Een eenvoudige, robuuste en hoge doorvoer enkel molecuul Flow uitrekkende Assay uitvoering voor de studie van vervoer van moleculen langs DNA
1 oktober 2017
Dit protocol demonstreert een eenvoudig, robuust en hoge doorvoer enkel molecuul stroom-stretching assay voor het bestuderen van de eendimensionale (1D) verspreiding van moleculen langs DNA.
Het algemene doel van deze procedure is om een eenvoudige, robuuste en hoogdoorlaatsingle molecuul flow rektest op te bouwen voor het bestuderen van transport van moleculen langs DNA. Dit wordt bereikt door eerst biotin-gelabeld lambda-DNA te bereiden door een biotin-gelabeld oligo aan lambda-DNA te binden. De tweede stap is om Polyethyleen Glycol of PEG functionele deksels voor te bereiden door een eenstaps reactieprotocol te volgen.
Vervolgens wordt een hoogdoorlaat flow cel geconstrueerd door een dubbelzijdig tape met voorgesneden kanalen te plaatsen tussen een PEG functioneel deksel en een polydimethylsiloxaan of PDMS plaat met inlaat- en uitlaatgaten. De laatste stap is om de trajecten van enkele fluorescerende moleculen in het stromingskanaal te volgen door middel van time-lapse Total Internal Reflection Fluorescence of TIRF beeldvorming. Om de trajecten van enkele moleculen die langs flow gestrekt lambda-DNA diffunderen te identificeren, wordt een betrouwbare en efficiënte aangepaste single deeltje volgsoftware gebruikt om ruwe fluorescentiebeelden te analyseren.
De belangrijkste voordelen van deze assayconfiguratie boven alternatieven zijn de betrouwbaarheid van de dekselvoorbereiding, hogere doorlaatcapaciteit, minder hands-on tijd voor samplevoorbereiding en een meer gestroomlijnde onbegeleide data-analyse. Het demonstreren van de procedure zal een post-doc in mijn laboratorium zijn, Dr.Kan Xiong. Voordat u met deze assay begint, bereidt u alle benodigde reagentia voor zoals beschreven in de protocoltekst.
Verhit 0,5 milligram per milliliter lambda-DNA stock tot 65 graden Celsius gedurende 60 seconden en dompel het meteen in nat ijs. Meng 100 microliter van de lambda-DNA oplossing met twee microliter van 10 micromolair biotin-gelabeld oligo in een microcentrifugebuisje. Verhit het mengsel gedurende 60 seconden op 65 graden Celsius en koel dan langzaam af tot kamertemperatuur.
Plaats het mengsel op ijs. Voeg 11 microliter van T4 DNA ligase reactiebuffer toe en meng voorzichtig. Voeg vervolgens twee microliter toe, gelijk aan 800 eenheden van T4 DNA ligase, en meng voorzichtig.
Incubeer het mengsel gedurende twee uur bij 16 graden Celsius of overnacht bij vier graden Celsius. Zuiver het product door middel van centrifugale filterbuisjes met een nominale molecuulgewichtslimiet van 100 kilodalton. Soniceer deksels nummer één in 95% ethanol in een kleedpot gedurende 10 minuten en spoel vervolgens drie keer met ultrapuur water.
Vul de kleedpot met één molair kaliumhydroxide, soniceer gedurende 10 minuten opnieuw en spoel vervolgens drie keer met ultrapuur water. Herhaal deze cyclus twee keer. Droog de deksels onder schone, droge stikstofgasstroom.
Reinig en droog de deksels verder door luchtplasmabehandeling uit te voeren bij 900 millitorr druk gedurende vijf minuten. Incubeer deksels met 50 microliter van 25 milligram per milliliter silane-polyethyleenglycol-biotine opgelost in 95% ethanol bij kamertemperatuur gedurende twee uur. Was overtollig polyethyleenglycol weg met ultrapuur water en droog de polyethyleenglycol-gecoate deksels onder schone, droge stikstofgasstroom.
Ontwerp stromingskanalen met behulp van CAD-software en snijd de kanalen op een dubbelzijdig tape met behulp van een tape snijder. Verwijder taperesten binnen de kanalen. Om PDMS platen te maken, meng 45 gram PDMS grondig met vijf gram crosslink reagens met behulp van een menger.
Giet het mengsel in twee 100 millimeter Petri schotels en laat de schotels ongeveer 30 minuten in een vacuümkamer staan totdat alle luchtbellen verdwenen zijn. Laat de schotels ongeveer twee uur in een 80 graden Celsius oven staan totdat PDMS gesolidificeerd is. Snijd een PDMS plaat uit die overeenkomt met de grootte van de dubbelzijdig tape met voorgesneden kanalen.
Verwijder een beschermfolie van de dubbelzijdig tape en hecht deze aan een platte kant van de PDMS plaat. Maak uitlaat- en inlaatgaten in de PDMS plaat door middel van een biopsie gatsnijder met een 23 gauge naald. Verwijder de andere beschermfolie van de dubbelzijdig tape en hecht deze aan het gefunctionaliseerde oppervlak van het deksel.
Bevestig de geassembleerde flow cel op een microscoopfase inzet. Laad alle vooraf gedegasseerde reagentia in reservoirs die een Tygon buis hebben verbonden met een magneetventiel en een andere buis verbonden met een PEEK buis die terugstroming van reagentia voorkomt. De stroming van reagentia wordt gecontroleerd door magneetventielen die worden aangestuurd door een scriptprogrammeerapplicatie.
Prime één stromingskanaal door middel van een lege buffer. Plaats drie andere PEEK buizen in de inlaatgaten. Wees voorzichtig om geen luchtbelletjes te veroorzaken binnen het kanaal.
Verbind een Tygon buis met een korte PEEK buis vanaf het uitlaatgat naar een monsterafvalcontainer. Stroom in 0,2 milligram per milliliter Streptavidin oplossing en incubeer gedurende vijf minuten. Stroom vervolgens in lege buffer om de ongebonden Streptavidin weg te spoelen.
Stroom in één milligram per milliliter bovien serum albumine oplossing en incubeer gedurende één minuut. Stroom vervolgens in lege buffer om de ongebonden bovien serum albumine weg te spoelen. Stroom in 100 picomolair biotin-lambda-DNA oplossing en incubeer gedurende 10 minuten.
Stroom vervolgens in lege buffer om de ongebonden lambda-DNAs weg te spoelen. Om de kwaliteit van het PEG gefunctioneerde deksel te controleren, stroom in DNA kleuring kleurstof zoals SYTOX Oranje kleurstof en start fluorescentie beeldvorming. Als de kwaliteit van het deksel goed is, zal de dichtheid van flow gestrekt lambda-DNAs hoog zijn.
Stel ook de TIRF hoek in om de hoogste signaal-ruisverhouding van afbeeldingen van bijna volledig flow gestrekt lambda-DNAs te bereiken. Om de trajecten van enkele moleculen te volgen, start incubaties binnen een nieuw kanaal en fuseer subnanomolair fluorofoor-gelabelde moleculen bij een voldoende hoge stromingssnelheid door middel van een spuitpomp en verzamel time-lapse fluorescentiebeelden met een framesnelheid van 100 Hertz. Typisch worden 10
Overzicht
Dit protocol demonstreert een eenvoudige, robuuste en hoogdoorvoerige flow-stretching assay voor één molecuul om eendimensionaal (1D) diffusie van moleculen langs DNA te bestuderen. De methode maakt het mogelijk om enkele fluorescerende moleculen te volgen in een gecontroleerde stromingsomgeving, wat het begrip van moleculaire transportmechanismen verbetert.
Belangrijkste Studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Biofysica
- Moleculair Biologie
Achtergrond
- Assays voor één molecuul zijn cruciaal voor het bestuderen van moleculaire dynamica.
- Flow-stretching technieken verbeteren de resolutie van moleculair volgen.
- Biotine-gelabeld DNA dient als substraat voor diffusiestudies van moleculen.
- Efficiënte data-analyse is essentieel voor hoogdoorvoerige experimenten.
Doel van Studie
- Om een hoogdoorvoerige assay te ontwikkelen voor het bestuderen van 1D diffusie langs DNA.
- Om de betrouwbaarheid en efficiëntie van één molecuul volgen te verbeteren.
- Om de voorbereidings- en analyseprocessen in moleculaire studies te stroomlijnen.
Gebruikte Methoden
- Bereiding van biotine-gelabeld lambda-DNA door middel van ligatie.
- Fabricage van PEG-gefunctionaliseerde dekglasjes voor verbeterde binding.
- Constructie van een flowcel voor gecontroleerde moleculaire transport.
- Gebruik van TIRF-beeldvorming voor het volgen van trajecten van enkele moleculen.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvol volgen van enkele fluorescerende moleculen langs flow-gestrekt DNA.
- Gedemonstreerde hoge doorvoercapaciteit en verminderde hands-on tijd.
- Betrouwbare identificatie van moleculaire trajecten met behulp van aangepaste software.
- Hoge dichtheid van flow-gestrekt lambda-DNA bevestigd door beeldvorming.
Conclusies
- De ontwikkelde assay biedt een robuust platform voor het bestuderen van moleculaire diffusie.
- Gestroomlijnde methoden verbeteren de experimentele efficiëntie en datakwaliteit.
- Deze aanpak kan worden toegepast op verschillende moleculaire transportstudies.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
This high throughput single molecule flow-stretching assay enables quantitative analysis of 1D molecular transport along DNA, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. By providing reproducible, automated data on molecular binding and diffusion kinetics, it improves predictive confidence in lead identification and reduces biological uncertainty in preclinical decision-making. The scalable, streamlined workflow enhances enterprise reuse across multiple transport studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying 1D diffusion constants of molecules along DNA templates.
- Operational Value: Supports biological de-risking through reliable, high-resolution tracking of single-molecule binding and transport activity.
- Predictive Value: Generates quantitative diffusion metrics that aid in portfolio triage and mechanistic target validation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated, flow-stretched DNA substrates for consistent compound evaluation in transport assays.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via automated flow control and PEG-biotin surface functionalization.
- Scalability: Integrates multiple channels per flow cell with automated reagent delivery, increasing throughput and reducing hands-on time.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides disease-relevant system insights by enabling quantitative comparison of molecular transport under controlled conditions.
- Mechanistic De-risking: Links discovery-phase transport data to preclinical advancement decisions through statistically robust trajectory analysis.
- Predictive Confidence: Filters trajectories using defined thresholds (MinXDisp, MaxYDisp, minFrames) to ensure data quality for go/no-go assessments.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, delivering quantitative transport data that informs hit-to-lead progression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring 1D diffusion of fluorescently labeled molecules along DNA.
- Screening: Delivers assay readiness via high-density, flow-stretched DNA templates and automated microfluidic channel integration.
- Analytics: Generates 1D diffusion constant estimates from tracked trajectories, enabling cross-condition comparison of molecular transport.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing quantitative, reproducible transport metrics for target engagement studies.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for diverse molecular transport studies due to modular flow cell design and streamlined analysis.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through quantitative 1D diffusion measurements and reduced mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via automated flow control and PEG-biotin surface preparation.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk via early transport profiling.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on diffusion constant thresholds and trajectory filtering.
Implementation Considerations
- Expertise in single molecule biophysics, microfluidics, and fluorescence microscopy.
- Instrumentation for TIRF imaging, syringe pump flow control, and solenoid valve automation.
- Cross-team standardization of surface functionalization, flow rates, and trajectory analysis parameters.
- Adaptation considerations for different DNA lengths, fluorophores, and transport molecules.
- Practical limitations include the need for optimized threshold values in single particle tracking and careful avoidance of air bubbles during flow cell assembly.
