Retrovirale Scanning: Mapping MLV Integration Sites om de specifieke codespecifieke regio's te definiëren

Het algemene doel van deze procedure is om integratieplaatsen van retrovirale vectoren, afgeleid van het muizenleukemievirus, in kaart te brengen om cel-specifieke regulatoire regio's te definiëren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in gentherapie- en genregulatiestudies, zoals waar de vector integreert in het menselijk genoom en welk regulatoir element actief gebruikt kan worden via een specifiek subtype. Het idee voor deze methode ontstond nadat we observeerden dat MLV-vectoren in gentherapiestudies integreren in actieve, subtype-specifieke promotors en enhancers.

Begin met het transduceren van de doelcellen met een MLV-afgeleide retrovirale vector die het EGFP-reportergen bevat en gepseudotypeerd is met VSV-G of het amfrotrope envelop-glycoproteïne. Mock-getransduceerde cellen worden gebruikt als negatieve controle. Centrifugeer de monsters 48 uur na transductie en resuspendeer vervolgens 100.000 cellen in 300 µL PBS met twee procent foetaal runderserum.

Meet vervolgens de EGFP-expressie via flowcytometrische analyse. Oogst nog eens 0,5 tot vijf miljoen getransduceerde cellen voor de preparatie van genomisch DNA en de daaropvolgende restrictie-enzymdigestie. Zet vier restrictie-enzymdigesties per monster op in 1,5 milliliter buisjes.

Verteer 0,1 tot 1 µg G-DNA in elke buis door 10 units TRU91 en 1 µL buffer M per monster toe te voegen in een eindvolume van 10 µL. Pipetteer 2 µL van het mengsel in de digestiebuizen.

Incubeer de reacties vervolgens gedurende zes uur of overnacht bij 65 °C. Voeg na de incubatie 40 µL water toe aan een buisje van 1,5 mL. Voeg in hetzelfde buisje 10 units PST1 en 1 µL buffer H per monster toe.

Pipetteer 10 µL van het digestiemengsel in de digestiebuisjes. Incubeer de reacties gedurende zes uur of overnacht bij 37 °C. Zet de volgende dag acht linker-ligatiereacties op in 1,5 mL buisjes.

Voeg voor elke reactie het ligasereactiemengsel toe aan 10 µL van het gedigesteerde genomische DNA. Incubeer gedurende drie tot zes uur bij 16 °C. Zet voor de eerste ronde PCR 48 PCR-reacties op in 0,2 mL buisjes.

Voeg voor elke PCR het reactiemengsel met de linker-primer en de MLV3 prime LTR-primer toe aan twee microliters van de ligatiereactie. Plaats de monsters in een thermocycler met verwarmde klep. Stel de cyclingsparameters in en voer de eerste ronde van de PCR-reactie uit.

Stel voor de tweede ronde PCR het reactiemengsel samen, inclusief de linker nested primer en de MLV3 prime LTR nested primer. Voeg vervolgens twee µL van het PCR-product uit de eerste ronde PCR toe als template. Voer daarna de tweede ronde PCR-reactie uit om de uiteindelijke LN PCR-producten te genereren.

Na de tweede ronde PCR worden de 48 nested LM PCR-reacties verzameld in een buis van 15 milliliter. Voeg vervolgens 20 microliters laadbuffer toe aan 100 microliters van het gepoolde en geprecipiteerde LM PCR-product. Laad het monster vervolgens op een agarosegel van één procent, samen met de 100 base pair DNA-ladder.

Voer de gel door bij vijf volt per centimeter gedurende 30 tot 60 minuten; zodra de banden gescheiden zijn, snijdt u het deel van de gel uit dat amplicons van 500 tot 150 baseparen lang bevat. Nadat het LM PCR-product is gezuiverd met een kolomgebaseerde gel-extractiekit, meet u de concentratie met een UV-spectrofotometer voordat u overgaat tot de library-preparatie. Evalueer daarnaast de lengte van de LM PCR-producten met een bioanalyzer-instrument volgens de instructies van de fabrikant.

Bereid de bibliotheek voor door een indexerings-PCR op te zetten. Gebruik voor elke PCR 150 tot 170 nanogram gezuiverd LM PCR-product, met een verschillende indexcombinatie voor elk monster. Voer de PCR uit in een thermocycler met verwarmde klep zoals aangegeven.

Verdun na de PCR de gezuiverde library tot 10 nanomolair met 10 millimolair tris HCL. Meng vervolgens vijf microliter van de verdunde pool met vijf microliter 0,2 newton natriumhydroxide in een nieuwe 1,5 milliliter buis. Vortex kort, centrifugeer en incubeer daarna vijf minuten bij kamertemperatuur om de libraries te denatureren.

Plaats de buisjes met gedenatureerde pool op ijs en voeg 990 µL vooraf gekoelde HT1-hybridisatiebuffer toe. Aliquoteer vervolgens 300 µL van de gedenatureerde pool in een nieuw buisje van 1,5 mL. Voeg 300 µL vooraf gekoelde HT1 toe om een uiteindelijke library pool van 10 pM te verkrijgen.

Meng parallel 10 nanomolair van de vaste controlebibliotheek in een volume van twee microliter met 3 microliter 10 millimolair tris HCl in een 1,5 milliliter buis. Voeg vijf microliter 0,2 newton natriumhydroxide toe en vortex kort. Na het centrifugeren, incubeer vijf minuten bij kamertemperatuur om de verdunde fix te denatureren.

Plaats de buis na de incubatie op ijs en voeg 990 µL vooraf gekoelde HT1 toe. Pipetteer nu 100 µL van de gedenatureerde fix in een nieuwe buis van 1,5 mL en voeg 300 µL vooraf gekoelde HT1 toe om een uiteindelijke concentratie van 10 pM fix te verkrijgen. Meng tot slot in een nieuwe buis van 1,5 mL 510 µL van de gedenatureerde library pool met 90 µL van de gedenatureerde fixed library, zodat een uiteindelijke pool van 10 pM met 15% fix-controle wordt verkregen voor sequencing.

Deze afbeelding toont de analyse van respectievelijk 3498, 2989 en 4103 clusters van recurrente MLV-integratieplaatsen in hematopoëtische stam- en progenitorcellen, erytroïde progenitoren en myeloïde progenitoren. In elke celpopulatie overlapte meer dan 95% van de MLV-clusters met epigenetisch gedefinieerde enhancers en promotors. Celspecifieke MLV-doelregio's waren sterk geacetyleerd en geassocieerd met de celspecifieke expressie van het doelgen.

Voorbeelden zijn de promotor van het HSP-specifieke SPINK2-gen. De locus-controlregio die potente enhancers bevat van de erytroïde-specifieke bèta-achtige globinegenen. Enhancers die stroomopwaarts van het NPP-specifieke LYZ-gen liggen.

Luciferase reporter-assays valideerden de subset van cel-specifieke MLV-getargette enhancers in EPP en MPP. Erythroïde-specifieke MLV-getargette regio's vertoonden een hogere activiteit in EPP dan in MPP en vice versa, wat bevestigt dat MLV cel-specifieke enhancers identificeert die mogelijk de expressie van nabijgelegen genen reguleren. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in één week worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de frequentie van getransduceerde cellen te maximaliseren voor een optimale terugwinning van de integratieplaatsen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in het in kaart brengen van virale integratieplaatsen door eerst het genomisch DNA aan te passen, vervolgens de genomische fragmenten te ligeren met een DNA-linker, daarna de junctie tussen het gastgeurgenoom en het virus te amplificeren via LM-PCR en tot slot de amplicon-bibliotheek via deep sequencing te analyseren.