Selectieafhankelijke en onafhankelijke generatie van CRISPR / Cas9-gemedieerde Gene Knockouts in zoogdiercellen

Het doel van deze procedure is om clonale knockout-cellijnen te isoleren en identificeren die zijn gegenereerd door twee soorten CRIPSR/Cas9-gemedieerde genoombewerking. De ene methode detecteert eiwitknockout veroorzaakt door niet-homologe eindverbinding, terwijl de andere genomische verstoringen detecteert die worden gegenereerd door homologie-gerichte reparatie. Deze methode is bijzonder nuttig op het gebied van moleculaire biologie, waar het genereren van cellijnen met genetische verstoringen een belangrijk hulpmiddel is bij het ontleden van genfunctie.

Het grote voordeel van deze techniek is dat het een snelle en relatief hoge doorvoermethode is die eenvoudig kan worden uitgevoerd met behulp van basistechnieken uit de moleculaire biologie. Niet-homologe eindverbinding introduceert kleine deleties of inserties en wordt beoordeeld door een dot immunoblot, terwijl homologie-gerichte reparatie grotere en nauwkeurigere verstoringen mogelijk maakt en wordt beoordeeld door kolonie PCR. Dit experiment maakt gebruik van T-REx-293-cellen gekweekt in DMEM-medium, aangevuld met 10% FBS bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Voor de transvectie, plateer de cellen op zesputjes en sluit een putje voor een niet-transvecteerde controle in. Laat de cellen groeien tot ongeveer 70% confluency. Transveceer de cellen met 2,5 microgram totaal plasmide met behulp van een commercieel transvectieprotocol.

Voor transvectie van cellen zonder selectie, gebruik 2,5 microgram Cas9-sgRNA-plasmide. Voor transvectie van cellen met selectie, gebruik 0,75 microgram Cas9-sgRNA1, 0,75 microgram Cas9-sgRNA2 en één microgram homoloog recombinatie-template. Incubeer de transvecteerde cellen en de niet-transvecteerde controle bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 48 uur.

Voor cellen die met selectie zijn transvecteerd, begin de geneesmiddelselectie door de cellen te behandelen met het juiste geneesmiddel, wat in dit geval Neomycin is. Plaats de zes-putjesplaat terug in de incubator. Observeer de behandelde cellen eenmaal per dag om de sterftepercentages van de cellen te controleren, totdat alle cellen in de niet-transvecteerde controle dood zijn.

Om clonale populaties te isoleren, laat de cellen eerst groeien tot 100% confluency in de originele put na selectie. Maak vervolgens seriële verdunningen van de cellen en tel de cellen. Aangezien de juiste generatie van monoklonale kolonies cruciaal is voor het verkrijgen van een volledige knockout, moet er zorgvuldig worden gezorgd voor het bepalen van de juiste verdunning voor het plaatsen van cellen op de gewenste dichtheid.

Zodra de juiste verdunning is bepaald, plaats de cellen in 96-putjesplaten met een dichtheid van 0,33 cellen per putje. Het plaatsen van drie 96-putjesplaten is een goed startpunt om te zorgen voor isolatie van meer dan één correcte kloon. Gedurende een periode van twee tot vier weken, observeer de kolonies totdat de kolonies zichtbaar zijn voor het oog.

Deze representatieve afbeeldingen tonen kolonies in verschillende groeistadia. Een enkele cel bij het plaatsen, cellen op dag vijf en een goed gevestigde kolonie op dag tien. Gebruik een steriele pipettetip, pik zichtbare kolonies voorzichtig en nauwkeurig en plaats ze opnieuw in nieuwe putjes om monolaaggroei te stimuleren.

Ga door met het kweken van de cellen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Knockout-kandidaten zonder selectie worden gescreend door dot immunoblot om het eiwitproduct op een hoogwaardige manier te beoordelen. Nadat individuele klonen zijn gekweekt tot 50 tot 100% confluency, los de monolaag van cellen op door in de putje te pipetten.

Pipet 90 microliter van de 100 microliter totale inhoud uit elke putje naar een schone microcentrifugebuis. Voor de doeleinden van deze video worden slechts twee monsters verwerkt. Spin omlaag bij 6.000 RPM gedurende vijf minuten, verwijder het medium en lyseer de celpellet in 10 microliter van 1X SDS-laadbuffer.

Voeg 90 microliter nieuw medium toe aan de resterende cellen in de putje en plaats de plaat terug in de incubator om de cellen verder te kweken. Pipet één microliter cellysaat op een droge nitrocellulosemembraan om een dot te vormen. Bloot elk monster twee keer op twee afzonderlijke membranen, waardoor twee identieke monsterspatronen worden gecreëerd.

Blokkeer de membranen in 5% melk in TBST bij kamertemperatuur, met wiegen, gedurende één uur. Na één uur, bloot de membranen met primaire antilichamen bij de aanbevolen primaire antilichaamverdunning en TBST plus 5% melk. Op één membraan gebruikt u het primaire antilichaam tegen het doeleiwit, ELAVL1 in dit experiment.

Op het andere membraan, gebruikt u het primaire antilichaam voor een controle-eiwit dat naar verwachting niet zal veranderen, PUM2 wordt hier gebruikt. Incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur. Verwijder de primaire antilichaamoplossing van elk blot, voeg TBST toe en incubeer gedurende vijf minuten.

Op deze manier wast u de blots drie keer met TBST. Vervolgens voegt u aan elk membraan het juiste HRP-geconjugeerde secundaire antilichaam toe en bloot u op kamertemperatuur gedurende één uur. Na één uur, wast u de membranen drie keer met TBST gedurende vijf minuten elke keer.

Breng een chemiluminescente substraatoplossing aan op de blots, volgens de instructies van de fabrikant, en beeld de geblootste membranen af op een digitale chemiluminescentie imager. Ten slotte, kwantificeer de dot-intensiteiten voor het doel- en controle-eiwit met behulp van de juiste software en analyseer de resultaten zoals beschreven in het tekstprotocol. Kandidaten met het selecteerbare resistentiemerker worden gescreend door kolonie PCR.

Begin deze procedure door individuele kolonies in een nieuwe 96-putjesplaat te dupliceren en ze te laten groeien tot 100% confluency voor de bereiding van cellysaten. Verwijder het medium van een set van de klonen, suspendeer de cellen uit elke putje in 30 microliter extractiebuffer uit een commercieel DNA-voorbereidingskit en breng over naar