers medium toe aan het pellet en meng dit. Tel vervolgens de levende cellen en verdun deze tot een concentratie van 1,5 keer 10^6 cellen per milliliter.Zaai de cellen uit op de eerder geprepareerde poly-D-lysine platen. Zaai voor platen met vier putjes 0,5 ml van het monster uit, wat neerkomt op 7,5 × 10⁵ cellen per putje. Zaai voor 35 mm schalen 4 ml van het monster uit, wat neerkomt op 6 × 10⁶ cellen per schaal.Plate voor dekglasplaatjes 0,5 milliliter met 7,5 × 10⁵ cellen per putje. Voeg na 24 uur AraC toe aan de plaatjes om gliale contaminatie te verminderen. Als de cellen zeven tot acht dagen in stand moeten worden gehouden, herhaal deze behandeling dan op dag drie en bewaar de culturen in een 5% CO2-incubator bij 37 °C.Voed de culturen die langer dan vijf dagen worden onderhouden elke twee dagen met glucose, beginnend op dag vijf. Om neuronale excitotoxiciteit met NMDA te induceren, worden de cerebellaire korrelcellen na zeven dagen in vitro gedurende één uur behandeld met 100 micromolar NMDA en 10 micromolar glycine. Vervang vervolgens het medium door geconditioneerd medium van de parallelle culturen zonder behandeling.Deze concentratie resulteert in 50% celsterfte 24 uur na de behandeling. Voor ROS-geïnduceerde celsterfte worden de neuronen vijf minuten behandeld met waterstofperoxide in een concentratie van 75 tot 100 micromolar. Vervang dit na vijf minuten door het geconditioneerde medium van parallelle culturen.Vanwege de instabiliteit van waterstofperoxide moet de concentratie worden geoptimaliseerd tot een niveau dat na 24 uur tussen 50 en 70% celdood induceert. Deze concentratie ligt gewoonlijk tussen 75 en 100 micromolar. Om celdood door DNA-schade te induceren, behandelt u de granulaire neuronen van het cerebellum met 10 micromolar camptothecine om binnen 24 uur meer dan 50% celdood te induceren.Voor door laag kalium geïnduceerde neuronale apoptose in cerebellaire korrelcellen wordt het medium met 25 millimolaire kalium na zeven dagen in vitro vervangen door een laag kaliummedium met vijf millimolaire kalium. De neuronen werden bij het uitplaten getransduceerd met lentivirus voor RFP bij een MOI van drie. Fixatie en kleuring vonden plaats na zeven dagen in vitro.De co-lokalisatie van het RFP-signaal, MAP2 en Hoechst wordt getoond om gezonde neuronen te demonstreren die volledig zijn getransduceerd door lentivirussen. De hier getoonde beelden representeren live-dead assay-analyses van neuronen die zijn geïnfecteerd met verschillende MOI van adenovirus om de toxiciteit te meten. Cerebellaire korrelcellen geïnfecteerd met adenovirus dat LacZ tot expressie brengt bij een MOI tussen 25 en 50, maken een maximale efficiëntie mogelijk terwijl een minimale toxiciteit behouden blijft.Wanneer er bij deze MOI wordt geïnfecteerd, is een verschil in celoverleving van minder dan 1% ten opzichte van de controle waarneembaar. Deze figuren tonen de Hoechst-kleuring van controle cerebellaire korrelcellen en cerebellaire korrelcellen behandeld met NMDA om celdood te induceren. Let op de vorming van pyknotische kernen bij behandeling met NMDA.Dit is een indicatie van celdood en kan worden waargenomen in ongeveer 50% van de cultuur 24 uur na behandeling met 100 micromolar NMDA en 10 micromolar glycine. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in twee en een half uur worden uitgevoerd met zes muizenpops, mits correct uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze techniek is het belangrijk om aseptische technieken en gesteriliseerde chirurgische instrumenten te gebruiken, zoals vereist, om het risico op contaminatie van de cultuur te minimaliseren.Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de neurowetenschappen om neuronale ontwikkeling en neuronale beschadiging in primaire muisneuronen te bestuderen. Na het bekijken van deze video moet u in staat zijn om granulaire neuronen uit het cerebellum te kweken, deze genetisch te manipuleren met behulp van virussen en verschillende mechanismen van neurale beschadiging op te wekken. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals immunofluorescentie of celviabiliteitsassays, worden uitgevoerd om vragen te beantwoorden zoals of een gen van belang de overleving van cellen verbetert als reactie op excitotoxiciteit, oxidatieve stress of DNA-schade.

modeling-neuronal-death-degeneration-mouse-primary-cerebellar-granule

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hier presenteren wij een methode om te isoleren en cultuur cerebellaire granule neuron progenitor cellen en cerebellaire korrel neuronen van postnatale muis.

Isolatie en Cultuur van Post-Natal Mouse Cerebellaire Korrel Neuron progenitor cellen en Neuronen

This video demonstrates the technique for isolating and culturing primary mouse cerebellar granule neurons. Cells are treated with an antimetabolite to eliminate proliferating glial cells and produce a pure culture of cerebellar granule neurons.

Isolation and Culture of Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

This video demonstrates the generation of a neuronal injury model in mouse primary cerebellar granule neurons. It outlines the steps involved in inducing neuronal injury using NMDA, an excitatory neurotransmitter receptor agonist, and glycine, a co-agonist. NMDA and glycine bind to specific neuronal receptors, causing their overstimulation and resulting in a massive intracellular calcium influx, which leads to neuronal cell damage and death.

Modeling Neuronal Injury in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

This video outlines the generation of a neuronal injury model using reactive oxygen species (ROS) in mouse primary cerebellar granule neurons. It details the process of inducing oxidative stress by adding high concentrations of hydrogen peroxide. ROS exposure causes DNA strand breaks and genomic instability. Additionally, the oxidation of cellular proteins impairs their functions, while lipid peroxidation compromises membrane integrity. This cascade leads to cytochrome c release and caspase...

Modeling Reactive Oxygen Species-Induced Neuronal Death in Mouse Cerebellar Granule Neurons

Source: Chan, U., et al., Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates the analysis of cerebellar granule neuron development by imaging pre-fixed brain tissue slices from mice labeled with a fluorescent protein, capturing high-resolution z-stack images with a confocal microscope, and measuring structural parameters including neurite length, dendritic claw formation, surface area,...

Visualizing the Synaptogenesis of Cerebellar Granule Neurons at Different Developmental Stages

Neuronale morfogenese en migratie zijn cruciale gebeurtenissen ten grondslag liggen aan een goede ontwikkeling van de hersenen. Hier beschrijven we methoden om genetisch manipuleren gekweekte cerebellaire granule neuronen en de ontwikkelingslanden cerebellum voor de beoordeling van de morfologie en trekkende kenmerken van neuronen.

Genetische Manipulatie van Cerebellaire Korrel Neuronen<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em&gt; Om te studeren Neuronale morfologie en Migratie

Cerebellaire granule uitwendige laag is de plaats van de grootste doorvoer versterking in de zich ontwikkelende hersenen. Hier presenteren we een protocol voor genetische modificatie om deze laag te richten op het hoogtepunt van proliferatie via ex vivo elektroporatie en cultuur van cerebellaire plakjes uit embryonale dag 14 kippenembryo's.

Ex Vivo Cultuur van Chick Cerebellaire Slices en Ruimtelijk Gerichte Elektroporatie van Korrel cel precursoren

Dit protocol beschrijft hoe om neuronale levensvatbaarheid nauwkeurig te meten met behulp van Fluorescein Diacetate (FDA) en Propidium Iodide (PI) dubbele kleuring in gekweekte cerebellar granule neuronen, een primaire neuronale cultuur die gebruikt wordt als een in vitro model in neurowetenschappen en neurofarmacologie onderzoek.

Beoordeling van neuronale levensvatbaarheid met behulp van Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Dubbele Verf In Cerebellaire Granule Neuron Cultuur

Het uitvoeren van in vitro experimenten om zo goed mogelijk te reflecteren in vivo omstandigheden is geen gemakkelijke taak. Het gebruik van primaire celculturen is een belangrijke stap naar begrip van celbiologie in een heel organisme. Het meegeleverde protocol schetst hoe succesvol groeien en cultuur embryonale muis cerebellaire neuronen.

Primaire cultuur van neuronen geïsoleerd van embryonale muis cerebellum

Hier beschrijven we een methode om synaptogenese van korrelneuronen in het cerebellum van de muis te visualiseren gedurende het tijdsverloop van de postnatale hersenontwikkeling wanneer deze cellen hun synaptische structuren verfijnen en synapsen vormen om zichzelf te integreren in het algehele hersencircuit.

Gebruik van in vivo postnatale elektroporatie om cerebellaire korrelneuronmorfologie en synapsontwikkeling te bestuderen

Ontdek hoe je primaire cerebellaire korrelneuronen uit muizen isoleert en kweekt voor het modelleren van neuronale celdood door excitotoxiciteit, oxidatieve stress en DNA-schade. Deze methode ondersteunt genetische manipulatie en onderzoek naar neurodegeneratieve mechanismen.

Modelleren van neuronale dood en degeneratie in muis primaire cerebellaire submodule neuronen

Meer video's verkennen