Peptide en proteïne kwantificering met behulp van geautomatiseerde Immuno-MALDI (iMALDI)
18 augustus 2017
Een protocol voor de kwantificering van de eiwitten in complexe biologische vloeistoffen met behulp van geautomatiseerde immuno-MALDI (iMALDI) technologie wordt gepresenteerd.
Het algemene doel van deze geautomatiseerde immuno-MALDI-test is om peptiden en intacte eiwitten in complexe biologische vloeistoffen op een nauwkeurige en gevoelige manier te kwantificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van kwantitatieve proteomics, zoals het kwantificeren van eiwitniveaus voor diagnose of voor het monitoren van de reactie van een patiënt op behandeling. Het grote voordeel van deze methode is dat het eiwitniveaus zeer gevoelig en nauwkeurig kan kwantificeren uit complexe monsters.
Deze techniek maakt de diagnose van ziekten in een vroeg stadium mogelijk omdat de immuno-verrijkingsstap van de test kwantificering van laag abundantie-eiwit en peptide biomarkers mogelijk maakt. Hoewel deze methode inzicht kan geven in plasma renine-activiteit, kan deze ook worden toegepast op andere ziektegerelateerde studies, zoals kwantificering van kankergerelateerde eiwitten voor prognose, diagnose en behandelingsbeheer. Om met deze procedure te beginnen, ontdooi menselijke plasmamonsters gedurende vijf minuten in een waterbad op kamertemperatuur.
Plaats vervolgens de monsters op ijs tot ze volledig zijn ontdooid. Draag vervolgens handmatig 200 microliter van elk plasmamonster over naar aparte putjes van een 1,1 milliliter diepe putjesplaat. Centrifugeer de plaat gedurende 10 minuten bij twee graden Celsius en 3.000 rpm.
Gebruik vervolgens de Bravo om een 500 femtomol per microliter Ang-1 NAT standaardoplossing serieel te verdunnen om zes kalibratoroplossingen met kippeneiwitalbumine te bereiden. Na centrifugatie, pipet 200 microliter van elke kalibrator naar een put en 125 microliter van de generatiebuffer naar de monsterplaat. Gebruik een geautomatiseerd systeem voor vloeistofhantering om 125 microliter plasma-supernatant of 125 microliter van de kippeneiwitalbumineoplossing te mengen met 25 microliter angiotensine I generatiebuffer in een nieuwe 1,1 milliliter diepe putjesplaat.
Breng nu automatisch de oplossingen over naar een 96-wellsplaat met drie replica's per oplossing en 34 microliter oplossing per put. Bewaar vervolgens de plaat gedurende drie uur bij 37 graden Celsius. Voor de conjugatie van het antilichaam met proteïne G kralen, breng eerst 78 microliter van eerder bereide kralensuspensie over naar een 1,5 milliliter buis.
Was de kralen zeven keer met één milliliter 25% acetonitril in PBSC en driemaal met één milliliter PBSC, gebruik een magnetische standaard om de kralen tussen elk wassen te pelleteren. Na het wassen van de kralen, schud ze op in 110 microliter PBSC en voeg 110 microliter anti-angiotensine I-antilichaam toe. Meng de kralen en oplossing door te pipetteren.
Breng vervolgens de kralen aan bij kamertemperatuur gedurende één uur terwijl u draait bij acht rpm. Was vervolgens de kralen driemaal met één milliliter PBSC. Breng vervolgens de kralen opnieuw op in 1.100 microliter PBSC.
Breng nu handmatig de kralensuspensie over naar een 96-wellsplaat. Laat de Bravo vervolgens de kralen tot dezelfde 96-wellsplaat doseren. Plaats na de drie uur durende angiotensine I-generatieperiode de incubatieplaat gedurende 10 minuten op ijs om de generatie van angiotensine I te beëindigen. Verdun automatisch een stabiele isotoopstandaard peptide stockoplossing 100-voudig met PBS-buffer.
Doseer vervolgens automatisch de stabiele isotoopstandaard peptide verdunning naar een 96-wells PCR-plaat. Breng 10 microliter van de verdunde peptideoplossing over naar elke put van de incubatieplaat. Meng de verdunde peptideoplossing met de plasmamonsters of de kippeneiwitalbumineoplossing.
Voeg automatisch de monster- of standaardoplossingen toe aan de kralensoplossingen op de incubatieplaat en meng. Na een uur incubatie, was de kralen automatisch drie keer met vijf millimolair ammoniumbicarbonaat oplossing. Gebruik een magneet om de kralen na elke wassing naar de bodem te trekken.
Na de laatste wassing, voeg 10 microliter van de ammoniumbicarbonaat oplossing toe aan elke put om de kralen op te schudden. Breng automatisch zeven microliter van de kralensuspensie over op een MALDI-doelplaat met een spotgrootte van 2.600 micrometer. Zodra de kralen zijn opgedroogd, voeg automatisch twee microliter van eerder bereide HCCA-matrixoplossing uit de matrixput toe aan elke monsterspot op de doelplaat.
Analyseer vervolgens de monsterspotten met een MALDI-TOF-instrument in positieve reflectormodus. Voer interne kalibratie, gegevenssmoothing en basislijnaftrek uit met de leveranciersspecifieke software. De geautomatiseerde iMALDI-procedure voor het meten van angiotensine I maakt hoge doorvoeranalyse van een groot aantal monsters mogelijk met een intradag variatiecoëfficiënt van minder dan 10%. Representatieve spectra verkregen door het meten van angiotensine I in menselijke plasmamonsters worden hier weergegeven.
Correlatie van PRA-waarden van 188 patiëntenmonsters verkregen met de geautomatiseerde iMALDI-test met PRA-waarden verkregen met een klinische LC-MS/MS-procedure wordt hier getoond. De twee methoden hebben een correlatiecoëfficiënt van 0,98, en het verschil tussen de hellingslijnen kan te wijten zijn aan het gebruik van verschillende interne standaarden of verschillende antilichamen. De lineaire bereik van de test en de precisie van de test worden hier weergegeven.
Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in ongeveer vijf uur worden uitgevoerd. Vergeet bij het uitvoeren van deze procedure niet om de tipkop en de snelheid van de vloeistofvloeistof goed af te stellen. Na deze procedure kunnen aanvullende methoden worden gebruikt om primaire aldosteronisme bij patiënten te bevestigen, waaronder orale zoutbelasting of saline infusietests.
De geautomatiseerde iMALDI-techniek maakt de specifieke en nauwkeurige hoge doorvoerkwantitatieve screening van biologische monsters, inclusief patiëntenmonsters, mogelijk voor ziektegerelateerde eiwitten of peptiden. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een geautomatiseerde iMALDI-test uitvoert voor massaspectrometrie-gebaseerde eiwit- en peptidekwantificering. Vergeet niet dat het werken met biologische monsters, zoals menselijk plasma, extreem gevaarlijk is en dat de nodige veiligheidsmaatregelen altijd moeten worden genomen tijdens het
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het kwantificeren van peptiden en intacte eiwitten in complexe biologische vloeistoffen met behulp van geautomatiseerde immuno-MALDI (iMALDI) technologie. De methode is ontworpen om nauwkeurige en gevoelige metingen te leveren, ter ondersteuning van diagnostiek en behandelingsmonitoring.
Belangrijkste Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Proteomics
- Biologische Tests
- Diagnostiek
Achtergrond
- Kwantitatieve proteomics is essentieel voor het begrijpen van eiwitniveaus in verschillende omstandigheden.
- Laag abundantie eiwit- en peptiden biomarkers kunnen uitdagend zijn om te kwantificeren.
- Vroege diagnose van ziekten kan een significante impact hebben op behandelingsuitkomsten.
- Geautomatiseerde technieken verhogen de gevoeligheid en nauwkeurigheid in eiwitkwantificering.
Doel van het Onderzoek
- Om een gevoelige en nauwkeurige methode voor eiwitkwantificering te ontwikkelen.
- Om de diagnose van ziekten in een vroeg stadium te vergemakkelijken.
- Om inzichten te bieden in plasma renine activiteit en kanker-gerelateerde eiwitten.
Gebruikte Methoden
- Geautomatiseerde immuno-MALDI (iMALDI) technologie.
- Immuno-verrijkingsstap voor laag abundantie eiwitten.
- Ontdooien van menselijke plasma monsters voor analyse.
- Kwantificering van eiwitten en peptiden in complexe biologische vloeistoffen.
Belangrijkste Resultaten
- De methode maakt gevoelige kwantificering van eiwitten uit complexe monsters mogelijk.
- Het kan worden toegepast op verschillende ziekte-gerelateerde studies.
- Diagnose in een vroeg stadium wordt vergemakkelijkt door nauwkeurige eiwitmeting.
- Inzichten in behandelingsmonitoring en patiëntrespons kunnen worden verkregen.
Conclusies
- Geautomatiseerde iMALDI technologie is een waardevol hulpmiddel in kwantitatieve proteomics.
- De methode verbetert het vermogen om ziekten vroegtijdig te diagnosticeren.
- Het biedt een raamwerk voor toekomstige studies over eiwitkwantificering.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Automated immuno-MALDI (iMALDI) addresses the critical challenge of quantifying low-abundance peptide and protein biomarkers in complex biofluids, enabling sensitive detection in the ng/mL to pg/mL range required for clinical applications. By integrating immuno-enrichment with MALDI-TOF mass spectrometry and full automation, the method delivers high-throughput, reproducible quantification with intraday CV below 10%, supporting reliable biomarker measurement for diagnostic and therapeutic monitoring workflows. This capability enhances predictive confidence in target validation and assay development for cardiovascular, endocrine, and oncology indications where low-abundance analytes drive clinical decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying low-abundance peptides like angiotensin I in plasma, supporting functional validation of disease-relevant targets.
- Operational Value: Provides specific and accurate measurements from complex samples, reducing false negatives in biomarker detection and improving target confidence.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking through precise correlation with clinical readouts such as plasma renin activity, demonstrated by R=0.98 vs LC-MS/MS.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, mass-specific readouts via MALDI-TOF detection, enabling precise comparison of analyte levels across conditions and samples.
- Operational Value: Streamlines sample preparation through automation on liquid handling systems, improving reproducibility and throughput for large-scale screening campaigns.
- Assay Readiness: Eliminates elution steps, simplifying workflow and reducing hands-on time while maintaining sensitivity for low-abundance analytes in biofluids.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports alignment with clinical biomarkers like plasma renin activity, enabling translation from discovery to preclinical validation using disease-relevant concentration ranges.
- Risk-Adjusted Advancement: Delivers quantitative data with defined precision (CV<10%) and linearity, informing go/no-go decisions in lead optimization and preclinical candidate selection.
- Disease-Relevant System: Applicable to human plasma and other complex fluids, ensuring physiological relevance for cardiovascular, renal, and oncology biomarker studies.
Pipeline & Workflow Integration
The iMALDI method fits within the discovery continuum from early target validation through assay development to translational screening, providing quantitative protein and peptide measurements that inform lead identification and preclinical progression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling sensitive quantification of signaling peptides and protein biomarkers in native biological matrices.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized outputs with high reproducibility, facilitating reliable compound effect measurement in phenotypic or target-based screens.
- Analytics: Generates mass-resolved, quantitative readouts suitable for statistical comparison and correlation with functional or clinical endpoints.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through biomarker alignment, as demonstrated by angiotensin I quantification correlating with plasma renin activity in patient samples.
- Enterprise Reuse: Automated platform design allows reuse across multiple targets by changing antibody-bead conjugates, supporting scalable implementation in core proteomics laboratories.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through sensitive, specific detection of low-abundance analytes in disease-relevant samples.
- Operational Value: Standardization, reproducibility (CV<10%), and scalability via automation, reducing variability and increasing sample throughput.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by providing reliable biomarker data, reducing late-stage biological attrition and improving capital efficiency.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantitative, translationally aligned measurements that reflect target engagement and pathway modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunoassay design, antibody conjugation, and MALDI-TOF operation for successful implementation and troubleshooting.
- Dependent on liquid handling automation, magnetic bead separation systems, and MALDI-TOF instrumentation with reflector mode capability.
- Necessitates standardization across teams for reagent preparation, washing protocols, and matrix application to ensure inter-run consistency.
- Adaptation to new targets requires validation of antibody specificity, bead coupling efficiency, and interference testing in relevant biological matrices.
- Practical limitations include potential ion suppression in complex samples and the need for optimization of washing and elution-free transfer steps for each analyte-matrix pair.
