Kwantitatieve immunofluorescentie te meten Global gelokaliseerd vertaling

Het algemene doel van dit experiment is om gecompartimenteerde translatie-gebeurtenissen te visualiseren en te kwantificeren die plaatsvinden tijdens de eerste stappen van celadhesie. Deze methode heeft een brede toepassing. Gebruik het wanneer een snelle specifieke translatiereactie kan worden gemeten, zoals bij het analyseren van celmigratie, adhesie of vroege respons op geneesmiddelen.

Het grootste voordeel van deze techniek is dat het eenvoudig, snel en kosteneffectief is. Het vereist alleen puromycine, antilichamen gericht tegen puromycine en het standaard confocale scanbeeldsysteem. Maak om te beginnen een suspensie van MRC-5-cellen.

Gebruik Trypsinisatie, gevolgd door centrifugatie, verwijdering van het supernatant, en vervolgens resuspendering in DMEM met tien procent FBS, bij 40 duizend cellen per milliliter. Incubeer de suspensie gedurende 20 minuten met zachte rotatie om de focale adhesiecomplexen volledig te dissociëren. Dit is cruciaal.

Vervolgens, in twee 35 millimeter glazen bodem schotels, voeg twee milliliter aliquoten suspensie toe en incubeer ze om cellulaire adhesie en SiC-vorming mogelijk te maken. Behandel na 40 minuten één plaat met cycloheximide en plaats deze terug in de incubator. Deze plaat zal fungeren als de negatieve controle.

Na 55 minuten, breng puromycine toe op beide platen bij de vooraf bepaalde concentratie, en incubeer de platen gedurende vijf extra minuten. Na één uur zaaien en vijf minuten puromycine in samenwerking, was elke plaat twee keer met twee milliliter ijskoud PBS. Fixeer vervolgens de cellen met één milliliter vier procent formaldehyde in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.

Na de fixatie, was de cellen drie keer met PBS, en permeabeliseer vervolgens de cellen met 500 microliters van 0,5 procent triton X-100 in PBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Was vervolgens de platen drie keer met PBS, en breng vervolgens 500 microliters van een procent BSA in PBS aan. Vervolg de incubatie bij kamertemperatuur gedurende nog 20 minuten.

Om overtollig BSA te verwijderen, was de cellen drie keer met 0,1 procent Tween-20 in PBS. Incubeer nu de cellen met 300 microliters anti-puromycine antilichaam. Verwijder het ongebonden antilichaam met drie wasbeurten met 0,1 procent Tween-20.

Breng vervolgens driehonderd microliters van een mengsel van twee fluorofoorgekoppelde secundaire antilichamen aan om gepuromycolateerde polypeptiden en de factem te visualiseren. Incubeer de cellen gedurende een uur bij kamertemperatuur in het donker. Na een uur, was de platen drie keer om de ongebonden antilichamen te verwijderen en breng vervolgens driehonderd microliters van een 0,1 procent Tween-20 oplossing aan, aangevuld met DAPI.

Laat de DAPI vijf minuten in de cellen staan bij kamertemperatuur. Was vervolgens de cellen nog vier keer, eindigend met een wasbeurt in zuiver PBS. Bewaar vervolgens de cellen in twee milliliter PBS voor beeldvorming.

Gebruik een commercieel beschikbaar confocale beeldvormingssysteem om eerst de juiste instellingen te bepalen die de dynamische reikwijdte voor kwantificering maximaliseren. Focus op kwantificering kan alleen worden verkregen als piekgrootteverzadiging wordt vermeden en de concentratie correct wordt aangepast. De instelling kan worden bereikt door zorgvuldig aanpassen van het laservermogen voordeel en offsets.

Pas eerst de zoomfactor en het aantal pixels aan om de pixelgrootte te optimaliseren. Doe dit volgens de stelling van Nyquist. Verlaag vervolgens de scan snelheid en gebruik gemiddelden om de signaal-ruisverhouding te verbeteren.

Bepaal vervolgens handmatig de juiste bovenste en onderste focale vlakken langs de Z-as, en stel de StepSize in door de axiale resolutie te berekenen en deze afstand te delen door 2,3. Het typische resultaat is 20 tot 25 beeldlagen. Zodra de instellingen zijn aangepast, verwerf een confocale afbeelding van een enkele cel met behulp van een 60x Plan Apo olie-immersie objectief met een numerieke opening van 1,42.

Om de flurofoorsignalen te kwantificeren en te analyseren, open eerst een afbeelding die overeenkomt met de z-vlaklaag van belang in image J. Gebruik vervolgens het tekengereedschap om een lijn door de cel te maken waar kwantificering gewenst is. Wijzig vervolgens de lijnwhiff door erop te dubbelklikken op recht. De intensiteitswaarden worden gemiddeld over de breedte van de lijn, dus gebruik een dunnere lijn om signaaloverlap van verschillende structuren te voorkomen.

Profileer vervolgens de signaaldichtheid langs de lijn. Herhaal nu het proces van het verzamelen van de signaaldichtheid langs dezelfde lijn in het kanaal dat overeenkomt met een flurofoor. De waarden worden altijd geordend volgens de oriëntatie van de lijn.

Kopieer vervolgens de profielgegevens en plak deze in een spreadsheet voor analyse. Herhaal dit proces van het verzamelen van gegevens van elke Z-vlakbeeldlaag van belang voordat u doorgaat met de statistische analyse. Als alternatief, in plaats van het signaal langs een as te verzamelen, kan het signaal van een gebied van de afbeelding worden verzameld.

Gebruik eerst de geometrische formulierfunctie om een gebied van belang te selecteren. Pas vervolgens de drempelwaarde aan om achtergrond te vermijden. In de histogram van pixelintensiteiten, verplaats de schuifregelaar om aan te passen welke pixels in de kwantificering zullen worden opgenomen.

Stel de drempel in om alle rode pixels buiten de cel te elimineren. Definieer nu de meetparameters die nodig zijn om het signaal van belang te meten en niet het achtergrondsignaal. Schakel de limiet om naar drempel en geïntegreerde dichtheidsopties.

Gebruik vervolgens de meetopdracht. Dit zal een nieuw venster openen met de gemiddelde grijze waarden en pixeltelling in het geselecteerde gebied. Herhaal nu het proces en pas dezelfde drempel toe om de signaalintensiteit in de hele cel te bepalen.

Gebruik vervolgens deze gegevens om de verhouding van het signaal in het geselecteerde gebied ten opzichte van dat van de hele cel te berekenen. Voor nau