Onderzoeken van von Willebrand Factor pathofysiologie met behulp van een Flow kamer Model van von Willebrand Factor-bloedplaatjes String vorming

Het algemene doel van deze procedure is om von Willebrand factor of VWF-trombocytstrengvorming te observeren en te kwantificeren als reactie op secretagogues. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de biologie van Von Willebrand factor en de pathofysiologie van het wavo-palliatieve lichaam. Het helpt ons ook om vragen te beantwoorden over mutaties die de afgifte van von Willebrand factor en de bindingsfunctie van trombocyten beïnvloeden.

Het grote voordeel van deze techniek is dat het de in-vivo interacties tussen sub-endotheel collageen, endotheelcellen VWF en trombocyten in een visueel en kwantitatief in-vitro systeem weergeeft. Ik vind de visuele demonstratie van deze methode essentieel. De vereiste microscopie stappen voor het vastleggen van VWF-trombocytstrengvorming onder meerdere gelijktijdige omstandigheden in real-time kunnen moeilijk te beheersen zijn door tekst alleen.

Begin met het laden van 0,5 milliliter collageencoatingbuffer in een 1 milliliter luer lock spuit. Draai het uiteinde van de spuit op het reservoir van een flowkamerslide en druk langzaam de zuiger in totdat de hele baan is gecoat en elk reservoir vol is. Vul de reservoirs bij om ervoor te zorgen dat ze allemaal vol zijn.

Wanneer alle banen zijn geladen, incubeer de kamer gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius. Gebruik de volgende dag een 200 microliter pipet om de collageencoatingbuffer te verwijderen. Spoel vervolgens elke baan af met HBSS, en aspireer de zoutoplossing met een 200 microliter pipet.

Nadat de derde ronde van HBSS is weggegooid, voeg ongeveer drie keer 10 tot de 6e Bloeduitbreiding Endotheelcellen per milliliter in 100 microliters groeimedium toe aan elke baan van de flowkamer, aangevuld met 10% FBS. Breng de kamer vervolgens terug naar de 37 graden Celsius incubator gedurende 24 uur, en ververs het medium elke acht tot 12 uur. Om het flowapparaat te assembleren, bevestigt u eerst een mannelijke elleboog luer connector aan het ene uiteinde van elk van de drie 70 centimeter stukken steriele siliconen slang.

En bevestig een vrouwelijke luer lock adapter aan het andere uiteinde van elk buisje. Verbind de vrouwelijke luer lock adapters met individuele 20 milliliter spuiten en programmeer de spuitpomp. Laad de spuiten op de pomp en zet stevige beugels rond de spuiten en zuigers.

Bevestig vervolgens individuele mannelijke elleboog luers aan beide uiteinden van drie verschillende 20 centimeter stukken steriele siliconen slang, en verbind een afgeronde 18 gauge naald aan een van elk van de drie elleboog luers. Selecteer vervolgens op een draaischijfmicroscoop uitgerust met een volledig geautomatiseerde stage het 20x objectief en stel de juiste kanaalinstellingen in. Om de volledige dynamische gegevensbereik te verkrijgen, stelt u de electron multiplying charge coupled device in op een electron multiplying gain van 150 met een belichtingstijd van 200 milliseconden.

Stel de 491 nanometer laservermogen in op 20%en gebruik de microscoopsoftware om het centrum van alle drie de banen te markeren. Stel de Z-bereik in op 1,0 micrometer en de stapgrootte op 0,5 micrometer. Selecteer ten slotte de duur en het interval om elke 10 seconden een afbeelding te maken bij 60 tijdstippen per slide.

Om de vorming van VWF-trombocytstrengjes te induceren, vervangt u het kweekmedium van drie banen van de flowkamer, met alleen serumvrij medium als controle, vervolgens de stimulans van belang verdund in 100 microliters serumvrij medium naar de extra banen. Incubeer vervolgens de kamer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Aan het einde van de stimulatieperiode, spoel alle drie de banen met 100 tot 200 microliters PBS, en gebruik vasculaire clips om de flowkamer op een slidestand af te beelden.

Bevestig een mannelijke luer connector van het uiteinde van een stuk van 70 centimeter slang aan elk reservoir van de flowkamer. En start de spuitpomp om de PBS-was te verwijderen. Pipetteer extra PBS in het tegenovergestelde flowkamerreservoir om ervoor te zorgen dat de banen niet droog lopen.

Zodra gelijkwaardige flow is bevestigd, pauzeert u de spuitpomp. Bevestig een 5 milliliter spuit met een vrouwelijke luer lock koppeling aan de eerste vrije mannelijke luer connector. En dompel de afgeronde naald in een 1,5 milliliter microcentrifugebuisje met fluorescentie gelabelde gewassen trombocytoploos oplossing.

Trek langzaam de trombocytoploos oplossing door de slang om er zeker van te zijn dat er geen luchtbellen in het systeem zijn. Bevestig de mannelijke luer aan het open reservoir van de flowkamer, en laad de andere twee banen met trombocytoploos oplossing, zoals net gedemonstreerd. Controleer de flowsysteemopstelling om ervoor te zorgen dat alle verbindingen veilig zijn.

Start de spuitpomp opnieuw en beeld de trombocytflow gedurende 10 minuten in het donker. Koppel vervolgens de luer los van de inlaatbuis op de flowkamer reservoir. En vul het reservoir met PBS om een zachte zoutwaterstroom over de endotheelcel monolaag te behouden.

Om de VWF-trombocytstrengvorming te kwantificeren, maakt u 10 afbeeldingen per slide van elke baan zonder overlapping vanuit het midden van de slide. Wanneer alle afbeeldingen zijn verkregen, opent u de beeldverwerkingssoftware en klikt u op afbeelding, aanpassen en helderheid contrast. Om de helderheid van de eerste afbeelding aan te passen, sleept u de scrollbalk totdat de aangehechte trombocyten goed genoeg kunnen worden bekeken voor kwantificering.

Neem vervolgens een VWF-trombocytstreng op wanneer drie of meer uitgelijnde trombocyten worden waargenomen en tel alle strengen in de afbeelding. Na de initiëring van flowomstandigheden, tonen de onbehandelde cellen zeer weinig VWF-trombocytstrengjes vergeleken met histamine, of PMA behandelde cellen. Die gemiddeld twee tot drie strengen per veld van zicht vertonen.

Bovendien, histonen, die trombocyten evenals endotheelcellen activeren, induceren de productie van meer VWF-trombocytstrengjes dan onbehandeld, of histamine, of PMA gestimuleerde controles. Terwijl u deze procedure probeert