Name: Chromatine Immunoprecipitatie (ChIP) in Muis T-cellijnen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Leer chromatine immunoprecipitatie in muizen T-cellijnen voor chromatinebiologie. Deze methode onderzoekt histonmarkeringen en genregulatie tijdens T-celactivatie met hoge reproduceerbaarheid.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij zijn dankbaar voor P. Käse en T. Schmidt-Wöll voor uitstekende technische bijstand. Dit werk werd ondersteund door de samenwerkingsonderzoek TRR81 en het Heisenberg-programma (BO 1639 / 5-1) van de DFG, de Max Planck Society en de EXC 294 in Freiburg en de Excellence Cluster voor Cardio Pulmonary System (ECCPS) in Giessen naar TB

OPMERKING: Alle buffers en het medium dat in dit protocol wordt gebruikt, staan ​​in tabel 1 . Dagen 1 en 2 1. Crosslinking van de cellen <ol><li> Plaats de muis T-cellen van een 6-putjesplaat naar een 50 ml buis en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 4 ° C en ~ 271 x g. Resuspendeer de celpellet in 30 ml IMDM-celkweekmedium en tel de cellen met behulp van een Neubauer kamer. </li><li> Verzamel aliquots van 20 x 106 cellen in nieuwe 50 ml buizen. </li><li> Voeg formaldehyde (FMA) toe aan een 1% uiteindelijke concentratie direct aan het celkweekmedium en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Let op: FMA is giftig bij inademing, dus werk onder een afzuigkap en draag voldoende beschermende uitrusting. Behandel ook FMA-afval volgens de regels van de gastinstelling. </li><li> Voeg een 1/8-volume 1 M glycine, pH 7,0, toe en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li><li> Pellet de cellen door centrifugeren voor 5Min bij 4 ° C en ~ 271 xg en wassen met 10 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> Was de celpelletje met 1 ml PBS en overbrengen naar 1,5 ml buizen. </li></ol> 2. Cell Lysis en Chromatin Shearing <ol><li> Resuspendeer de celpellet in 1 ml SDS lysisbuffer en incubeer op ijs gedurende 10 minuten. </li><li> Breng elk monster over naar een sonicatiebuis en voer scheren uit door gebruik te maken van een gefocuste ultrasonicator volgens de in tabel 2 aangegeven instellingen . </li><li> Na afscheiding, de monsters overbrengen naar 1,5 ml buizen en centrifuge gedurende 10 minuten bij 4 ° C en ~ 18.000 x g. </li><li> Breng de supernatant over naar nieuwe buizen. </li><li> Verzamel 50 μL om de scheerfficiëntie volgens stap 3 te bepalen en snijd het gesneden lysaat in vloeibare stikstof af. Bewaar het lysaat in eenmalig gebruik bij -80 ° C. </li></ol> 3. Bepaling van scherpe efficiëntie <ol><li> Voeg 50 μl elutiebuffer toe aan de 50 &amp; #181; L van elk gesneden lysaat en incuberen bij 65 ° C overnacht, met schudden. </li><li> Voeg 100 μl TE buffer en 4 μL 10 mg / ml RNase A (0,2 μg / μl uiteindelijke concentratie) toe. Meng en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C, met schudden. </li><li> Voeg 2 μL 20 mg / ml protease K (0,2 μg / μl eindconcentratie) toe aan elk monster en incubeer gedurende 2 uur bij 55 ° C, met schudden. </li><li> Breng elk monster over naar een gelbuis die geschikt is voor fenol / chloroform / isoamylalcohol extractie; Handelen volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Voeg 200 μl fenol / chloroform / isoamylalcohol (25: 24: 1) toe en schud de buizen. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 24 ° C en ~ 16.000 xg en verplaats de bovenste fase naar nieuwe buizen. Voorzichtigheid: Fenol, chloroform en isoamylalcohol zijn giftig bij inademing en corrosief; Werk onder een afzuigkap en draag persoonlijke beschermingsmiddelen. Behandel ook fenol-, chloroform- en isoamylalcoholafval acVolgens de regels van de gastinstelling. <ol><li> Herhaal een keer. </li></ol></li><li> Reinig het DNA met behulp van zuiveringskolommen volgens de instructies van de fabrikant, met de volgende wijzigingen: <ol><li> Was de membraan tweemaal tweemaal. Na de laatste was laat de buis 2 minuten op kamertemperatuur open staan ​​om de resterende ethanol te verdampen. </li><li> Voor de elutie voeg 50 μL H20 toe, incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut, draai de buis gedurende 1 s om het membraan goed nat te maken en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut voordat het DNA door 1 minuut centrifugeren wordt geëlueerd 24 ° C en ~ 17.900 x g. </li></ol></li><li> Kwantificeer het gezuiverde DNA op een fluorometer met behulp van een hoge gevoeligheidskit volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Analyseer ongeveer 500 ng van het gezuiverde DNA op een 1,8% agarosegel en ongeveer 1 ng op een elektroforese systeem met behulp van een hoge gevoeligheidskit. OPMERKING: De verwachte sizE van de DNA-fragmenten is tussen 200 en 500 bp. </li></ol> Dagen 3 en 4 4. Immunoprecipitatie <ol><li> Verdun 1 volume gesneden lysaat met 5 volumes verdunningsbuffer. </li><li> Preclear met 30 μL / ml eiwit Een agarose kralen (bereid volgens bijlage A ) gedurende 30 minuten tijdens het roteren in de koude kamer. </li><li> Centrifugeer bij 4 ° C gedurende 5 minuten bij ~ 750 x g. </li><li> Verzamel 10% van de invoer en sla het op bij 4 ° C. </li><li> Aliquot de gewenste hoeveelheid lysaat in nieuwe buizen (zie tabel 3 voor details). Voeg de gewenste antilichamen toe aan elke buis (zie tabel 3 voor details) en draai overnacht bij 4 ° C. </li><li> Voeg 40 μl eiwit een kralen toe en incubeer gedurende 1 uur bij 4 ° C tijdens het roteren. </li><li> Was de kralen met 1 ml laagzoutbuffer, hoge zoutbuffer, LiCl-buffer en TE-buffer (voor elke was, incubeer gedurende 5 minuten bij 4 ° C tijdens rotatie en centrifugeGedurende 3 minuten bij 4 ° C en ~ 950 xg). Zie tabel 3 voor details. </li><li> Voeg 110 μl elutiebuffer toe en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, vortex elke 2 minuten. </li><li> Centrifugeer gedurende 3 minuten bij 4 ° C en ~ 950 xg en overbreng 100 μL supernatant naar een nieuwe 1,5 ml buis. </li><li> Herhaal stappen 4.7-4.8 met 100 μl elutiebuffer en combineer de eluaten. Voeg elutiebuffer tot 200 μL toe om de monsters in te voeren. </li><li> Incubeer alle monsters overnacht bij 65 ° C, met schudden. </li></ol> Dag 5 5. DNA-zuivering <ol><li> Voeg 200 μl TE buffer aan elk eluaat toe en 8 μl 10 mg / ml RNase A (0,2 μg / μl eindconcentratie). Meng en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C, met schudden. </li><li> Voeg 4 μL 20 mg / ml protease K (0,2 μg / μl uiteindelijke concentratie) toe aan elk eluaat en incubeer gedurende 2 uur bij 55 ° C, met schudden. </li><li> Breng elk monster over naar een gelBuis geschikt voor fenol / chloroform / isoamylalcohol extractie; Handelen volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Voeg 400 μl fenol / chloroform / isoamylalcohol (25: 24: 1) toe en schud de buizen. Centrifuge gedurende 5 minuten bij 24 ° C en ~ 16.000 x g. Breng de bovenste fase over naar nieuwe buizen. Voorzichtigheid: Fenol, chloroform en isoamylalcohol zijn giftig bij inademing en corrosief; Werk onder een afzuigkap en draag persoonlijke beschermingsmiddelen. Behandel ook fenol-, chloroform- en isoamylalcoholafval volgens de regels van de gastinstelling. <ol><li> Herhaal een keer. </li></ol></li><li> Reinig het DNA met behulp van zuiveringskolommen volgens de instructies van de fabrikant, met de volgende wijzigingen: </li><li> Was de membraan tweemaal tweemaal. Na de laatste was laten de buizen gedurende 2 minuten op kamertemperatuur open staan ​​om de resterende ethanol te verdampen. </li><li> Voeg bij de elutie 50 μl H20 toe, incubeer bij kamertemperatuur1 minuut draaien, de buizen voor 1 s draaien om het membraan goed nat te maken en gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur te incuberen alvorens het DNA gedurende 1 min bij 24 ° C en ~ 17,900 x g te elueren. </li></ol>

<ol><li>Rothenberg, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromatin+landscape+and+transcription+factors+in+T+cell+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">The chromatin landscape and transcription factors in T cell programming.</a> Trends Immunol. 35 (5), 195-204 (2014).</li>
<li>Zhang, J. A., Mortazavi, A., Williams, B. A., Wold, B. J., Rothenberg, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+transformations+of+genome-wide+epigenetic+marking+and+transcriptional+control+establish+T+cell+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic transformations of genome-wide epigenetic marking and transcriptional control establish T cell identity.</a> Cell. 149 (2), 467-482 (2012).</li>
<li>Cauchy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+recruitment+of+Ets1+to+both+nucleosome-occupied+and+-depleted+enhancer+regions+mediates+a+transcriptional+program+switch+during+early+T-cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic recruitment of Ets1 to both nucleosome-occupied and -depleted enhancer regions mediates a transcriptional program switch during early T-cell differentiation.</a> Nucl Acids Res. 44 (8), 3567-3585 (2016).</li>
<li>Koch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+initiation+platforms+and+GTF+recruitment+at+tissue-specific+enhancers+and+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcription initiation platforms and GTF recruitment at tissue-specific enhancers and promoters.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (8), 956-963 (2011).</li>
<li>Pekowska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K4+tri-methylation+provides+an+epigenetic+signature+of+active+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">H3K4 tri-methylation provides an epigenetic signature of active enhancers.</a> EMBO J. 30 (20), 4198-4210 (2011).</li>
<li>Vanhille, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+and+quantitative+assessment+of+enhancer+activity+in+mammals+by+CapStarr-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-throughput and quantitative assessment of enhancer activity in mammals by CapStarr-seq.</a> Nat Commun. 6, 6905(2015).</li>
<li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Ernst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+analysis+of+chromatin+state+dynamics+in+nine+human+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types.</a> Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).</li>
<li>Ostuni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latent+enhancers+activated+by+stimulation+in+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Latent enhancers activated by stimulation in differentiated cells.</a> Cell. 152 (1-2), 157-171 (2013).</li>
<li>Giaimo, B. D., Oswald, F., Borggrefe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+chromatin+regulation+at+Notch+target+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Transcription%22%5BJournal%5D)">Dynamic chromatin regulation at Notch target genes.</a> Transcription. 8 (1), 61-66 (2017).</li>
<li>Liefke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+demethylase+KDM5A+is+an+integral+part+of+the+core+Notch-RBP-J+repressor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Histone demethylase KDM5A is an integral part of the core Notch-RBP-J repressor complex.</a> Genes Dev. 24 (6), 590-601 (2010).</li>
<li>Jung, C., Mittler, G., Oswald, F., Borggrefe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+helicase+Ddx5+and+the+noncoding+RNA+SRA+act+as+coactivators+in+the+Notch+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">RNA helicase Ddx5 and the noncoding RNA SRA act as coactivators in the Notch signaling pathway.</a> Biochim Biophys Acta. 1833 (5), 1180-1189 (2013).</li>
<li>Oswald, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phospho-dependent+mechanism+involving+NCoR+and+KMT2D+controls+a+permissive+chromatin+state+at+Notch+target+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A phospho-dependent mechanism involving NCoR and KMT2D controls a permissive chromatin state at Notch target genes.</a> Nucl Acids Res. 44 (10), 4703-4720 (2016).</li>
<li>Arrigoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardizing+chromatin+research%3A+a+simple+and+universal+method+for+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Standardizing chromatin research: a simple and universal method for ChIP-seq.</a> Nucl Acids Res. 44 (7), e67(2016).</li>
<li>Essen, D., Dullforce, P., Brocker, T., Gray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+interactions+involved+in+Th+cell+memory%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cellular interactions involved in Th cell memory.</a> J Immunol. 165 (7), 3640-3646 (2000).</li>
<li>White, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+better+cell+lines+for+making+hybridomas+expressing+specific+T+cell+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Two better cell lines for making hybridomas expressing specific T cell receptors.</a> J Immunol. 143 (6), 1822-1825 (1989).</li>
<li>Ghisletti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+enhancers+controlling+the+inflammatory+gene+expression+program+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of enhancers controlling the inflammatory gene expression program in macrophages.</a> Immunity. 32 (3), 317-328 (2010).</li>
<li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li>
<li>Rothbart, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Interactive+Database+for+the+Assessment+of+Histone+Antibody+Specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity.</a> Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).</li>
<li>Fenouil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CpG+islands+and+GC+content+dictate+nucleosome+depletion+in+a+transcription-independent+manner+at+mammalian+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">CpG islands and GC content dictate nucleosome depletion in a transcription-independent manner at mammalian promoters.</a> Genome Res. 22 (12), 2399-2408 (2012).</li>
<li>Hein, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+methylation+of+Notch1+controls+the+amplitude+and+duration+of+the+Notch1+response%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Site-specific methylation of Notch1 controls the amplitude and duration of the Notch1 response.</a> Sci Signal. 8 (369), ra30(2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

ChIP is een geldige techniek om te onderzoeken of eiwitten of hun PTM&#39;s verrijkt zijn in specifieke genomische gebieden. ChIP analyse resultaten zijn vaak moeilijk te interpreteren vanwege biologische of technische redenen. De biologische redenen zijn veelvuldig en omvatten zwakke of indirecte binding van eiwitten aan DNA. Er zijn ook technische beperkingen, zoals beperkte antilichaamspecificiteit en inefficiënte cellysis of chromatinafscheiding. Een probleemoplossingsgids ( tabel 5 ) kan de lezer helpen om de problemen op te lossen die kunnen worden geconfronteerd met ChIP-analyses. Dit protocol, die gebruik maakt van een koelgerichte ultrasonische inrichting, maakt het mogelijk om de chromatine van een volwassen T-cellijn van de muis doeltreffend te scheren. De belangrijkste kritische stap van het protocol wordt weergegeven door het scheren van de chromatine, die altijd voor elk celtype geoptimaliseerd moet worden. Er wordt voorgesteld om het aantal cellen en het aantal sonicatie cycli te variëren. Bovendien, de zij<html> Aring efficiëntie wordt negatief beïnvloed door de aanwezigheid van SDS precipitaten in de monsters, die tijdens de lysis van de cellen op ijs kunnen vormen met SDS lysis buffer. In dit geval is het het beste om het monster gedurende een paar minuten bij kamertemperatuur na kamertemperatuur te incuberen om de aanwezigheid van SDS-precipitaten te verminderen. Het wordt aangeraden het protocol te optimaliseren om scherpe fragmenten tussen 200 en 500 bp te verkrijgen en om altijd de afscheidingskwaliteit van de monsters te beoordelen alvorens te gaan met de immunoprecipitatie. Bovendien moet de fixatietijd, hoeveelheid antilichaam en / of cellen en de wasomstandigheden worden geoptimaliseerd voor elk antilichaam. Nog een kritische stap in het succesvol maken van een ChIP-procedure is de keuze van het antilichaam, aangezien de lage specificiteit antilichamen de efficiëntie van de immunoprecipitatie aanzienlijk verminderen. Voorheen is een uniforme kwaliteits test procedure toegestaan ​​voor de evaluatie van de specificiteit van verschillende antilichamen die op de markt beschikbaar zijn<html> Ss = &quot;xref&quot;&gt; 19. De screening pijpleiding was gebaseerd op dot blot, Western blot en ChIP, die een lijst van hoogwaardige reagentia geschikt voor ChIP 19 leverde. Meer recent werd de specificiteit van verscheidene in de handel verkrijgbare antilichamen geëvalueerd onder toepassing van hoge-dichtheid histone peptide microarray platforms, waardoor het mogelijk is een database op te stellen voor antilichaam specificiteit 20 . De lezer kan dit handige hulpmiddel gebruiken om de meest specifieke antilichamen die kunnen worden gebruikt voor ChIP-experimenten, te identificeren. Dit protocol is niet getest op primaire T-cellen en in dit geval moet de lezer verwijzen naar andere gepubliceerde protocollen die ChIP succesvol uitvoeren op primaire T-cellen 3 , 4 , 21 . Met name is dit protocol succesvol gebruikt voor het uitvoeren van ChIP op een T-cellijn van een muisprogenitor, evenals op een endotheliale cellijn van de muis. Ove_content &quot;&gt; 5 x 10 6 cellen dienen te worden gebruikt voor elke immunoprecipitatie voor de analyse van histonenmerken. Omdat dit protocol ook geschikt kan zijn, met enige optimalisatie, om ChIP op TFs of cofactoren uit te voeren, is het het beste om het aantal cellen te verhogen In deze gevallen wordt gebruikt voor de immunoprecipitatie. Om het vereiste aantal cellen voor elk experiment te bereiken, kunnen meer aliquots van gesneden lysaat samengevoegd worden voordat het chromatine in de verdunningsbuffer verdund wordt. Dit protocol kan ook worden aangepast om ChIP uit te voeren op endogene eiwitten die niet direct aan het DNA binden. In dit geval kan pre-fixatie met eiwit-eiwit verknopers ( bijv. Dimethyl adipimidaat, DMA) worden vereist (zie bijlage B voor meer informatie). De succesvolle prestatie van ChIP op cofactoren werd eerder gedaan door overexpressie van eiwitten die gefuseerd zijn aan een biotin-tag. In dit geval werd het eiwit gezuiverd met streptavidine-conjugaTed magnetische kralen, en een pre-fixatie met DMA werd uitgevoerd 22 .

Ontwikkeling, differentiatie en homeostase zijn afhankelijk van specifieke genuitdrukkingsprogramma&#39;s die worden vastgesteld door signalering van gebeurtenissen die de chromatinstructuur moduleren en daarom bepalen of een specifiek gen op een cel- en tijdspecifieke manier geactiveerd of onderdruk wordt. Tijdens de ontwikkeling van T-cellen moeten specifieke genuitdrukkingsprogramma&#39;s worden vastgesteld om de rijping van T-celprecursoren van de dubbel-negatieve (DN) naar de enkele positieve (SP) toestand te bepalen, die door middel van meerdere tussenstadia 1 doorlopen. Hoe het genexpressieprogramma dynamisch gereguleerd is tijdens de T-celontwikkeling is in de voorgaande jaren door diverse laboratoria 2 , 3 , 4 , 5 , 6 in grote mate onderzocht. Door post-translationele modificaties (PTM&#39;s) van histonen, de uitwisseling vanKanonische histonen met histonvarianten, nucleosoomuitzetting en DNA-methylering regelen de ON / OFF-switch van genen. Verschillende groepen hebben de genoom-brede verdeling van PTM&#39;s en histon-varianten onderzocht om markeringen te bepalen die met verschillende chromatinestanden in zowel proximale als distale regulerende gebieden 7 , 8 , 9 , 10 geassocieerd zijn. Signalerende cascades orchestreer dynamische chromatinregulatie via de uitwisseling van positieve en negatieve chromatine-modificerende enzymen (ook bekend als chromatine-modificatoren) bij specifieke versterkerelementen. Deze chromatine modificatoren regelen de chromatinstructuur en dus de transcriptie-uitvoer door bijvoorbeeld dynamische histonmetylering en acetylering. Dit is het geval in de Notch signaleringsroute 11 , 12 , 13 ,14. Dynamische histon PTM&#39;s; Uitwisselingen met histon varianten; En de dynamische bezetting van histonen, transcriptiefactoren en cofactoren kunnen worden onderzocht door chromatine immunoprecipitatie (ChIP) assays. Hoogspecifieke antilichamen worden gebruikt om specifieke DNA-eiwitcomplexen te zuiveren en het gezuiverde DNA wordt geanalyseerd door kwantitatieve PCR (qPCR); Diep-sequencing (ChIP-Seq); Of minder vaak tegenwoordig hybridisatie naar microarray (ChIP-ChIP). ChIP assays zijn soms uitdagend door complicaties met de lysis van de cellen, afscheiding van de chromatine en / of lage specificiteit van de antilichamen. Verschillende strategieën zijn aangenomen om het protocol te verbeteren, zoals het geval is voor NEXSON 15 . Het gebruik van koelwaterbad-sonicators vermijdt de verhitting van het monster dat de aanwezige epitopen kan beschadigen op het onderzochte eiwit, maar de energie die nodig is voor het scheren van de monsters wordt in het water verspreid.Er is nog een verbetering geboekt bij de ontwikkeling van gefocusseerde ultrasonische apparaten die de verspreiding van de energie voorkomen. Daarom zorgen de gefocusseerde ultrasonische apparaten voor verbeteringen in cellysis en chromatinafscheiding, waardoor operator-geïnduceerde variaties elimineren en de reproduceerbaarheid aanzienlijk verhogen. Dit werk beschrijft een protocol (schematisch overzicht in Figuur 1 ) om het ChIP van histonproteïnen efficiënt uit te voeren in een volwassen T-cellijn van de muis, genaamd E2-10HA 16 , 17 . T-cellen zijn meestal moeilijk om te lichten en de afscheiding van hun chromatine is gebleken dat ze ondoeltreffend zijn. In dit protocol, dat gebruik maakt van een koelgerichte ultrasonicator, werden het aantal cellen, de lysisbuffer en de schaarinstelling geoptimaliseerd voor de E2-10HA muis T-cellijn. Met dit protocol kunt u ChIP met hoge reproduceerbaarheid en in een redelijke tijd uitvoeren. In feite is het nodigIs ongeveer twee dagen om de chromatine te scheren en de kwaliteit van het scheren te evalueren en drie dagen om de immunoprecipitatie te verrichten, de verknoping om te zetten en het DNA te zuiveren.

<table><tbody><tr><td>Agilent High Sensitivity D5000 Reagents</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5593</td><td></td></tr><tr><td>Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5592</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Tapestation 4200</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2991AA</td><td></td></tr><tr><td>Covaris S220 AFA System</td><td>Covaris</td><td>500217</td><td></td></tr><tr><td>dimethyl adipimidate (DMA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20660</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Pan-Biotech</td><td>1502-P121301</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde (FMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Insulin solution human&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM)</td><td>Gibco</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>Minimum essential medium non-essential amino acids (MEM NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>nProtein A Sepharose 4 Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5280-02</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Peptone primatone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4963-100G</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Heavy 2&nbsp;mL</td><td>5 Prime</td><td>2302830</td><td></td></tr><tr><td>Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)</td><td>Roth</td><td>A156.2</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>GIBCO</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Qubit assay tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>RNase A, DNase and protease-free (10&nbsp;mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Tube AFA Fiber &amp; Cap</td><td>Covaris</td><td>520081</td><td></td></tr></tbody></table>

chromatine immunoprecipitatie (chip) in muis t-cellijnen

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signaleringsbanen regelen genuitdrukkingsprogramma&#39;s via de modulatie van de chromatinstructuur op verschillende niveaus, zoals door post-translationele modificaties (PTM&#39;s) van histonestaarten, de uitwisseling van canonische histonen met histonvarianten en nucleosome-uitzetting. Dergelijke regulatie vereist de binding van signaalgevoelige transcriptiefactoren (TF&#39;s) die chromatine-modificerende enzymen aanwenden bij regulatorische elementen gedefinieerd als versterkers. Om te begrijpen hoe signaalcascades versterkeractiviteit regelen, vereist een uitgebreide analyse van de binding van TF&#39;s, chromatine-modificerende enzymen en de bezetting van specifieke histoonmerken en histon-varianten. Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) assays gebruiken zeer specifieke antilichamen om specifieke eiwit / DNA complexen te immunoprecipiteren. De daaropvolgende analyse van het gezuiverde DNA laat de identificatie toe van het gebied dat door het antilichaam wordt herkend door het eiwit. Dit werk beschrijft een protocol om efficiënt te peRform ChIP van histonproteïnen in een volwassen muis T-cellijn. Het gepresenteerde protocol maakt het mogelijk om ChIP-analyses te verrichten in een redelijk tijdschema en met een hoge reproduceerbaarheid.

Oudere muizen T-cellen werden onderworpen aan ChIP analyse om de verrijking van de histonmark monomethylering van lysine 4 op histone 3 (H3K4me1), trimethylering van lysine 4 op histone 3 (H3K4me3) te onderzoeken en acetylering van lysine 27 op Histone 3 (H3K27ac), evenals de nucleosome bezetting, zoals blijkt uit panH3 ChIP. De afscheidingskwaliteit werd geëvalueerd door analyse op een 1,8% agarosegel ( Figuur 2A ) en op een elektroforese systeem ( Figuur 2B ). H3K4me1 en H3K4me3 worden in het algemeen gebruikt om respectievelijk versterkersites en promotors te identificeren ( Figuur 3A ). In feite is H3K4me3 prominent maar niet uitsluitend verrijkt bij promotors 5 , 8 , 14 . Een kenmerk van actieve versterkers moet zeer verrijkt zijn voor H3K4me1 en H3K27ac en slecht verrijkt voor H3K4me3 (&lt;Sterke klasse = &quot;xfig&quot;&gt; Figuur 3A, bovenste paneel), terwijl inactieve versterkers lage hoeveelheden H3K4me3 en H3K27ac bevatten maar hoge niveaus van H3K4me1 ( Figuur 3A , onderpaneel). Zoals getoond in Figuur 3B is het Glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase ( Gapdh ) gen representatief voor de analyse van actieve genpromotoren ( Gapdh promotor ). In feite toont het hoge niveaus van H3K4me3 en H3K27ac en lage H3K4me1 niveaus. In figuur 3B is Deltex1 ( Dtx1 ) representatief voor inactieve versterkers ( Dtx1 versterker ), aangezien het zeer verrijkt is voor H3K4me1 en slecht verrijkt voor H3K4me3 en H3K27ac. Gene woestijn is representatief voor een regio die geen coderende genen heeft en wordt meestal gedagvaard als een negatieve controle voor actieve chromatine merken. De opmerking dat H3K4me1, een goed aanvaarde versterker 4 , 5 , </sup&gt; 7 , 14 , 18 , is niet verrijkt bij Gene desert, suggereert dat dit gebied geen versterkers heeft. <img alt="Figuur 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig1.jpg" /> Figuur 1: Schematisch overzicht van het gepresenteerde ChIP-protocol. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig2.jpg" /> Figuur 2: Scherpe kwaliteitscontrole van de volwassen T-cellijn van de muis. ( A ) Twee verschillende porties volwassen T-cellijn E2-10HA werden gesneden en ongeveer 500 ng gezuiverd DNA werd geanalyseerd op een 1,8% agarosegel om hun schaar te evalueren.Kwaliteit. ( B ) 1 ng gezuiverd DNA uit monster 2 werd geanalyseerd door elektroforese om de schaarkwaliteit te evalueren. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig3.jpg" /> Figuur 3: Chromatine markeringen die enhancers en promotors karakteriseren. ( A ) Actieve versterkers (bovenpaneel) worden gekenmerkt door hoge H3K4me1, lage H3K4me3 en hoge H3K27ac, terwijl inactieve versterkers (onderste paneel) hoge H3K4me1, lage H3K4me3 en lage H3K27ac bevatten. ( B ) De monsters gepresenteerd in figuur 2A werden samengevoegd en gebruikt voor ChIP analyse versus histonenmerken H3K4me1, H3K4me3 en H3K27ac en histone bezetting, zoals blijkt uit panH3 ChIP. Uit deze analyse blijkt dat thE promotor van het huishoudingsgen Glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase ( Gapdh promotor ) is zeer verrijkt voor H3K4me3 en H3K27ac en laag verrijkt voor H3K4me1. Anderzijds is de versterker van het inactieve gen Deltex1 ( Dtx1 enhancer ) zeer verrijkt voor H3K4me1 maar slecht verrijkt voor H3K4me3 en H3K27ac. ChIP met behulp van een panH3 antilichaam werd gebruikt om nucleosome bezetting te onderzoeken. Gene woestijn werd gebruikt als negatieve controle. Er wordt een representatief experiment getoond. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Naam van de buffer </td><td> Reagens </td><td> Definitieve concentratie </td></tr><tr><td rowspan="5"> Verdunningsbuffer </td><td> Natrium dodecYl sulfate (SDS) </td><td> 0,01% (w / v) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 1,1% (v / v) </td></tr><tr><td> Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) pH 8,0 </td><td> 1,2 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8,1 </td><td> 16,7 mM </td></tr><tr><td> Natriumchloride (NaCl) </td><td> 167 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> DMA oplossing </td><td> Dimethyladipimidaat (DMA) </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) </td><td> 1x </td></tr><tr><td rowspan="3"> Elutiebuffer </td><td> Natriumdodecylsulfaat (SDS) </td><td> 1% (w / v) </td></tr><tr><td> Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) pH 8,0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8,0 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> Hoge zoutbuffer </td><td> Natriumdodecylsulfaat (SDS) </td><td> 0,1% (w / v) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> EthylenediamiNetto-azijnzuurzuur (EDTA) pH 8,0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8,1 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Natriumchloride (NaCl) </td><td> 500 mM </td></tr><tr><td rowspan="6"> IMDM medium </td><td> Iscove&#39;s gemodificeerde medium van Dulbecco (IMDM) </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Foetaal runder serum (FBS) </td><td> 2% (v / v) </td></tr><tr><td> Penicilline / streptomycine </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Peptone primatone </td><td> 0,3 mg / ml </td></tr><tr><td> Insuline oplossing menselijk </td><td> 4,8 mg / ml </td></tr><tr><td> Minimale essentiële niet-essentiële aminozuren (MEM NEAA) </td><td> 1x </td></tr><tr><td rowspan="4"> LiCl zoutbuffer </td><td> Lithiumchloride (LiCl) </td><td> 0,25 M </td></tr><tr><td> IGEPAL-CA630 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) pH 8,0 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8.1 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> Lage zoutbuffer </td><td> Natriumdodecylsulfaat (SDS) </td><td> 0,1% (w / v) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) pH 8,0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8,1 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Natriumchloride (NaCl) </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> Proteïne Een Sepharose kralenwasbuffer </td><td> Tris-HCl pH 8,0 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Natriumchloride (NaCl) </td><td> 500 mM </td></tr><tr><td> Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) pH 8,0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfaat (SDS) </td><td> 0,1% (w / v) </td></tr><tr><td> IGEPAL-CA630 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td rowspan="3"> SDS Lysis buffer </td><td> Natriumdodecylsulfaat (SDS) </td><td> 1% (w / v) </td></tr><tr><td> ethyleendiAminetetraazijnzuur (EDTA) pH 8,0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8,1 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> TE buffer </td><td> Tris-HCl pH 8,0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) pH 8,0 </td><td> 1 mM </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Lijst van buffers en het medium dat in dit protocol wordt gebruikt. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> OP </td><td> UIT </td></tr><tr><td> Piekvermogen </td><td> 150,0 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Duty factor </td><td> 15.0 </td><td> 15.0 </td></tr><tr><td> Cycli / burst </td><td> 500 </td><td> 500 </td></tr><tr><td> Aantal cycli </td><td colspan="2"> 28 </td></tr></tbody></table>Tabel 2: Scherpinstellingen die in dit protocol worden gebruikt. Deze voorwaarden zijn geoptimaliseerd voor een volwassen T-cellijn van de muis. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Antilichaam </td><td> Leverancier </td><td> Hoeveelheid antilichaam / immunoprecipitatie </td><td> Aantal cellen / immunoprecipitatie </td><td> Wasomstandigheden </td></tr><tr><td> H3 </td><td> Abcam (ab1791) </td><td> 2,5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Eenmaal in laagzoutbuffer, tweemaal in hoge zoutbuffer, tweemaal in LiCl-zoutbuffer en driemaal in TE-buffer </td></tr><tr><td> H3K4me1 </td><td> Abcam (ab8895) </td><td> 2,5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Eenmaal in laagzoutbuffer, tweemaal in hoge zoutbuffer, tweemaal in LiCl-zoutbuffer en driemaal in TE-buffer </td></tr><tr><td> H3K4me3 </td><td> Diagenode (pAb-003-050) </td><td> 2,5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Eenmaal in laagzoutbuffer, tweemaal in hoge zoutbuffer, tweemaal in LiCl-zoutbuffer en driemaal in TE-buffer </td></tr><tr><td> H3K27ac </td><td> Diagenode (pAb-174-050) </td><td> 2,5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Oc in laagzoutbuffer, tweemaal in hoge zoutbuffer, tweemaal in LiCl-zoutbuffer en drie keer in TE-buffer </td></tr><tr><td> IgG </td><td> Diagenode (C15410206) </td><td> variabel * </td><td> variabel * </td><td> variabel * </td></tr><tr><td colspan="5"> * In het geval van de IgG-controle moet de hoeveelheid van zowel antilichaam als cellen, evenals de wasstapjes, de condities van de andere immunoprecipitaties weerspiegelen. </td></tr></tbody></table> Tabel 3: Antilichamen en wasomstandigheden gebruikt in deze studie. <table border="1" fo:keEp-together.within-page = &quot;1&quot; voor: keep-with-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> Gen </td><td> Voorwaartse primer </td><td> Omgekeerde primer </td><td> sonde </td></tr><tr><td> Gapdh promotor (0 kb) </td><td> 5&#39;-GGG TTC CTA TAA ATA CGG ACT GC-3 &#39; </td><td> 5&#39;-CTG GCA CTG CAC AAG AAG A-3 &#39; </td><td> 68 </td></tr><tr><td> Dtx1 versterker (+26 kb) </td><td> 5&#39;-CTC TGG GTT GTA GGG GAC AG-3 &#39; </td><td> 5&#39;-GCA TGG GAA CTG TGT TAC AGA A-3 &#39; </td><td> 27 </td></tr><tr><td> Gene woestijn </td><td> 5&#39;-CAA TGC ATG GGT CCA GAT TT-3 &#39; </td><td> 5&#39;-ATT GGC ACG GAA GTA GTG CT-3 &#39; </td><td> 94 </td></tr></tbody></table> Tabel 4: Primers en probes gebruikt voor qPCR in deze studie. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> Probleem </td><td> Oorzaken </td><td> Oplossing </td></tr><tr><td rowspan="3"> Chromatine is ondergesneden en fragmenten zijn te groot. </td><td> Te veel cellen zijn gebruikt. </td><td> Verminder het aantal cellen. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Het scheren is te laag. </td><td> Verhoog het aantal schuifcycli. </td></tr><tr><td> Verhoog de scherppiekvermogen, de arbeidsfactor en / of de cycli / uitbarsting. </td></tr><tr><td rowspan="3"> Chromatine is overgesneden en fragmenten zijn te klein. </td><td> Er zijn te weinig cellen gebruikt. </td><td> Verhoog het aantal cellen. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Het scheren is te hoog. </td><td> Verminder het aantal schuifcycli. </td></tr><tr><td> Verminder de afsnijdpiekvermogen, de arbeidsfactor en / of de cycli / uitbarsting. </td></tr><tr><td rowspan="11"> Te laag herstel over IGG controle en / of negatieve controle (hoge achtergrond). </td><td> Niet genoeg chromatine is gebruikt voor het experiment. </td><td> Verhoog de hoeveelheid chromatine. </td></tr><tr><td> Hoeveelheid antilichaam is te laag. </td><td> Verhoog de hoeveelheid antilichaam. </td></tr><tr><td> Hoeveelheid antilichaam is te hoog. </td><td> Verminder de hoeveelheid antilichaam. </td></tr><tr><td> Het antilichaam heeft een lage specificiteit. </td><td> Verander het antilichaam. </td></tr><tr><td rowspan="2"> De wasomstandigheden zijn te streng. </td><td> Verminder het aantal was. </td></tr><tr><td> Verminder de strengheid van de wasbuffers. </td></tr><tr><td rowspan="2"> De wasomstandigheden zijn niet streng genoeg. </td><td> Verhoog het aantal was. </td></tr><tr><td> Verhoog de strengheid van de wasbuffers. </td></tr><tr><td> Te veel DNA werd gepipetteerd in de qPCR. </td><td> Verminder de hoeveelheid DNA die in de qPCR gepipetteerd wordt. </td></tr><tr><td rowspan="2"> QPCR condities zijn niet optimaal. </td><td> Optimaliseer de qPCR condities. </td></tr><tr><td> Verminder het aantal cycli. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Geen product of product is te laag in de qPCR-reactie van het invoermonster. </td><td> Niet genoeg DNA werd gepipetteerd in de qPCR. </td><td> Verhoog de hoeveelheid DNA die in de qPCR wordt gepipetteerd. </td></tr><tr><td rowspan="2"> QPCR condities zijn niet optimaal. </td><td> Optimaliseer de qPCR condities. </td></tr><tr><td> Verhoog het aantal cycli. </td></tr><tr><td> Niet genoeg chromatine is gebruikt voor het experiment. </td><td> Verhoog de hoeveelheid chromatine. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Geen signaal in de positieve controle en / of panH3 ChIP. </td><td> Niet genoeg chromatine is gebruikt voor het experiment. </td><td> Verhoog de hoeveelheid chromatine. </td></tr><tr><td> Hoeveelheid antilichaam is te laag. </td><td> Verhoog de hoeveelheid antilichaam. </td></tr><tr><td> De antiLichaam heeft een lage specificiteit. </td><td> Verander het antilichaam. </td></tr><tr><td> Elutie is suboptimale. </td><td> Zorg ervoor dat u de monsters vaak wervelt om de kralen in oplossing te houden. </td></tr></tbody></table> Tabel 5: Problemen oplossen.

Dit werk beschrijft een protocol voor chromatine immunoprecipitatie (ChIP) met behulp van een volwassen T-cellijn van de muis. Dit protocol is geschikt om de verdeling van specifieke histonenmerken op specifieke promotor sites of genoombreed te onderzoeken.

Chromatine Immunoprecipitatie (ChIP) in Muis T-cellijnen

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Het algemene doel van dit protocol is om efficiënt chromatine-immunoprecipitatie uit te voeren in muis T-cel-lijnen met een hoge reproduceerbaarheid binnen een redelijke tijd, om de distributie van histonmerken in specifieke genomische regio's te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de chromatinebiologie, met een specifieke focus op T-cellen, zoals de vraag hoe de chromatinestructuur wordt gereguleerd tijdens de deling of activatie van T-cellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het afscheren van het chromatine efficiënt en zeer reproduceerbaar is.Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de omstandigheden voor het sheareren van chromatine moeilijk vast te stellen zijn en de stappen met fenol-chloroform-isoamylalcohol uitdagend kunnen zijn. De procedure zal worden gedemonstreerd door Francesca Ferrante, een PhD-student in ons laboratorium. Overdracht de muis T-cellen op dag één van een six-wellplaat naar een buis van 50 milliliter.Centrifugeer de cellen vervolgens vijf minuten bij 24 °C bij ongeveer 271 ×g. Nadat het celpellet is geresuspendeerd in 30 mL IMDM-celcultuurmedium, worden de cellen geteld met een Neubauer-telkamer. Verzamel aliquots van 20 miljoen cellen in nieuwe buisjes van 50 mL. Voeg vervolgens formaldehyde direct toe aan het celcultuurmedium tot een eindconcentratie van 1% en incubeer dit tien minuten bij kamertemperatuur.Voeg vervolgens een 1/8 volume van één molair glycine pH 7.5 toe en incubeer vijf minuten bij kamertemperatuur. Pelleteer de cellen door centrifugatie gedurende vijf minuten bij 24 °C en ongeveer 271 ×g. Was daarna de cellen door het celpellet opnieuw te suspenderen in 10 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing en de centrifugatie te herhalen. Was de cellen nogmaals met 1 mL PBS.De geresuspendeerde cellen overbrengen naar 1,5 milliliter buisjes vóór het centrifugeren. Het afscheren van het chromatine is de meest kritische stap, aangezien dit afhangt van het aantal cellen, de gebruikte buisjes, het apparaat en de lysisbuffer, evenals de parameters voor het afscheren. Resuspendeer na het wassen de celpellet in één milliliter SGS lysisbuffer en incubeer op ijs.Breng elk monster na 10 minuten over naar een sonicatiebuis. Voer vervolgens shearing uit met een gefocuste ultrasonicator volgens de instellingen die in het tekstprotocol worden aangegeven. Breng de monsters na de shearing over naar buisjes van 1,5 milliliter.Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4 °C en ongeveer 18.000 ×g. Draag vervolgens het supernatant over naar nieuwe buisjes. Neem 50 µL af voor de bepaling van de shearing-efficiëntie en vries het geshearde lysaat direct in in vloeibare stikstof. Bewaar het lysaat in aliquots voor eenmalig gebruik bij -80 °C.Om de shearing-efficiëntie te bepalen, voegt u eerst 50 µL elutiebuffer toe aan de 50 µL van elk gesheard lysaat. Incubeer de mengsels gedurende de nacht bij 65 °C onder schudding. Voeg op dag twee 100 µL TE-buffer en vier µL van 10 mg/mL Rnase A toe aan de monsters.Meng de monsters en incubeer deze gedurende twee uur bij 37 °C onder schudding. Voeg vervolgens twee µL proteinase K (20 mg/mL) toe aan elk monster, alvorens deze twee uur te incuberen bij 55 °C onder schudding. Draag vervolgens elk monster over naar een gelbuis die geschikt is voor fenol-chloroform-isoamylalcohol-extractie.Hanteer de buisjes volgens de instructies van de fabrikant. Voeg 200 µL fenol-chloroform-isoamylalcohol toe en schud de buisjes. Breng na centrifugatie de bovenfase over naar nieuwe buisjes.Herhaal dit proces eenmaal. Zuiver het DNA met zuiveringskolommen volgens de instructies van de fabrikant, behalve dat het membraan twee keer gewassen moet worden. Laat de buis na de laatste wasbeurt twee minuten openstaan bij kamertemperatuur om het resterende ethanol te laten verdampen.Voeg voor de elutie 50 µL water toe aan de kolom en incubeer dit gedurende één minuut bij kamertemperatuur. Centrifugeer de buis vervolgens één seconde om het membraan goed te bevochtigen. Incubeer het membraan één minuut bij kamertemperatuur voordat het DNA door centrifugatie wordt geëlueerd.Kwantificeer het gezuiverde DNA op een fluorometer met een high-sensitivity kit volgens de instructies van de fabrikant. Analyseer tot slot ongeveer 500 nanogram van het gezuiverde DNA op een 1,8% agarosegel en ongeveer één nanogram van het gezuiverde DNA op een elektroforesesysteem met een high-sensitivity kit.Verdun op dag drie één volume gesheard lysaat met vijf volumes verdunningsbuffer. Voer een pre-clearing van het verdunde lysaat uit met 30 µL per mL proteïne A agarose-beads gedurende 30 minuten onder rotatie in de koelruimte. Centrifugeer de monsters bij 4 °C gedurende vijf minuten bij ongeveer 750 ×g. Verzamel 10% van het geklaarde lysaat als inputmonsters en bewaar deze bij 4 °C. Verdeel vervolgens de gewenste hoeveelheid van het geklaarde lysaat in nieuwe buisjes. Voeg daarna de gekozen antilichamen toe aan elk buisje en laat deze een nacht lang roteren bij 4 °C. Voeg op dag vier 40 µL proteïne A-beads toe.Incubeer het mengsel gedurende één uur bij 4 °C onder rotatie. Was de beads met 1 mL low salt buffer door deze vijf minuten te incuberen bij 4 °C onder rotatie. Centrifugeer vervolgens gedurende drie minuten bij 4 °C en ongeveer 950 ×g. Herhaal de wasstap met high salt buffer, lithiumchloridebuffer en TE-buffer.Voeg vervolgens 110 µL elutiebuffer toe aan de monsters. Incubeer deze gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, waarbij de monsters elke twee minuten worden gevortext. Na opnieuw centrifugeren wordt 100 µL supernatant overgebracht naar een nieuwe buis van 1,5 mL.Herhaal de elutie met 100 µL elutiebuffer en voeg de eluaten samen. Voeg ondertussen elutiebuffer toe aan de eerder verzamelde inputmonsters om een eindvolume van 200 µL te bereiken. Incubeer alle monsters een nacht bij 65 °C onder schudding.Voeg op dag vijf 200 µL TE-buffer toe aan elk eluaat en 8 µL 10 mg/mL Rnase A. Meng de monsters voordat ze twee uur lang bij 37 °C worden geïncubeerd onder schudcondities. Voeg vervolgens 4 µL 20 mg/mL proteinase K toe aan elk eluaat voordat ze twee uur lang bij 55 °C worden geïncubeerd onder schudcondities. Draag daarna elk monster over naar een gelbuis die geschikt is voor fenol-chloroform-isoamylalcohol-extractie.Voeg 400 µL fenol-chloroform-isoamylalcohol toe en schud de buisjes. Na centrifugatie van de buisjes wordt de bovenste fase overgebracht naar nieuwe buisjes en wordt dit proces nogmaals herhaald. Zuiver tot slot het DNA met zuiveringskolommen zoals eerder beschreven.Dit representatieve resultaat van het shearren van muis T-cellijnen laat een efficiënte fragmentatie van het chromatine zien. Hier wordt een representatief chromatine-immunoprecipitatie-experiment in muis T-cellijnen getoond. De promoter van het housekeeping-gen glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase is sterk verrijkt voor trimethylering van lysine vier op histon drie.En acetylering van lysine 27 op histon drie. Maar niet voor monomethylering van lysine vier op histon drie. Omgekeerd is de enhancer van het inactieve gen deltex-1 sterk verrijkt voor monomethylering van lysine vier op histon drie.Maar onvoldoende verrijkt voor trimethylering van lysine vier op histon drie en acetylering van lysine 27 op histon drie. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat SGS-precipitaten moeten worden opgelost voordat de monsters worden gesheard.We kregen voor het eerst het idee voor deze methode tijdens het bestuderen van genregulatie in T-cellen. We kozen T-cellen omdat ze zeer relevant zijn voor medische toepassingen en een van de best beschreven modelsystemen vertegenwoordigen om genexpressie in hogere eukaryoten te bestuderen. Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de chromatinebiologie om chromatine-regulatie in zoogdiersystemen te onderzoeken.De implicaties van deze techniek reiken tot de therapie van T-cel-gerelateerde ziekten, omdat het mogelijk maakt om de totstandkoming en regulatie van de genexpressieprogramma's van T-cellen te ontleden. Houd er rekening mee dat het werken met formaldehyde, fenolchloroform en isoamylalcohol zeer riskant is; voorzorgsmaatregelen, zoals het werken in een zuurkast en het dragen van de juiste beschermende uitrusting, moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de chromatineregulatie van muizen T-cellen, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals endotheel- en longcellijnen.

chromatin-immunoprecipitation-chip-in-mouse-t-cell-lines

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

De differentiatie van ESC samenvalt met cel-type specifieke veranderingen in de structuur en samenstelling van het chromatine. De detectie van deze veranderingen geeft waardevolle inzichten in de mechanismen die stemcellness en celdifferentiatie te definiëren. Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) vormt een waardevolle methode om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen stamcellen differentiatie ontleden.

Chromatine immunoprecipitatie van menselijke embryonale stamcellen

Het IP-FCM methode is gepresenteerd, die een gevoelige, robuust, biochemische evaluatie van de natieve eiwit-eiwit interacties mogelijk maakt, zonder dat genetische manipulatie of grote steekproeven.

IP-FCM: Immunoprecipitatie gedetecteerd door middel van flowcytometrie

Demonstreren we een chromatine immunoprecipitatie (ChIP) methode om factor interacties op weefsel-specifieke genen te identificeren tijdens of na het begin van weefsel-specifieke genexpressie in muis embryonale weefsel. Dit protocol moet worden breed toepasbaar voor de studie van weefsel-specifieke gen activatie als het zich voordoet tijdens de normale embryonale ontwikkeling.

Chromatine immunoprecipitatie assay for Tissue-specifieke genen met behulp van een vroeg stadium muizenembryo&#39;s

We beschrijven een robuuste methode voor het chromatine immunoprecipitatie met primaire T-cellen. De methode is gebaseerd op standaard methoden, maar gebruikt een specifieke set van omstandigheden en reagentia die de efficiëntie van een beperkte hoeveelheid cellen verbeteren. Belangrijk is een gedetailleerde beschrijving van de data analysefase gepresenteerd.

Efficiënte Chromatine immunoprecipitatie behulp Beperking hoeveelheden biomassa

De combinatie van chromatine immunoprecipitatie en ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) kan identificeren en in kaart eiwit-DNA-interacties in een bepaald weefsel of cellijn. Geschetst is hoe je een hoge kwaliteit ChIP sjabloon voor de daaropvolgende sequencing, met ervaring met de transcriptiefactor TCF7L2 als een voorbeeld te genereren.

Generatie van hoge kwaliteit Chromatine immunoprecipitatie DNA Template voor High-throughput sequencing (ChIP-seq)

Een nieuw protocol voor de voorbereiding van de chromatine van volwassen muis skeletspieren aangepast aan de studie van genregulatie in spiervezels door chromatine immunoprecipitation wordt gepresenteerd.

Verbeterde Protocol voor chromatine Immunoprecipitation van muis skeletspieren

We beschrijven een stapsgewijze protocol voor tandem chromatine immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) waarmee de analyse van cel-type-specifieke genoom-brede Histon wijziging.

TChIP-Seq: Cell-Type-specifieke Epigenome profilering

Hier beschrijven we een protocol voor efficiënte chromatine immunoprecipitation (ChIP), gevolgd door high-throughput DNA sequentiebepaling (ChIP-seq) van bruin vetweefsel (BAT) geïsoleerd van een muis. Dit protocol is geschikt voor zowel mapping histone modificaties en genoom-brede lokalisatie van niet-Histon proteïnen van belang in vivoonderzoeken.

Chromatine Immunoprecipitation van lymfkliertest bruin vetweefsel

Chromatin immunoprecipitatie (chip) is een krachtig hulpmiddel voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen van genregulatie. De methode omvat echter moeilijkheden bij het verkrijgen van reproduceerbare chromatine fragmentatie door mechanische afschuiving. Hier bieden we een verbeterd protocol voor een ChIP assay met enzymatische spijsvertering.

Chromatische immunoprecipitatie test met behulp van Micrococcal nucleasen in zoogdiercellen

Dit protocol richt zich op chromatinepreparatie uit snap bevroren weefsels en is geschikt voor Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) gevolgd door kwantitatieve PCR-analyse (X-ChIP-qPCR) of next generation sequencing-benaderingen (X-ChIP-seq).

Chromatine-extractie uit bevroren chimere leverweefsel voor chromatine-immunoprecipitatieanalyse

Leer chromatine immunoprecipitatie in muizen T-cellijnen voor chromatinebiologie. Deze methode onderzoekt histonmarkeringen en genregulatie tijdens T-celactivatie met hoge reproduceerbaarheid.

Chromatine Immunoprecipitatie (ChIP) in Muis T-cellijnen

Meer video's verkennen