Viervoudige Immunostaining van de Olfactorische Lamp voor Visualisatie van Olfactorische Sensorische Axon Moleculaire Identiteitscodes
5 juni 2017
Olfactorische zintuiglijke neuronen vormen een grote verscheidenheid aan axon-sorterende moleculen om een goede neurale schakeling te vormen. Dit protocol beschrijft een immunohistochemische kleuring methode om combinatorische expressies van axon-sorterende moleculen te visualiseren bij de axon termini van olfactorische sensorische neuronen.
Het algemene doel van deze immunohistochemische kleuringsmethode is om de gecombineerde expressie van axon-sorteringsmoleculen te visualiseren bij de axonterminalen van olfactorische sensorische neuronen. Deze methode kan helpen bij het karakteriseren van sleutelprocessen in het vakgebied van de olfactorische ontwikkeling, zoals axonale geleiding, synapsevorming en de regeneratie van olfactorische sensorische neuronen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het wetenschappers in staat stelt om de expressiepatronen van axon-sorteringsmoleculen in de bulbus olfactorius te vergelijken en te analyseren zonder variatie tussen coupes.
Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de inbeddingsstap moeilijk aan te leren is, omdat de positie en hoek van het monster van het reukweefsel in de mal lastig in woorden te beschrijven zijn. Begin met koppen van muizen van één tot twee weken oud die zijn gefixeerd door intracardiale perfusie met 4% paraformaldehyde. Steek een schaarkrab in de ruimte tussen de boven- en ondertanden en snijd horizontaal om het onderkaakbot te verwijderen.
Trim vervolgens het overtollige weefsel weg met een pincet en een schaar, zodat het olfactorische weefsel overblijft, inclusief de bulbus olfactorius en het reukepitheel. Dompel het olfactorische weefsel in PBS om lucht in de neusholte te verwijderen, maak vervolgens een verticale snede om het achterste deel van de hersenen te verwijderen en plaats het olfactorische weefsel met de snijkant naar beneden op de bodem van een inbedmal. Vul de mal met optimal cutting temperature compound en dompel deze vervolgens onder in vloeibare stikstof.
Nadat het weefsel en de OCT volledig zijn ingevroren, laat u het weefsel één uur lang equilibreren in de cryostaat bij 20 °C. Maak vervolgens met de cryostaat seriële parasagittale coupes van de bulbus olfactorius en verzamel deze door ze op met MAS gecoate glazen objectglaasjes te plakken. Droog de glaasjes na het plakken onmiddellijk met een föhn.
Begin de immunokleuring door de gedroogde coupes vijf minuten lang bij kamertemperatuur te wassen met PBS. Blokkeer aspecifieke bindingsplaatsen door de coupes één uur lang bij kamertemperatuur te incuberen met 5% blokkeringsoplossing. Voeg vervolgens aan elke coupe 400 µL toe van een cocktail van primaire antilichamen, verdund in 1% blokkeringsoplossing.
Incubeer de coupes een nacht bij kamertemperatuur. Verwijder de volgende dag de primaire antilichaamoplossing en was de coupes drie keer gedurende vijf minuten met PBST bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 400 microliter van een cocktail van secundaire antilichamen en PBS toe aan elke coupe.
Bescherm tegen licht en incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur. Gooi na de incubatie de oplossing weg en was de coupes opnieuw drie keer gedurende vijf minuten per keer met PBS bij kamertemperatuur. Monteer tot slot dekglasplaatjes op de coupes door twee druppels monteermedium op elke coupe aan te brengen, het dekglasplaatje te plaatsen en luchtbellen te verwijderen.
Maak fluorescente beelden met de fluorescentiemicroscoop met gebruik van het juiste filter voor elke fluorofoor. Stel de belichtingstijd zo in dat de fluorescente signalen in het beeld niet verzadigd zijn. Definieer de glomerulaire structuur aan de hand van de immunofluorescente signalen van GLUT2.
Gebruik Image J om de kleuringsintensiteiten van axon-sorteringsmoleculen binnen glomeruli te meten. Deze afbeelding toont een parasagittale sectie van de olfactory bulb van een twee weken oude muis, immunogekleurd met antilichamen tegen VGLUT2, waarbij Kirrel2 in rood wordt weergegeven, Semaphorine 7A in groen en OLPC in blauw. De samengevoegde afbeelding demonstreert dat de axon-sorteringsmoleculen die betrokken zijn bij glomerulaire segregatie in een positie-onafhankelijk mozaïekpatroon worden tot expressie gebracht.
Elke glomerulus wordt gedefinieerd door fluorescentiesignalen van de presynaptische marker VGLUT2. De glomerulaire structuren zijn omringd door stippellijnen. De signaalintensiteiten van axon-sorteermoleculen werden in elke glomerulus gemeten.
Zoals hier te zien is, worden moleculen voor axonsortering differentieel tot expressie gebracht in elke glomerulus. Glomerulus 3 heeft bijvoorbeeld hoge niveaus van OLPC, intermediaire niveaus van Semaphorine 7A en lagere niveaus van Kirrel2; dit verschil kan worden gekwantificeerd door de kleuringsintensiteit te meten. Glomerulus 4 heeft daarentegen hoge niveaus van OLPC en lagere niveaus van Kirrel2 en Semaphorine 7A.
Ook dit verschil kan worden gekwantificeerd door de kleurintensiteit te meten. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de post-fixatie met PFA en de behandeling met sucrose-oplossing, die normaal gesproken worden aanbevolen, moeten worden weggelaten. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u meer glomeruli op de enkele sectie van de bulbus olfactorius kunt plaatsen en hoe u hoogwaardige immunokleuringen met meerdere antilichamen kunt uitvoeren, wat ook kan worden toegepast op andere hersengebieden.
Blijf hoopvol; deze methode zal u helpen om succesvol te zijn in uw toekomstige experimenten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een immunohistochemische kleuringsmethode om de expressie van axon-sorteermoleculen te visualiseren bij de axonterminalen van olfactorische sensorische neuronen. Deze techniek is essentieel voor het begrijpen van olfactorische ontwikkelingsprocessen, zoals axongeleiding en synapsevorming.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Olfactorische ontwikkeling
- Immunohistochemie
Achtergrond
- Olfactorische sensorische neuronen spelen een sleutelrol bij het reukvermogen.
- Axon-sorteringsmoleculen zijn essentieel voor het tot stand brengen van de juiste neurale schakelingen.
- Het begrijpen van hun expressiepatronen kan inzicht bieden in de functies van het olfactorische systeem.
- Het visualiseren van deze expressies kan helpen bij het bestuderen van regeneratieprocessen in olfactorische sensorische neuronen.
Doel van de studie
- Om de gecombineerde expressie van axon-sorteringsmoleculen te visualiseren.
- Om sleutelprocessen in de olfactorische ontwikkeling te karakteriseren.
- Om de vergelijking van expressiepatronen in de bulbus olfactorius te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Immunohistochemische kleuringstechniek.
- Gebruik van muizenkoppen op een leeftijd van één tot twee weken.
- Intracardiale perfusie met 4% paraformaldehyde voor fixatie.
- Inbedding en coupesnijden van reukweefselmonsters.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van de expressie van axon-sorteringsmoleculen.
- Aangetoonde capaciteit om expressiepatronen te analyseren zonder variatie tussen coupes.
- Voorzien in een duidelijke methode voor het inbedden van reukweefsels.
- Benadrukt het belang van visuele demonstraties voor het aanleren van de techniek.
Conclusies
- De immunohistochemische methode is effectief voor het bestuderen van olfactorische sensorische neuronen.
- Inzicht in axon-sorteringsmoleculen kan de kennis over de ontwikkeling van het olfactorische systeem vergroten.
- Deze techniek kan een waardevol instrument zijn voor toekomstig onderzoek naar olfactorische regeneratie.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Deze methode maakt nauwkeurige moleculaire mapping van axon-sorteermoleculen in de bulbus olfactorius mogelijk, wat doelwitvalidatie in neuro-ontwikkelingsonderzoek ondersteunt. Door een kwantitatieve vergelijking van eiwitexpressiepatronen over glomeruli mogelijk te maken zonder variabiliteit tussen de coupes, vergroot het de voorspellende betrouwbaarheid in mechanistische studies naar de vorming van neurale circuits. De aanpak biedt een schaalbaar, reproduceerbaar platform voor het verminderen van risico's bij hypothesen met betrekking tot axongeleiding en synaptische specificiteit in preklinische discovery-pipelines.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om moleculaire identiteitscodes bij axonale termini te onderzoeken om de mechanismen van target-engagement bij de ontwikkeling van olfactorische sensorische neuronen te verduidelijken.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele target-validatie door de expressie van axon-sorteermoleculen te correleren met glomerulaire organisatiepatronen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream screening door het vaststellen van gestandaardiseerde immunostaining-protocollen voor multiplex proteïnedetectie.
- Operationele waarde: Pakt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid aan door een consistente definitie van glomeruli met behulp van VGLUT2 als presynaptische marker.
- Strategische waarde: Benadrukt de gereedheid voor screening via kwantitatieve intensiteitsmetingen die een betrouwbare vergelijking van moleculaire expressie over verschillende experimentele condities mogelijk maken.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Bespreekt de relevantie voor ziektebeelden door axon-sorteringsmolecuulcodes te koppelen aan processen van neurale circuitvorming die toepasbaar zijn op neurodegeneratieve modellen.
- Operationele waarde: Beschrijft de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door longitudinale analyse van axonale regeneratie en re-innervatiepatronen mogelijk te maken.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het testen van hypothesen over targets tot de identificatie van lead-verbindingen, door moleculaire resolutie te bieden van axonale geleidingsmechanismen die cruciaal zijn voor de ontwikkeling van neurotherapeutica.
- Discovery Biology: Legt uit hoe de methode hypothesetoetsing van OR-specifieke axonale geleiding ondersteunt via visualisatie van de combinatorische moleculaire code bij de axonterminals.
- Screening: Beschrijft de gereedheid voor assays door gestandaardiseerde sectiecollectie en immunokleuring die technische variatie tussen monsters minimaliseert.
- Analytics: Benadrukt kwantitatieve read-outs vanuit ImageJ-gebaseerde intensiteitsmetingen die statistische vergelijking van de expressie van axon-sorteringsmoleculen over glomeruli mogelijk maken.
- Translational Research: Verbindt de methode met preklinische continuïteit door analyse mogelijk te maken van olfactorische regeneratieprocessen die relevant zijn voor letselmodellen.
- Enterprise Reuse: Presenteert de methode als een herbruikbare capaciteit voor multiplex proteïneprofilering in andere hersengebieden buiten het olfactorische systeem.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid bij targetvalidatie door directe visualisatie van moleculaire determinanten van axonale segregatie.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid gerealiseerd via consistente protocollen voor weefselinbedding en coupesnijden.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen door het verminderen van mechanistische ambiguïteit in neurale padmodellen.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering door kwantitatieve, biomarker-achtige read-outs van co-expressiepatronen van axon-sorteringsmoleculen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereiste wetenschappelijke expertise in immunohistochemie, cryosectie en fluorescentiemicroscopie.
- Behoeften op het gebied van instrumentatie en analytische infrastructuur, waaronder een cryostaat, fluorescentiemicroscoop en software voor beeldanalyse.
- Vereisten voor standaardisatie tussen teams voor antilichaamvalidatie en consistentie van het kleuringsprotocol.
- Overwegingen voor aanpassing tussen modelsystemen, met name voor weefsels met verschillende inbeddingseigenschappen.
- Praktische beperkingen omvatten de technische uitdaging van de weefseloriëntatie in inbeddingsvormen, waarvoor praktische training nodig is om deze te beheersen.
Veelgestelde vragen over Biofarmacie
Chapters in this video
0:05
Title
5:42
Conclusion
4:26
Results: Quantification of Axon-sorting Molecules in the Olfactory Bulb
1:11
Preparation of Parasagittal Olfactory Bulb Sections
2:33
Day 1: Quadruple Immunostaining of Olfactory Bulb Slices
3:07
Day 2: Quadruple Immunostaining of Olfactory Bulb Slices
3:56
The Use of Fluorescence Intensity Measurements
