Name: Kwantitatieve immunofluorescentie te meten Global gelokaliseerd vertaling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Leer kwantitatieve immunofluorescentie om gelokaliseerde translatie te meten tijdens celadhesie met MRC-5-cellen. Deze snelle, kosteneffectieve methode gebruikt puromycine en standaard confocale microscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Dr Rachid Mazroui (Université Laval, Québec, Canada) voor de kritische lezing van het manuscript. Wij danken de cel Imaging eenheid van het Research Center voor hun technische bijstand. M.-É. Huot is een Junior 1 onderzoeker van het Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). Dit werk werd gesteund door de Canadese instituten van gezondheidsonderzoek (verlenen nummer CIHR, MOP-286437 naar M.-É. Huot).

1. bepaling van de voorwaarden van de Puromycilation Opmerking: deze techniek wordt de methode gebruikt voor het beoordelen van gelokaliseerde vertaling tijdens het MRC-5 cel adhesie proces 5 beschreven. Als puromycilation kan worden gedaan in een willekeurige cel, is het belangrijk om het optimaliseren van de puromycilation voorwaarden voor de specifieke cellijnen worden gebruikt, omdat de behandeling voorwaarden niet identiek zijn voor elke regel van de cel in termen van de concentratie van de puromycin en de gewenste zijn incubatietijd. Om te laten zien hoe deze voorwaarden worden gedefinieerd, drie cellijnen van de voorbeeld (d.w.z., HeLa, MRC-5 en Huh-7) werden behandeld met toenemende concentraties van puromycin voor verschillende incubatie tijden ( Figuur 1).
De identieke getallen <ol><li>groeien van cellen in een 24-well plaat in 0,5 mL van de passende voltooien kweekmedium 16 h vóór de proef. Zaad 30.000 MRC-5 cellen, 50.000 HeLa cellen of 50.000 HuH-7 cellen per putje. Zorg ervoor om te voorkomen dat meer dan 60-70% samenvloeiing (figuur 1A).</li>
	<li>Voorbereiden 6 buizen met volledige cel 1,5 mL gestolde voedingsbodem met toenemende concentraties van puromycin (0, 5, 10, 15, 20 en 30 µg/mL). Vooraf warm bij 37 ° C.</li>
	<li>Voor elke concentratie van puromycin medium (bereid in stap 1.2), overdracht van 0,5 mL van buisvideo in 6 nieuwe buizen elk en cycloheximide op een eindconcentratie van 50 µg/mL toevoegen aan alle 6 nieuwe buizen. Vooraf warm bij 37 ° C.</li>
	<li>Wijzigen het medium met 0,5 mL van volledige voedingsbodem (rij 1 en 2). Voor de derde rij, Voeg 0,5 mL van volledige kweekmedium aangevuld met 50 µg/mL cycloheximide ( figuur 1B). 
	Opmerking: Cycloheximide behandeling is opgezet als de beste negatieve controle voor eiwit puromycilation vanwege zijn vermogen om te blokkeren vertaling rek. Omdat puromycin integratie vertaling rek vereist, cycloheximide behandeling leidt tot een verlies van puromycilated eiwit signalen 5 , 18.</li>
	<li>Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C (5% CO 2).</li>
	<li>Voeg 0,5 mL van het puromycin medium bereid in stap 1.2 aan de tweede rij te verkrijgen van de eindconcentraties van 0, 2.5, 5, 7.5, 10, en 15 µg/mL, respectievelijk in de kolommen A, B, C, D, E en F. Op hetzelfde moment, 0,5 mL puromycin toevoegen aan het medium cycloheximide-aangevuld (stap 1.3) in de derde rij ( Figuur 1 c).</li>
	<li>Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C (5% CO 2).</li>
	<li>Voeg 0,5 mL van het puromycin medium bereid in stap 1.2 aan de eerste rij te verkrijgen van de eindconcentraties van 0.0, 2.5, 5, 7.5, 10, en 15 µg Mo/mL ( Figuur 1 c).</li>
	<li>Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C (5% CO 2).</li>
	<li>Wassen elk goed uit rijen 1 tot en met 3 met 1 mL ijskoud 1 X-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) 5 min na toevoeging van puromycin aan putjes van de eerste rij (tweemaal wassen). Voeg 75 µL van 1 X Laemmli buffer (4% natrium dodecyl sulfaat (SDS), 4% 2-mercaptoethanol, 0.120 M Tris-HCl pH 6.8, 0.004% bromophenol blauw, en 10% glycerol) te verkrijgen van geheel-cel lysates voor elke voorwaarde.</li>
	<li>Run 10% SDS-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) met behulp van 1/3 van de bereide monsters te beoordelen van de opneming van de puromycin.
	<ol><li>Bepalen het niveau van puromycin opneming van informatie door westelijke vlekkenanalyse met behulp van een anti-puromycin antistof (12 D 10) verdund in een verhouding van 1: 25.000 in primair antilichaam-incubatie buffer (2% bovien serumalbumine (BSA)), 430 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7.4 en 0,01% natriumazide). 
		Opmerking: Representatieve beelden overeenkomt met andere cel lijn extracten gemaakt zoals beschreven in stap 1 worden getoond als voorbeelden in Figuur 2.</li>
	</ol></li></ol> 2. In alexandrafranco Gelokaliseerde vertaling Visualization Opmerking: de hier beschreven techniek werd gebruikt om te beoordelen van gelokaliseerde vertaling binnen SICs in cellen van de MRC-5 tijdens de hechting proces 5. Hoewel MRC-5 cellen hier gebruikt worden, andere cellijnen kunnen worden gebruikt met dezelfde methode zoals beschreven in stap 2.1.
<ol><li>Cel voorbereiding.
	<ol><li>Losmaken MRC-5 cellen met behulp van 0,25% trypsine/2.21 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) in Hank &#39; s evenwichtig zout oplossing (HBSS). De cellen door centrifugeren (5 min 200 x g) in een conische centrifugebuis van 15 mL pellet en hen op te schorten in Dulbecco &#39; s gewijzigd Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) bij 40.000 cellen/mL na tellen met een tellen kamer.</li>
		<li>Broeden de zwevende cellen bij 37 ° C onder zachte rotatie met behulp van een rotator van de buis gedurende 20 minuten om ze te bewaren in suspensie. 
		Opmerking: Deze stap is van cruciaal belang met het oog op de volledige dissociatie van de focale hechting complexen.</li>
		<li>Plaat 2 mL van zwevende MRC-5 cellen (40.000 cellen/mL) in twee 35-mm glazen-bodem gerechten. Gebruik de eerste 35-mm glas-onder-schotel voor de puromycilation assay (zie stap 2.1.5) en gebruik maken van de tweede als een negatieve controle (zie stap 2.1.6).</li>
		<li>Houden van de cellen bij 37 ° C (5% CO 2) voor 55 min voor cellulaire hechting en SIC vorming.</li>
		<li>Toevoegen aan het medium in de 35-mm glazen-bodem gerechten (assay) met behulp van de concentratie eerder als omschreven in punt 1 puromycin. Gebruiken om te behandelen MRC-5 cellen, 10 µg/mL puromycin gedurende 5 minuten bij 37 ° C (5% CO 2).</li>
		<li>Als een negatieve controle, cycloheximide aan de tweede 35-mm glazen-bodem schotel 40 min toevoegen na het zaaien van de cellen om te vooraf te behandelen met 50 µg Mo/mL cycloheximide ( figuur 2B). Vervolgens 15 min na toevoeging van cycloheximide, puromycin toevoegen aan het medium gebruik dezelfde concentratie en incubatie tijd zoals in stap 2.1.5 (bijvoorbeeld gebruik 10 µg/mL puromycin gedurende 5 minuten bij 37 ° C (5% CO 2) voor MRC-5).</li>
		<li>Wassen elke plaat twee keer met 2 mL ijskoud 1 X PBS en herstellen van de cellen met 1 mL van 4% formaldehyde (verdund in 1 X PBS) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT). 
		Let op: Paraformaldehyde moet uitsluitend worden gebruikt in een chemische kap.</li>
	</ol></li> <li>Immunokleuring.
	<ol><li>Na paraformaldehyde fixatie, was drie keer met 2 mL 1 X PBS en incubeer in 500 µL van PBS-TritonX-100 (0,5%) gedurende 20 min op RT om de cellen permeabilize.</li>
		<li>Blokkeren om te voorkomen dat niet-specifieke antilichaam-bindende, het monster met 500 µL PBS &#8211; BSA (1%) gedurende 20 minuten op RT.</li>
		<li>Spoel driemaal met 2 mL PBS-Tween20 (0,1%) en incubeer met 300 µL van anti-puromycin antistof (12 D 10) verdund 1:12,500 in 1 X PBS voor 1 h op RT.</li>
		<li>Was 3 keer met 2 mL PBS-Tween20 (0,1%) en incubeer met 300 µL van anti-muis IgG geconjugeerd met een fluorophore (hier, 488 nm) verdund in PBS te visualiseren puromycilated polypeptiden en met phalloidin-geconjugeerd aan een andere fluorophore (hier, 555 nm) om te visualiseren F-actine. Incubeer gedurende 1 h op RT.</li>
		<li>Spoel driemaal met 2 mL PBS-Tween20 (0,1%) en vervolgens Incubeer gedurende 5 min. op RT in 300 µL van PBS-Tween20 (0,1%) aangevuld met 1 µg/mL 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).</li>
		<li>Spoel driemaal met 2 mL PBS-Tween20 (0,1%) en daarna wassen met 2 mL 1 X PBS. Voorkomen dat de cellen drogen door het bijhouden van het monster in 2 mL zuiver 1 X PBS tijdens Beeldacquisitie.</li>
	</ol></li></ol> 3. Immunefluorescentie Beeldacquisitie Opmerking: de volgende methode kan worden gebruikt met alle verkrijgbare confocal imaging systeem.
<ol><li>Bepalen de juiste instellingen voor elke fluorophore te maximaliseren van het dynamisch bereik voor kwantificering. 
	Opmerking: Vertegenwoordiger kwantificering kan alleen worden verkregen als pixel verzadiging wordt vermeden en de drempel van het signaal is goed aangepast. Deze instellingen kunnen worden bereikt door zorgvuldig aan te passen de kracht van de laser, hoogspanning (HV), krijgen, Naam module en verschuiving.
	<ol><li>Aanpassen de zoom factor (5 X) en het aantal pixels (512 x 512) voor het optimaliseren van de pixelgrootte. 
		Opmerking: Dit moet ten minste 2,3 - maal kleiner is dan de optische resolutie, volgens de stelling van Nyquist.</li>
		<li>Verlaag de snelheid van de scan (12,5-20 µs/pixel) en gebruiken gemiddeld (2 - 3 keer) ter verbetering van de signaal-/ ruisverhouding volgens de hierboven vermelde instellingen.</li>
	</ol></li> <li>Handmatig bepalen van de juiste bovenkant en onderkant focal vliegtuigen langs de z-as met de optimale stap-grootte (0.4 µm/slice). 
	Opmerking: Het vliegtuig stap grootte wordt bepaald door de resolutie van de axiale gedeeld door 2.3, volgens de stelling van Nyquist. 20-25 lagen zijn meestal nodig zijn voor de gehele cel scherptediepte Adherente cellen.</li>
	<li>Verwerven een confocal beeld van een hele eencellige met een 60 X Plan Apo olie onderdompeling doelstelling (1.42 numerieke diafragma).</li>
</ol> 4. Immunefluorescentie afbeelding kwantificering <ol><li>bepaling van verrijking.
	<ol><li>Open een afbeelding die overeenkomt met de z-plane laag van belang uit het gegevensbestand van de verworven cel met behulp van de ImageJ software (freeware beschikbaar op http://fiji.sc).</li>
		<li>Tekent een lijn met behulp van het gereedschap lijn tekening (Tool bar &#8594; rechte) door de regio's van de cel waar kwantificering is gewenst. De lijndikte wijzigen door te dubbelklikken op &#34; rechte; &#34; de intensiteitswaarden zal worden gemiddeld door de breedte van de lijn (vastgesteld op 8 in Figuur 3). 
		Opmerking: Een dunnere lijn heeft de voorkeur om te voorkomen dat signaal overlapping van verschillende structuren.</li>
		<li>Nadat de lijn is goed ingesteld, de signaal-dichtheid langs de vastberaden as profile (menubalk &#8594; analyseren &#8594; Plot profiel). 
		Opmerking: Een nieuw venster wordt geopend waarin een profiel dat overeenkomt met de signaalsterkte voor elke pixel van het geselecteerde kanaal (specifieke fluorophore) langs de lijn voor de geselecteerde sectie van het z-vlak.
		<ol><li>Herhaal het proces voor elk kanaal overeenkomt met de fluorophore gebruikt (dat wil zeggen, een kwantificering voor 488, één voor 568, en één voor 405). 
			Opmerking: De intensiteitswaarde signaal zal altijd worden besteld na de oriëntatie van de getekende lijn.</li>
		</ol></li> <li>Voor het verkrijgen van de numerieke grijs-scaled waarden voor elke pixel van het profiel dat overeenkomt met de kwantificeringen van de geselecteerde laag van het z-vlak, het kopiëren van de profielgegevens (menubalk in afbeeldingsvenster &#8594; kopie) en plak deze in een spreadsheetprogramma.</li>
		<li>Herhaal stap voor elke sectie van de z-plane van het verworven confocal beeld en elk kanaal waar kwantificering is gewenst 4.1.1-4.1.4. 
		Opmerking: De kwantificering van de verschillende lagen van het z-vlak kan worden gebundeld om te verkrijgen van een algemene beoordeling van de speciale verrijking van het signaal door de berekening van de waarde van de som van elke pixel langs de lijn voor elke laag van het z-vlak. Dit type te bundelen kan alleen worden bereikt als de getekende lijn identiek voor elke laag van de z-plane opgenomen in de gemiddelde waarden is.</li>
		<li>Als een alternatieve methode voor de kwantificering van de gehele-cel van verschillende kanalen met een groot aantal lagen, gebruik maken van de macro met de naam StackprofileData (Zie het Aanvullende bestand). 
		Opmerking: Deze macro is https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt vrij toegankelijk en kan als volgt worden gebruikt: <ol><li>Kopieer van de macro in een tekstbestand en sla it.</li>
			<li>Het afbeeldingsbestand waarin alle van de confocal lagen van de cel open.</li>
			<li>Trekken een lijn, zoals beschreven in stap 4.1.2, openen een nieuw schermpje importeren van de macro (menubalk &#8594; Plugins &#8594; macro's &#8594; uitvoeren), kies de eerder opgeslagen tekstbestand overeenkomt met de StackprofileData macro en klik op &#34; Open. &#34; 
			Opmerking: Na macro invoer, een nieuw venster met de naam &#34; resultaten &#34; wordt geopend en alle van de kwantificering langs de vastberaden as zal worden vermeld voor elke laag van het z-vlak en kanaal aanwezig in de afbeeldingsbestanden.</li>
			<li>Kopieer de gegevens voor elk kanaal (menubalk &#8594; bewerken &#8594; kopie) te verkrijgen van de vertegenwoordiging van de grafische profiel overeenstemt met de ondermeer signaal. Plak deze in een spreadsheet-software. Bereken de som waarde van elk kanaal voor elke pixel langs de lijn voor elke laag van het z-vlak. Deze waarden gebruiken voor een grafische weergave kunt maken die vergelijkbaar is met de gepresenteerd in Figuur 3.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Kwantificering van signaal in een aangewezen cellulaire oppervlakte- of volume.
	<ol><li>Het afbeeldingsbestand met ImageJ software geopend.</li>
		<li>Tekent een gebied om te duiden op het gebied van belang met behulp van de functie van de geometrische vorm (werkbalk &#8594; &#34; rechthoek, &#34; &#34; ovaal, &#34; of &#34; veelhoek &#34;). 
		Opmerking: De kwantificering waarde zal worden bepaald voor de oppervlakte die overeenkomt met het getekende formulier.</li>
		<li>Aanpassen de drempel om te voorkomen dat elke achtergrond signaal (menubalk &#8594; afbeelding aanpassen &#8594; drempel); een nieuw venster zal verschijnen om te vertegenwoordigen van de pixel intensiteiten in histogram vorm. Wijzig de waarden voor opnemen/niet opnemen van pixels in de kwantificering met behulp van de schuifregelaar. Selecteer een drempel die rode pixels buiten de cel elimineert, zoals pixels gemarkeerd in het rood zal worden opgenomen in de kwantificering.</li>
		<li>Definieer de parameters van de meting om te kwantificeren van het signaal van de pixel in het geselecteerde gebied, zonder achtergrond signaal (menubalk &#8594; analyseren &#8594; Set metingen), en controleer de &#34; limiet aan drempel &#34; en de &#34; geïntegreerde dichtheid &#34; vakken.</li>
		<li>Meten de kwantitatieve waarden voor het geselecteerde gebied (menubalk &#8594; analyseren &#8594; maatregel). 
		Opmerking: Signaal intensiteit kwantificering zal worden gepresenteerd in een nieuw venster onder de &#34; IntDen &#34; identificatie, die het product van de gemiddelde grijze waarden en het aantal pixels binnen het geselecteerde gebied vertegenwoordigt.</li>
		<li>Tekent een gebied waarin de gehele cel met behulp van een geometrische vorm (werkbalk &#8594; &#34; rechthoek, &#34; &#34; ovaal, &#34; of &#34; veelhoek &#34;) en ga verder met de stappen 4.2.3-4.2.5 om een waarde die overeenkomt met de totale signaal te verkrijgen. Berekening van de verhouding van het signaal binnen het geselecteerde gebied de hele signaal te verkrijgen van het percentage van het signaal binnen het interessegebied.</li>
		<li>Herhaal stappen 4.2.2-4.2.6 te verkrijgen van de kwantificering van cel volume voor elke z-plane. De geometrische vorm passen desgewenst.</li>
		<li>Kopieer/Plak de gegevens verkregen uit de &#34; resultaten &#34; windows voor elke laag van de z-plane in een spreadsheet voor grafische voorstelling en vindt een gemiddelde waarde.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Translation+of+Single+mRNA+Molecules+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Translation of Single mRNA Molecules In Vivo.</a> Cell. 165, 976-989 (2016).</li>
<li>Morisaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantification+of+single+RNA+translation+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells.</a> Science. 352, 1425-1429 (2016).</li>
<li>Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+dynamics+of+single+mRNAs+in+live+cells+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons.</a> Science. 352, 1430-1435 (2016).</li>
<li>Halstead, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRICK%3A+A+Single-Molecule+Method+for+Imaging+the+First+Round+of+Translation+in+Living+Cells+and+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals.</a> Methods Enzymol. 572, 123-157 (2016).</li>
<li>Bergeman, J., Caillier, A., Houle, F., Gagne, L. M., Huot, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+translation+regulates+cell+adhesion+and+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Localized translation regulates cell adhesion and transendothelial migration.</a> J Cell Sci. 129, 4105-4117 (2016).</li>
<li>El Fatimy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+Fragile+X+Mental+Retardation+Protein+in+a+Highly+Ordered+Neuronal+RiboNucleoParticles+Population%3A+A+Link+between+Stalled+Polyribosomes+and+RNA+Granules%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Tracking the Fragile X Mental Retardation Protein in a Highly Ordered Neuronal RiboNucleoParticles Population: A Link between Stalled Polyribosomes and RNA Granules.</a> PLoS Genet. 12, e1006192(2016).</li>
<li>Adjibade, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorafenib%2C+a+multikinase+inhibitor%2C+induces+formation+of+stress+granules+in+hepatocarcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells.</a> Oncotarget. 6, 43927-43943 (2015).</li>
<li>Paronetto, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sam68+regulates+translation+of+target+mRNAs+in+male+germ+cells%2C+necessary+for+mouse+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sam68 regulates translation of target mRNAs in male germ cells, necessary for mouse spermatogenesis.</a> J Cell Biol. 185, 235-249 (2009).</li>
<li>Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. S. U. nS. E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUnSET%2C+a+nonradioactive+method+to+monitor+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis.</a> Nat Methods. 6, 275-277 (2009).</li>
<li>Azzam, M. E., Algranati, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+puromycin+action%3A+fate+of+ribosomes+after+release+of+nascent+protein+chains+from+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 3866-3869 (1973).</li>
<li>Goodman, C. A., Hornberger, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+protein+synthesis+with+SUnSET%3A+a+valid+alternative+to+traditional+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Exerc+Sport+Sci+Rev%22%5BJournal%5D)">Measuring protein synthesis with SUnSET: a valid alternative to traditional techniques.</a> Exerc Sport Sci Rev. 41, 107-115 (2013).</li>
<li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> J Cell Biol. 197, 45-57 (2012).</li>
<li>Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+muscular+atrophy%3A+the+role+of+SMN+in+axonal+mRNA+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Spinal muscular atrophy: the role of SMN in axonal mRNA regulation.</a> Brain Res. 1462, 81-92 (2012).</li>
<li>Costa-Mattioli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+of+hippocampal+synaptic+plasticity+and+memory+by+the+eIF2alpha+kinase+GCN2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Translational control of hippocampal synaptic plasticity and memory by the eIF2alpha kinase GCN2.</a> Nature. 436, 1166-1173 (2005).</li>
<li>Costa-Mattioli, M., Sossin, W. S., Klann, E., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+of+long-lasting+synaptic+plasticity+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Translational control of long-lasting synaptic plasticity and memory.</a> Neuron. 61, 10-26 (2009).</li>
<li>Du, T. G., Schmid, M., Jansen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+cells+move+messages%3A+the+biological+functions+of+mRNA+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Why cells move messages: the biological functions of mRNA localization.</a> Semin Cell Dev Biol. 18, 171-177 (2007).</li>
<li>Ephrussi, A., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3A+the+bicoid+morphogen+gradient+matures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing: the bicoid morphogen gradient matures.</a> Cell. 116, 143-152 (2004).</li>
<li>Mardakheh, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Analysis+of+mRNA%2C+Translation%2C+and+Protein+Localization%3A+Local+Translation+Is+a+Key+Regulator+of+Cell+Protrusions%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Global Analysis of mRNA, Translation, and Protein Localization: Local Translation Is a Key Regulator of Cell Protrusions.</a> Dev Cell. 35, 344-357 (2015).</li>
<li>Lacsina, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+translational+termination+products+are+rapidly+degraded+substrates+for+MHC+class+I+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Premature translational termination products are rapidly degraded substrates for MHC class I presentation.</a> PLoS One. 7, e51968(2012).</li>
<li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).</li>
<li>Jacobs, J. P., Jones, C. M., Baille, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+a+human+diploid+cell+designated+MRC-5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Characteristics of a human diploid cell designated MRC-5.</a> Nature. 227, 168-170 (1970).</li>
<li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> J Vis Exp. (87), (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Recente technologische vooruitgang hebben toegestaan voor een beter begrip van de mechanismen die betrokken zijn bij translationeel opregulatie of de onderdrukking van specifieke mRNAs in biologische processen, zoals de neuronale ontwikkeling, drug reactie en metastase. De hier beschreven kosteneffectieve methode kunt vertaling gebeurtenissen worden gevisualiseerd in cellen om te bestuderen hoe RNA-bindende proteÃ¯nen reguleren metastatische processen, zoals cellulaire hechting, migratie en invasie.
<p class="jove_co...

De regulering van de vertaling door verschillende cellulaire functies heeft ertoe geleid dat vele onderzoeksteams te ontwikkelen van nieuwe instrumenten en methoden voor de bepaling van de subcellular localisatie van mRNA vertaling en gereglementeerde eiwit synthese1,2 ,3,4. Deze recente technologische vooruitgang zorgen voor een beter begrip van de mechanismen met betrekking tot vertaling opregulatie of de onderdrukking van specifieke mRNAs tijdens biologische processen, zoals de neuronale ontwikkeling, drug reactie en metastase5 ,6,7,8. Echter, de meeste van deze methoden vereist duur of gevaarlijke reagentia en specifieke apparatuur die mogelijk niet beschikbaar voor de meeste laboratoria. Als zodanig, werd een voordelige methode te voorzien in de snelle evaluatie van vertaling gebeurtenissen ontwikkeld om deze potentiële problemen specifiek te omzeilen. Deze methode detecteert acute translationeel modulaties die zich tijdens specifieke cellulaire processen voordoen en voorziet ook in de lokalisatie van de vertaling met behulp van de confocal microscopie.
De hier beschreven methoden werden gebruikt om te controleren van gelokaliseerde vertaling binnen subcellular compartimenten genaamd verspreiden initiatie centra (SIC)5. SICs zijn tijdelijke structuren gevonden in geplaatste cellen, die zijn gelokaliseerd op de top van ontluikende hechting complexen. Hoewel SICs en hechting complexen onderscheiden worden, zijn hun lot nauw verbonden. Inderdaad, SICs is bekend dat het geleidelijk aan verdwijnen op focal hechting complexe rijping in een hechting site tijdens de eerste fase van de hechting. We vonden dat RNA-bindende proteÃ¯nen bekend om specifiek mRNA vertaling (b.v., Sam68, FMRP en G3BP1) en polyadenylated RNAs werden verrijkt binnen deze structuren5. Met behulp van de methoden beschreven hier toonden wij dat de regulering van SIC-geassocieerde mRNA vertaling als een controlepunt waardoor fungeert zaadjes cellen wilt samenvoegen cel adhesie. Deze methode, op basis van puromycin de opneming, kan worden overwogen een aangepaste versie van de oppervlakte sensing van vertaling assay (zonsondergang). Oorspronkelijk ontwikkeld voor het meten van globale eiwit synthese tarieven met behulp van een niet-radioactief gelabelde aminozuur, biedt eiwit puromycilation een efficiënte manier te visualiseren van DOVO eiwit synthese9. Deze methode is gebaseerd op de intrinsieke werking van puromycin, een antibioticum dat vertaling door voortijdige keten beëindiging in de ribosome10 blokkeert. Inderdaad, puromycin is structureel analoog aan tyrosyl-tRNA, die voorziet in de opneming in het grondvlak van de peptide ketens via de vorming van een peptide-bond. Puromycin binding aan een groeiende peptide keten voorkomt echter dat een nieuwe peptide bond ontstaat met de volgende aminoacyl-tRNA, aangezien puromycin een niet-hydrolyseerbaar amide-binding in plaats van de hydrolyseerbaar ester-binding in tRNAs gevonden heeft. Dus, de opneming van puromycin in het grondvlak polypeptiden resulteert in de voortijdige vrijlating van talrijke afgeknotte puromycilated polypeptiden overeenkomt met actief vertaalde mRNA9,11,12 .
Met behulp van deze methode, was het mogelijk om binnen een korte tijd weduwe actieve vertaling beoordelen (bijvoorbeeld 5 min) tijdens de cellulaire hechting met behulp van een specifiek antilichaam gericht tegen puromycin op cellen die werden aangevuld met het antibioticum voor periodes van 5-min verwerken op verschillende tijdstippen tijdens de cel adhesie5. De nauwkeurigheid van deze test is gebaseerd op zeer specifieke antilichamen gericht tegen de groep van de puromycilated. Immunefluorescentie detectie van de puromycilated-polypeptide biedt een algemene subcellular verdeling van de nieuwe vertaalde mRNA, die ook kan worden gekwantificeerd met grote nauwkeurigheid met behulp van de confocal imaging systemen.
Vandaar, deze methode biedt tevens een relevante optie voor een groot aantal laboratoria studeren translationeel regulerende mechanismen betrokken bij processen zoals neuronale granulatie6,13,14, 15, morphogen mRNA lokalisatie en vertaling tijdens ontwikkeling16,17. Het is ook zeer geschikt voor het bestuderen van gelokaliseerde of verzuilde vertaling tijdens snelle biologische gebeurtenissen, zoals cel migratie, hechting, of invasie, of gewoon beoordelen drug behandelingen die vertalende wijzigingen5, induceren kunnen 7 , 18. over het algemeen met deze methode kan voor de visualisatie van gelokaliseerde of gecontroleerde vertaling gebeurtenissen in een snelle, nauwkeurige en kosteneffectieve manier.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>wisent</td><td>319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>wisent</td><td>325-043 EL</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12483020</td><td></td></tr><tr><td>Puroycin antibody 12D10</td><td>EMD millipore</td><td>MABE343</td><td>western blot dilutie 1:25.000 Immunofluoresentie dilutie 1:10.000</td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td><td>cell signaling technology</td><td>7076</td><td>western blot dilutie 1:8.000</td></tr><tr><td>Western Lightning Plus-ECL</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL104001EA</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugaat)</td><td>cell signaling technology</td><td>4408</td><td>immunofluoresentie dilutie 1:400</td></tr><tr><td>CF568 Phalloidin</td><td>biotium</td><td>00044</td><td>immunofluoresentie dilutie 1:400</td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma</td><td>C1988-1G</td><td>50&micro;g/ml uiteindelijke concentratie</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>uiteindelijke concentratie 1&micro;g/ml</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>bio-Basic</td><td>PJ593</td><td>2,5&micro;g/ml tot 10&micro;g/ml</td></tr><tr><td>Ibidi &micro;-Dish 35 mm, hoog, ibiTreat</td><td>Ibidi</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>MRC-5 cellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>HeLa cellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Huh-7 cellen</td><td>van Dr. Mazroui (Universit&eacute; Laval)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fv1000</td><td>olympus</td><td></td><td>confocal beeldvormingssysteem</td></tr><tr><td>Fiji software</td><td></td><td></td><td>http://fiji.sc</td></tr><tr><td>PBS (Phosphate Buffered Saline)</td><td>bio-Basic</td><td>PD8117</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde 37% Oplossing</td><td>bio-Basic</td><td>C5300-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>bio-Basic</td><td>TB0198</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP9702-100</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP337-500</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantitatieve immunofluorescentie te meten global gelokaliseerd vertaling

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

De mechanismen tot regeling van mRNA vertaling zijn betrokken in verschillende biologische processen, zoals kiem lijn ontwikkeling, celdifferentiatie en organogenese, evenals in meerdere ziekten. Talrijke publicaties hebben overtuigend aangetoond dat de specifieke mechanismen strak mRNA vertaling regelen. Toegenomen belangstelling voor de vertaling-geïnduceerde regulering van eiwit expressie heeft geleid tot de ontwikkeling van nieuwe methoden om te bestuderen en volgen DOVO eiwit synthese in gnudles. Meeste van deze methoden zijn echter complex, waardoor ze duur en vaak een beperkt aantal mRNA doelen die kunnen worden bestudeerd. Dit manuscript wordt voorgesteld een methode waarvoor alleen eenvoudige reagentia en een confocal fluorescentie imaging systeem om te meten en visualiseren van de veranderingen in vertaling van mRNA die op een willekeurige cellijn onder verschillende omstandigheden optreden. Deze methode werd onlangs gebruikt om te laten zien van gelokaliseerde vertaling in de subcellular structuren van Adherente cellen over een korte periode van tijd, waardoor de mogelijkheid van het visualiseren van DOVO vertaling voor een korte periode tijdens een verscheidenheid van biologische processen of wijzigingen in translationeel activiteit in reactie op specifieke stimuli te valideren.

Om te nauwkeurig observeren vertaling gebeurtenissen met behulp van de opneming van de puromycin, is het van cruciaal belang om te bepalen van de optimale omstandigheden voor elke regel van de cel, omdat elk verschillende puromycin opneming kinetiek (Figuur 1)9,11 toont ,12,18. Vandaar, om te valideren puromycin integratie, is het ...

Dit manuscript beschrijft een methode om te visualiseren en te kwantificeren van gelokaliseerde vertaling gebeurtenissen in subcellular compartimenten. De in dit manuscript voorgestelde benadering is vereist van een basissysteem voor confocal beeldvorming en reagentia en snelle en kostenefficiënte.

Kwantitatieve immunofluorescentie te meten Global gelokaliseerd vertaling

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Het algemene doel van dit experiment is om gecompartimentaliseerde translatiegebeurtenissen die plaatsvinden tijdens de eerste stappen van celadhesie te visualiseren en te kwantificeren. Deze methode heeft een brede toepassing. Gebruik deze methode telkens wanneer een snelle, specifieke translatierespons moet worden bepaald, zoals bij het analyseren van celmigratie, adhesie of een vroege respons op geneesmiddelen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze eenvoudig, snel en kosteneffectief is. Er zijn slechts puromycine, antilichamen tegen puromycine en het standaard confocale scan-beeldvormingssysteem nodig. Begin met het maken van een suspensie van MRC-5-cellen.Voer trypsinisatie uit, gevolgd door centrifugatie, verwijdering van het supernatant en vervolgens resuspensie in DMEM met tien procent FBS, bij 40 thousand cellen per milliliter. Incubeer de suspensie met zachte rotatie gedurende 20 minuten om de focale adhesiecomplexen volledig te dissociëren. Dit is van cruciaal belang.Voeg vervolgens in twee glazen bodemschalen van 35 millimeter aliquots van twee milliliter van de suspensie toe en incubeer deze om celadhesie en SiC-vorming mogelijk te maken. Behandel na 4

quantitative-immunofluorescence-to-measure-global-localized

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

This video demonstrates a method for monitoring infected cell protein 0, ICP0 trafficking in herpes simplex virus-1 infection. Post-de novo synthesis, ICP0 translocates to the nucleus, later moving to the cytoplasm during infection progression. Immunofluorescence microscopy reveals and analyzes the protein's subcellular localization, offering insights into its trafficking across infection phases.

An Immunofluorescence Technique for Viral Protein Localization in Infected Cells

Hier beschrijven we een methode om endoplasmatisch reticulum-geassocieerde mRNA in zoogdiercellen visualiseren weefselcultuurcellen. Deze techniek omvat het selectieve permeabilisatie van het plasmamembraan met digitonine verwijderen cytoplasmatische inhoud gevolgd door...

Visualisatie van endoplasmatisch reticulum gelokaliseerd mRNA&#39;s in zoogdiercellen

Hier wordt een nieuwe kwantitatieve fluorescentietest ontwikkeld om veranderingen in het niveau van een specifiek eiwit op centrosomen te meten door de fluorescentie-intensiteit van dat eiwit te normaliseren naar die van een geschikte interne standaard.

Kwantitatieve immunofluorescentiebepaling op het Variatie in eiwitgehalten op centrosomes Maatregel

De belangrijkste aderente celtypen die zijn afgeleid van menselijk spierweefsel zijn myogene cellen en fibroblasten. Hier worden celpopulaties verrijkt met behulp van magnetisch geactiveerde celsortering op basis van het CD56-antigeen. Daaropvolgende immunolabeling met specifieke antilichamen en het gebruik van beeldanalysetechnieken maakt kwantificering van cytoplasmatische en nucleaire kenmerken in individuele cellen mogelijk.

Isolatie en Kwantitatieve Immunocytochemische karakterisering van primaire Myogene cellen en fibroblasten van Human Skeletal Muscle

Dit protocol beschrijft een methode om de nucleocytoplasmatische transportsnelheid binnen motor neuronachtige NSC-34 cellen nauwkeurig te meten door de real-time verandering in de nucleaire invoer van een NLS-NES-GFP eiwit te kwantificeren.

Assay voor het meten van nucleocytoplasmisch transport in realtime binnen motor neuronachtige NSC-34 cellen

De precieze lokalisatie van Golgi bewoners is van essentieel belang voor het begrijpen van de cellulaire functies van het Golgi. Conventionele optische microscopie is echter niet in staat om op te lossen van de sub-Golgi-structuur. Hier beschrijven we het protocol voor een conventionele microscopie gebaseerd super resolutie methode kwantitatief bepalen de sub-Golgi-lokalisatie van een eiwit.

Kwantitatieve lokalisatie van een Golgi-eiwit door Imaging Center van fluorescentie massa

We beschrijven het gebruik van kwantitatieve immunoblotting te valideren immunofluorescentie histologie beeldanalyse wordt gekoppeld als een middel voor het kwantificeren van een proteïne van belang in formaline-vaste, paraffine-ingebedde weefselsteekproeven van (FFPE). Onze resultaten tonen aan dat het nut van immunofluorescentie histologie voor het vaststellen van de relatieve hoeveelheid biomerker eiwitten in routine biopsie monsters.

Kwantitatieve Immunoblotting van cellijnen als een standaard voor het valideren van de immunofluorescentietest voor het kwantificeren van Biomarker eiwitten in Routine weefselsteekproeven

Hier beschrijven we een kwantitatieve benadering bij de vaststelling van de verdeling van een synaptic eiwit ten opzichte van een marker eiwit met immunofluorescentie kleuring, confocal microscopie en computer-gebaseerde analyse.

Kwantificeren van de heterogene verdeling van een Synaptic proteïne in de hersenen van de muis met immunofluorescentie

Reproducibly het om getallen te tellen van mRNAs in individuele eicellen, enkel molecuul RNA fluorescentie in situ is hybridisatie (RNA-vis) geoptimaliseerd voor niet-aanhanger cellen. Eicellen werden verzameld, gekruist met het transcript specifieke sondes en gekwantificeerd aan de hand van een afbeelding kwantificering software.

Gebruik van één molecuul fluorescentie In Situ hybridisatie (SM-vis) om Quantify en lokaliseer mRNAs in lymfkliertest eicellen

Het volgen van individuele vertaalgebeurtenissen maakt kinetische studies met hoge resolutie van cap-afhankelijke vertaalmechanismen mogelijk. Hier demonstreren we een in vitro single-molecule assay op basis van beeldvormende interacties tussen fluorescerend gelabelde antilichamen en epitoop-gelabelde ontluikende peptiden. Deze methode maakt single-molecule karakterisering van initiatie en peptide rekkinetiek mogelijk tijdens actieve in vitro cap-afhankelijke vertaling.

Een in vitro single-molecule imaging assay voor de analyse van cap-afhankelijke vertaalkinetiek

Leer kwantitatieve immunofluorescentie om gelokaliseerde translatie te meten tijdens celadhesie met MRC-5-cellen. Deze snelle, kosteneffectieve methode gebruikt puromycine en standaard confocale microscopie.

Kwantitatieve immunofluorescentie te meten Global gelokaliseerd vertaling

Meer video's verkennen