Viervoudige Immunostaining van de Olfactorische Lamp voor Visualisatie van Olfactorische Sensorische Axon Moleculaire Identiteitscodes
June 5th, 2017
Olfactorische zintuiglijke neuronen vormen een grote verscheidenheid aan axon-sorterende moleculen om een goede neurale schakeling te vormen. Dit protocol beschrijft een immunohistochemische kleuring methode om combinatorische expressies van axon-sorterende moleculen te visualiseren bij de axon termini van olfactorische sensorische neuronen.
Het algemene doel van deze immuno-histochemische kleuringsmethode is om de gecombineerde expressie van axon-sorteringsmoleculen te visualiseren aan de axon-einden van olfactorische sensorische neuronen. Deze methode kan helpen bij het karakteriseren van belangrijke processen op het gebied van olfactorische ontwikkeling, zoals axon-geleiding, synapsformaties en de regeneratie van olfactorische sensorische neuronen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het wetenschappers toestaat om de expressiepatronen van axon-sorteringsmoleculen in de reukbol te vergelijken en analyseren zonder variatie tussen secties te ondervinden.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de inbeddingsstap moeilijk te leren is, omdat de positie en hoek van het olfactorische weefselmonster in de mal moeilijk in woorden te beschrijven zijn. Begin met hoofden van muizen van één tot twee weken oud die gefixeerd zijn door intracardiale perfusie van 4% paraformaldehyde. Plaats een schaarblad in de ruimte tussen de boven- en ondertanden en snijd horizontaal om het onderkaakbeen te verwijderen.
Verwijder vervolgens overtollig weefsel met pincetten en schaar, om het olfactorische weefsel te laten, inclusief de reukbol en het olfactorische epitheel. Dompel het olfactorische weefsel in PBS om lucht in de neusholte te verwijderen, maak vervolgens een verticale snede om het achterste deel van de hersenen te verwijderen en plaats het olfactorische weefsel met de gesneden uiteindkant naar beneden op de bodem van een inbeddingsmal. Vul de mal met compound voor optimale snijtemperatuur en dompel vervolgens in vloeibare stikstof.
Nadat het weefsel en OCT volledig bevroren zijn, breng het weefsel gedurende een uur in evenwicht in de cryostaat bij 20 graden Celsius. Maak nu seriële parasaggitale secties van de reukbol met de cryostaat en verzamel ze door ze op MAS gecoate glasplaten te plakken. Droog de platen onmiddellijk na het plakken met een föhn.
Begin met immunokleuring door de gedroogde platen vijf minuten bij kamertemperatuur te wassen met PBS. Blokkeer niet-specifieke bindingsplaatsen door de platen een uur te incuberen met 5% blokkeeroplossing bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 400 microliter van een cocktail van primaire antilichamen verdund in 1% blokkeeroplossing toe aan elke plaat.
Incubeer de platen een nacht bij kamertemperatuur. Gooi de volgende dag de primaire antilichaamoplossing weg en was de platen met PBST drie keer gedurende vijf minuten elk bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 400 microliter van een cocktail van secundaire antilichamen en PBS toe aan elke plaat.
Bescherm tegen licht en incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur. Gooi na de incubatie de oplossing weg en was de platen opnieuw drie keer gedurende vijf minuten elk met PBS bij kamertemperatuur. Monteer ten slotte dekglasjes op de platen door twee druppels montagemedium op elke plaat aan te brengen, het dekglasje te plaatsen en luchtbellen te verwijderen.
Verkrijg fluorescente beelden met de fluorescentiemicroscoop met behulp van de juiste filter voor elke fluorofoor. Pas de belichtingstijd aan om fluorescente signalen van het beeld te verkrijgen zonder verzadiging. Definieer de glomerulaire structuur door immunofluorescente signalen van GLUT2.
Gebruik Image J om de kleuringsintensiteiten van axon-sorteringsmoleculen binnen glomeruli te meten. Dit beeld toont een parasaggitale reukbolsectie van een twee weken oude muis geïmmunokleurigd met antilichamen tegen VGLUT2, Kirrel2 getoond in rood, Semaforine 7A getoond in groen en OLPC in blauw. Het samengevoegde beeld toont dat de axon-sorteringsmoleculen die betrokken zijn bij glomerulaire segregatie in een positie-onafhankelijk mozaïekpatroon worden uitgedrukt.
Elke glomerulus wordt gedefinieerd door fluorescente signalen van de presynaptische marker VGLUT2. De glomerulaire structuren zijn omgeven door stippellijnen. Signaalintensiteiten van axon-sorteringsmoleculen werden in elke glomerulus gemeten.
Zoals hier te zien is, worden axon-sorteringsmoleculen differentieel uitgedrukt in elke glomerulus. Glomerulus 3 heeft bijvoorbeeld hoge niveaus van OLPC, intermediaire niveaus van Semaforine 7A en lagere niveaus van Kirrel2, en dit verschil kan worden gekwantificeerd door de kleuringsintensiteit te meten. Terwijl glomerulus 4 hoge niveaus van OLPC heeft en lagere niveaus van Kirrel2 en Semaforine 7A.
Nogmaals, dit verschil kan worden gekwantificeerd door de kleuringsintensiteit te meten. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om post-fixatie met PFA en behandeling met sucrose-oplossing weg te laten, die normaal gesproken worden aanbevolen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u meer glomeruli op de enkele reukbolsectie kunt plaatsen en hoe u hoogwaardige immunokleuring met meerdere antilichamen kunt uitvoeren, die op andere hersengebieden kunnen worden toegepast.
Vergeet niet te hopen dat deze methode u zal helpen succes te hebben in uw toekomstige experimenten.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft een immunohistochemische kleuringsmethode om de expressie van axon-sorting moleculen te visualiseren aan de axon-einden van olfactorische sensorische neuronen. Deze techniek is cruciaal voor het begrijpen van olfactorische ontwikkelingsprocessen zoals axon-geleiding en synapse-vorming.
Belangrijke Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Olfactorische ontwikkeling
- Immunohistochemie
Achtergrond
- Olfactorische sensorische neuronen spelen een sleutelrol in het reukvermogen.
- Axon-sorting moleculen zijn essentieel voor het vestigen van goede neurale circuits.
- Het begrijpen van hun expressiepatronen kan inzicht geven in de functies van het olfactorische systeem.
- Het visualiseren van deze expressies kan helpen bij het bestuderen van regeneratieprocessen in olfactorische sensorische neuronen.
Doel van het Onderzoek
- Om de gecombineerde expressie van axon-sorting moleculen te visualiseren.
- Om belangrijke processen in olfactorische ontwikkeling te karakteriseren.
- Om vergelijking van expressiepatronen in de reukbol te vergemakkelijken.
Gebruikte Methoden
- Immunohistochemische kleuringstechniek.
- Gebruik van muizenhoofden van één tot twee weken oud.
- Intracardiale perfusie met 4% paraformaldehyde voor fixatie.
- Inbedding en doorsneden van olfactorische weefselmonsters.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle visualisering van axon-sorting molecuulexpressies.
- De mogelijkheid aangetoond om expressiepatronen te analyseren zonder variatie tussen secties.
- Een duidelijke methode geboden voor het inbedden van olfactorische weefsels.
- De belangrijkheid benadrukt van visuele demonstraties voor het leren van de techniek.
Conclusies
- De immunohistochemische methode is effectief voor het bestuderen van olfactorische sensorische neuronen.
- Het begrijpen van axon-sorting moleculen kan kennis van de ontwikkeling van het olfactorische systeem verbeteren.
- Deze techniek kan een waardevol hulpmiddel zijn voor toekomstig onderzoek naar olfactorische regeneratie.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
This method enables precise molecular mapping of axon-sorting molecules in the olfactory bulb, supporting target validation in neurodevelopmental research. By allowing quantitative comparison of protein expression patterns across glomeruli without section-to-section variability, it enhances predictive confidence in mechanistic studies of neural circuit formation. The approach provides a scalable, reproducible platform for de-risking hypotheses related to axon guidance and synaptic specificity in preclinical discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of molecular identity codes at axon termini to clarify target engagement mechanisms in olfactory sensory neuron development.
- Operational Value: Supports functional target validation by correlating axon-sorting molecule expression with glomerular organization patterns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing standardized immunostaining protocols for multiplex protein detection.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through consistent glomerular definition using VGLUT2 as a presynaptic marker.
- Strategic Value: Highlights screening readiness via quantitative intensity measurements that enable reliable comparison of molecular expression across experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by linking axon-sorting molecule codes to neural circuit formation processes applicable to neurodegenerative models.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling longitudinal analysis of axonal regeneration and reinnervation patterns.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification by providing molecular resolution of axon guidance mechanisms critical for neurotherapeutic development.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing of OR-specific axon guidance through combinatorial molecular code visualization at axon termini.
- Screening: Describes assay readiness through standardized section collection and immunostaining that minimizes technical variation across samples.
- Analytics: Highlights quantitative readouts from ImageJ-based intensity measurements that enable statistical comparison of axon-sorting molecule expression across glomeruli.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by enabling analysis of olfactory regeneration processes relevant to injury models.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for multiplex protein profiling in other brain regions beyond the olfactory system.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct visualization of molecular determinants of axonal segregation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability achieved via consistent tissue embedding and sectioning protocols.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in neural pathway models.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through quantitative biomarker-like readouts of axon-sorting molecule co-expression patterns.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in immunohistochemistry, cryosectioning, and fluorescent microscopy.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including cryostat, fluorescence microscope, and image analysis software.
- Cross-team standardization requirements for antibody validation and staining protocol consistency.
- Adaptation considerations across model systems, particularly for tissues with different embedding properties.
- Practical limitations include the technical challenge of tissue orientation in embedding molds, which requires hands-on training to master.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
5:42
Conclusion
4:26
Results: Quantification of Axon-sorting Molecules in the Olfactory Bulb
1:11
Preparation of Parasagittal Olfactory Bulb Sections
2:33
Day 1: Quadruple Immunostaining of Olfactory Bulb Slices
3:07
Day 2: Quadruple Immunostaining of Olfactory Bulb Slices
3:56
The Use of Fluorescence Intensity Measurements
