Name: Peptide en proteïne kwantificering met behulp van geautomatiseerde Immuno-MALDI (iMALDI) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Leer geautomatiseerde iMALDI voor kwantitatieve proteomics en vroege diagnose van ziekten met behulp van menselijk plasma. Deze methode kwantificeert laag abundante eiwitten en peptiden nauwkeurig.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken de financiële steun van het genoom Canada en Brits-Columbia genoom voor operaties (204PRO) en technologische ontwikkeling (214PRO) door middel van het genoom innovaties netwerk (GIN). Wij danken de Drug Discovery Platform aan het Research Institute van de McGill University Health Center voor het gebruik van het instrument van de MALDI-TOF voor filmen. H.L. is dankbaar voor de steun van een postdoctorale fellowship van het National Science en Engineering onderzoek Raad van Canada (NSERC). C.H.B is dankbaar voor de steun van de Leading Edge Endowment Fund (LEEF). C.H.B. is dankbaar voor de steun van de Voorzitter van de McGill Segal in moleculaire oncologie aan de McGill-Universiteit (Montreal, Quebec, Canada). M.X.C. en C.H.B. zijn dankbaar voor steun uit de Warren Y. Soper Charitable Trust en de Alvin Segal Family Foundation het Joodse ziekenhuis (Montreal, Quebec, Canada).

de bedragen van de reagentia die hieronder beschreven zijn gebaseerd op de meting van 20 patiënten plasma monsters. Het protocol hieronder volgt de richtlijnen van de University of Victoria &#39; s ethiek onderzoekscomité.
 1. generatie van Ang ik in menselijk Plasma <ol><li>plasma monsters ontdooien (&#8805; 200 µL) in een kamer temperatuur water bad gedurende 5 minuten, en zet dan de monsters op ijs totdat volledig ontdooid.</li>
	<li>Transfer 200 µL van elk monster plasma handmatig te scheiden van putjes van een 1.1 mL diep-well plaat (monster plaat), centrifugeren van de plaat in een centrifuge gedurende 10 minuten bij 2 ° C en 1278 x g.</li>
	<li>Gebruik maken van een geautomatiseerde vloeibare handling systeem om een 500 fmol/µL Ang I NAT standaardoplossing ter voorbereiding van zes beeldschermkalibratie oplossingen met kip ei wit albumine serieel verdund (0.1, 0.2, 0,6, 1.9, 5,7, 17.2 fmol/µL).</li>
	<li>Pipetteer 200 µL van elke kalibrator voor een goed en 125 µL van generatie buffer aan monster plaat. 
	Opmerking: De CEWA in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) buffer moet vers worden bereid op de dag van het experiment.</li>
	<li>Met behulp van een geautomatiseerde vloeistof handling systeem, in een nieuwe plaat Meng 125 µL van plasma bezinken of 125 µL van CEWA in PBS met 25 µL van Ang ik generatie buffer, waarin Tris, 0,2 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) en 1 mM 1 M phenylmethylsulfonyl-fluoride (PMSF). 
	Opmerking: Bereiden de Ang ik generatie buffer door het mengen van een 1 M Tris/0,2 mM EDTA waterige buffer (pH 5.5 aanpassen met behulp van azijnzuur) en een PMSF-oplossing (100 mM in methanol). Beide oplossingen kunnen worden opgeslagen tot 1 maand bij 4 ° C. Mix de twee oplossingen op de dag van het experiment.</li>
	De oplossingen overbrengen <li>automatisch in een 96-wells-plaat, 3 duplo's per oplossing, 34 µL per putje. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 3 h.</li>
</ol> 2. Immuno-verrijking van Ang ik met behulp van antilichaam beklede kralen <ol><li>vervoeging van antilichaam op magnetische eiwit G kralen Opmerking: vervoeging van het antilichaam met de kralen wordt uitgevoerd handmatig tijdens de 3 h Ang ik generatie periode op de dag van het experiment. Voor andere analyten zou de geconjugeerd kralen kunnen worden opgeslagen in de buffer van de PBS met 0,015% CHAPS (PBSC) bij 4 ° C voor drie maanden of langer, afhankelijk van de eigenschappen en de stabiliteit van het antilichaam.
	<ol><li>Transfer 110 µL van kraal drijfmest (genoeg voor het meten van 20 monsters en het maken van een 6-punts standaard curve) in een 1,5 mL-buis. Wassen van de kralen zevenmaal met 1 mL acetonitril/PBSC van 25%, en drie keer met 1 mL PBSC. Gebruik een magnetische stand aan de parels tussen elke stap wassen pellet. Verwijderen van de was-buffer na de laatste wash. 
		Opmerking: Wassen 7 keer met 25% is acetonitril/PBSC van cruciaal belang voor het verwijderen van de MS-onverenigbaar additieven in de kraal drijfmest, zoals Tween-20. Als er geen dergelijke additieven in de geselecteerde kralen, deze uitgebreide wassen stap niet nodig zou zijn.</li>
		<li>Resuspendeer de kralen in 110 µL van PBSC en voeg 110 µL van anti-Ang ik antilichaam (laatste antilichaam concentratie: 100 µg/mL). Meng de kralen en de oplossing door pipetteren, en ze vervolgens uit te broeden bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, ronddraaiende 8 rpm.</li>
		<li>Wassen van de parels 3 keer met 1 mL van PBSC en resuspendeer in 1100 µL van PBSC. 
		Opmerking: Als een kraal oplossing is gestroomd in het GLB van de buis tijdens de incubatie, spin down de oplossing met behulp van een benchtop centrifuge op 2680 x g.</li>
		<li>Overbrengen in de kraal oplossing handmatig een 96-wells-plaat (standaard grondplaat). Gebruik maken van de geautomatiseerde vloeibare handling systeem aan aliquot de kralen aan de dezelfde 96-wells-plaat, 120 µL per well.</li></ol></li> <li>Immuno-verrijking op de parels <ol><li>nadat de 3U Ang generatie periode, plaats ik de incubatie-plaat op ijs voor 10 min te beëindigen van de generatie van Ang I.</li>
		<li>Automatisch Verdun de SIS-peptide-stockoplossing (10 pmol/l) 100-fold met PBS buffer, en verdere automatisch aliquot de stabiele isoptope standaard peptide verdunning op een 96-Wells PCR bord. Pipetteer 1.5 µL van een stabiele isotoop normen (SIS) peptide oplossing (met 100 fmol) in elk putje van de plaat van de incubatie en meng het met de plasma monsters of de CEWA in PBS buffers.</li>
		<li>Automatisch de inhoud van de incubatie plaat overbrengen naar de kraal oplossing, 10 mL per putje, meng.</li>
		<li>Broeden de plaat bij 4 ° C gedurende 1 h terwijl het draaien bij 8 omwentelingen per minuut.</li>
		<li>Wassen de kralen driemaal automatisch met 5 mM (AmBic) ammoniumbicarbonaatoplossing, 100 µL per putje per wasbeurt. Na de laatste wash, resuspendeer de kralen in 7 µL van 5 mM AmBic oplossing in elk putje. Gebruik een magneet te trekken van de parels aan de bodem na de laatste wash.</li>
	</ol></li></ol> 3. Overdracht van de kralen op een MALDI Target plaat en Matrix-oplossing toe te voegen <ol><li>Transfer 7 µL van de kraal drijfmest automatisch op een MALDI doel bord met een plek grootte van 2.600 µm. Laat de kralen uitdrogen. 
	Opmerking: Een kleine USB-aangedreven ventilator kan worden gebruikt voor het versnellen van de kraal drogen proces.</li>
	<li>Automatisch toevoegen 2 µL van α-cyano-4-hydroxycinnamic zuur (HCCA)-matrix oplossing (met 3 mg/mL HCCA, 1.8 mg/mL ammoniumcitraat, acetonitril van 70% en 0,1% trifluorazijnzuur) uit de matrix goed op elk monster plek op de doel-plaat .</li>
</ol> 4. Signaal overname door een MALDI-TOF-MS en Data-analyse <ol><li>analyseren het monster spots met een MALDI-TOF-instrument gebruik positieve reflector-modus. Uitvoeren van interne kalibratie gegevens vloeiend maken en aftrekken van de basislijn automatisch met leverancier-specifieke software. 
	Opmerking: De modus (positief/negatief, lineaire/reflector) geselecteerd voor MALDI-TOF meting is afhankelijk van de doelgroep peptiden of eiwitten.</li>
	<li>De relatieve respons verhouding (Nat/SIS intensiteit ratio) te berekenen en te vergelijken met de standaard curve te bepalen van de Ang ik concentratie in elk monster. Berekenen van PRA met behulp van vergelijking (1), waar Δt Ang ik generatie vertegenwoordigt de gebruikte tijd voor de generatie van Ang I. 
	PRA = [Ang ik] / Δt Ang ik generatie (1)</li></ol>

<ol><li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).</li>
<li>Nicol, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+an+Immunoaffinity-Mass+Spectrometry-based+Approach+for+the+Quantification+of+Protein+Biomarkers+from+Serum+Samples+of+Lung+Cancer+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+%26+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Use of an Immunoaffinity-Mass Spectrometry-based Approach for the Quantification of Protein Biomarkers from Serum Samples of Lung Cancer Patients.</a> Mol. & Cell. Proteomics. 7 (10), 1974-1982 (2008).</li>
<li>Webster, J., Oxley, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWebster%2C+J+%22Chemical+Genomics+and+Proteomics%3A+Reviews+and+Protocols%22">Chemical Genomics and Proteomics: Reviews and Protocols</a>. Zanders, E. D. , Humana Press. 227-240 (2012).</li>
<li>Yergey, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+sequencing+of+peptides+using+MALDI%2FTOF-TOF%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">De novo sequencing of peptides using MALDI/TOF-TOF.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 13 (7), 784-791 (2002).</li>
<li>Anderson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six+decades+searching+for+meaning+in+the+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Six decades searching for meaning in the proteome.</a> J. Proteomics. 107, 24-30 (2014).</li>
<li>Landegren, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+for+Sensitive+Plasma+Proteome+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Opportunities for Sensitive Plasma Proteome Analysis.</a> Anal. Chem. 84 (4), 1824-1830 (2012).</li>
<li>Guo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+Enrichment+and+Mass+Spectrometry+Analysis+of+Protein+Methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+%26+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity Enrichment and Mass Spectrometry Analysis of Protein Methylation.</a> Mol. & Cell. Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).</li>
<li>Florentinus-Mefailoski, A., Soosaipillai, A., Dufresne, J., Diamandis, E. P., Marshall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-linked+immuno-mass+spectrometric+assay+with+the+substrate+adenosine+monophosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">An enzyme-linked immuno-mass spectrometric assay with the substrate adenosine monophosphate.</a> Anal. Bioanal. Chem. 407 (4), 1119-1130 (2015).</li>
<li>Fredolini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocapture+strategies+in+translational+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Immunocapture strategies in translational proteomics.</a> Expert Rev Proteomics. 13 (1), 83-98 (2016).</li>
<li>Tran, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Affinity+Capture+and+On-Tip+Digestion+to+Accurately+Quantitate+in+Vivo+Deamidation+of+Therapeutic+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Automated Affinity Capture and On-Tip Digestion to Accurately Quantitate in Vivo Deamidation of Therapeutic Antibodies.</a> Anal. Chem. , (2016).</li>
<li>Razavi, M., Leigh Anderson, N., Pope, M. E., Yip, R., Pearson, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+precision+quantification+of+human+plasma+proteins+using+the+automated+SISCAPA+Immuno-MS+workflow%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High precision quantification of human plasma proteins using the automated SISCAPA Immuno-MS workflow.</a> N. Biotechnol. 33 (5 Part A), 494-502 (2016).</li>
<li>Razavi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+SISCAPA+Quantitation+of+Peptides+from+Human+Plasma+Digests+by+Ultrafast%2C+Liquid+Chromatography-Free+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">High-Throughput SISCAPA Quantitation of Peptides from Human Plasma Digests by Ultrafast, Liquid Chromatography-Free Mass Spectrometry.</a> J. Proteome Res. 11 (12), 5642-5649 (2012).</li>
<li>Anderson, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SISCAPA+Peptide+Enrichment+on+Magnetic+Beads+Using+an+In-line+Bead+Trap+Device%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+%26+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">SISCAPA Peptide Enrichment on Magnetic Beads Using an In-line Bead Trap Device.</a> Mol. & Cell. Proteomics. 8 (5), 995-1005 (2009).</li>
<li>Parker, C. E., Pearson, T. W., Anderson, N. L., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometry-based+clinical+proteomics+-+a+review+and+prospective%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometry-based clinical proteomics - a review and prospective.</a> The Analyst. 135 (8), 1830-1838 (2010).</li>
<li>Reid, J. D., Holmes, D. T., Mason, D. R., Shah, B., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+Development+of+an+Immuno+MALDI+%28iMALDI%29+Mass+Spectrometry+Assay+for+the+Diagnosis+of+Hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Towards the Development of an Immuno MALDI (iMALDI) Mass Spectrometry Assay for the Diagnosis of Hypertension.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21 (10), 1680-1686 (2010).</li>
<li>Mason, D. R., Reid, J. D., Camenzind, A. G., Holmes, D. T., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplexed+iMALDI+for+the+detection+of+angiotensin+I+and+angiotensin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Duplexed iMALDI for the detection of angiotensin I and angiotensin II.</a> Methods. 56 (2), 213-222 (2012).</li>
<li>Camenzind, A. G., vander Gugten, J. G., Popp, R., Holmes, D. T., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+an+immuno-MALDI+%28iMALDI%29+assay+for+angiotensin+I+and+the+diagnosis+of+secondary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of an immuno-MALDI (iMALDI) assay for angiotensin I and the diagnosis of secondary hypertension.</a> Clin. Proteomics. 10 (1), 20(2013).</li>
<li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+immuno+tandem+mass+spectrometry+%28iMALDI%29+assay+for+EGFR+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">Development of an immuno tandem mass spectrometry (iMALDI) assay for EGFR diagnosis.</a> Proteomics Clin Appl. 1, (2007).</li>
<li>Jiang, J., Parker, C. E., Fuller, J. R., Kawula, T. H., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Immunoaffinity+Tandem+Mass+Spectrometry+%28iMALDI%29+assay+for+Detection+of+Francisella+tularensis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+chimica+acta%22%5BJournal%5D)">An Immunoaffinity Tandem Mass Spectrometry (iMALDI) assay for Detection of Francisella tularensis.</a> Analytica chimica acta. 605 (1), 70-79 (2007).</li>
<li>Popp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+assay+for+the+clinical+measurement+of+plasma+renin+activity+by+immuno-MALDI+%28iMALDI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">An automated assay for the clinical measurement of plasma renin activity by immuno-MALDI (iMALDI).</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1854 (6), 547-558 (2015).</li>
<li>Schoenherr, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+screening+of+monoclonal+antibodies+for+SISCAPA+assays+using+a+magnetic+bead+processor+and+liquid+chromatography-selected+reaction+monitoring-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated screening of monoclonal antibodies for SISCAPA assays using a magnetic bead processor and liquid chromatography-selected reaction monitoring-mass spectrometry.</a> J Immunol Methods. 353 (1-2), 49-61 (2010).</li>
<li>Borchers, C. H. Methods of quantitation and identification of peptides and proteins. US patent. , US 7846748 B2 (2010).</li>
<li>Borchers, C. H. Methods of quantitation and identification of peptides and proteins. Canadian patent CA. , CA 2507864 C (2011).</li>
<li>Weiß, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+and+measure-mass+spectrometry-based+immunoassays+in+biomarker+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Catch and measure-mass spectrometry-based immunoassays in biomarker research.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844 (5), 927-932 (2014).</li>
<li>Nelson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+fragments%3A+Hope+and+hype%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">Antibody fragments: Hope and hype.</a> mAbs. 2 (1), 77-83 (2010).</li>
<li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+an+aptamer+for+use+as+an+affinity+reagent+with+MS%3A+PCSK9+as+an+example+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">An evaluation of an aptamer for use as an affinity reagent with MS: PCSK9 as an example protein.</a> Bioanalysis. 8 (15), 1557-1564 (2016).</li>
</ol>

C.H.B heeft het patent op de iMALDI-technologie.

Vergeleken met conventionele op basis van MS eiwit kwantificering, iMALDI maakt gebruik van antilichamen te verrijken de analyten en hen te zuiveren van complexe monsters, dus waardoor het mogelijk is te kwantificeren van proteïnen of peptiden in lage concentraties. Een cruciale stap in het iMALDI-protocol is de immuno-verrijking van de doel-peptiden. Voor dit doel, moeten antilichamen met hoge specificiteit en affiniteit worden geselecteerd. In SISCAPA, werd er gemeld dat antilichaam affiniteiten op 10-9 M of...

Massaspectrometrie uitgegroeid tot een onmisbaar instrument in kwantitatieve proteomics. Massaspectrometrie kan bepalen de massa's van doel proteïnen of peptiden, dus de verkregen analyt signalen kunnen zeer specifiek t.o.v. immunoassay. Twee methoden van de behandeling door ionisering, electrospray en MALDI, worden meestal gebruikt voor het opsporen van de eiwitten en peptiden1,2,3,4. Een grote uitdaging in op basis van MS eiwit kwantificering ligt in het opsporen van lage-overvloed eiwitten in complexe monsters in ng/mL of pg/mL concentraties in de aanwezigheid van eiwitten van hoge-overvloed, en vele kandidaat-proteïne biomarkers gevonden in menselijk plasma zijn binnen dit bereik5. Dit probleem wordt grotendeels veroorzaakt door de inherent breed dynamisch bereik en de complexiteit van het menselijk proteoom-6.
Om te overwinnen van de uitdagingen van deze detectie, immuno-MS-methoden zijn ontwikkeld om te verrijken de doelgroep proteïnen of peptides van de monsteroplossingen op een effen oppervlak, gevolgd door elutie van de analyten en MS meting7,8 , 9 , 10. door immuno-verrijking, de analyten zijn gezuiverd van complexe monsters en daarom de effecten van de ion-onderdrukking van andere moleculen zijn geminimaliseerd. Onder verschillende solide ondersteunt, zijn magnetische kralen momenteel meest gebruikte zoals ze de voordelen van hoge antilichaam bindingscapaciteit en gebruiksgemak hebben. Magnetische kralen met verschillende functionalizations en maten zijn ontwikkeld en gecommercialiseerd voor immunoprecipitation experimenten. Tot op heden heeft immuno-verrijking op parels is geïnterfacet met electrospray ionisatie (ESI) én MALDI-MS voor eiwit en peptide meting. In stabiele isotoop normen en vangen door anti-peptide antilichamen (SISCAPA) technologie, zijn eiwitten in de monsters verteerd, gevolgd door incubatie met antilichaam-gecoate kralen voor immuno-verrijking. In "klassieke" SISCAPA, zijn de vastgelegde proteotypic peptiden geëlueerd van de kralen en gemeten door vloeibare chromatografie-ESI-MS (LC-MS), of door rechtstreekse infusie ESI-meerdere reactie Monitoring-MS (ESI-MRM-MS)11,12. Immuno-verrijking verbeterd de MRM assay gevoeligheid door 3-4 ordes van grootte, de lage ng/mL bereik13te bereiken.
Vergeleken met electrospray-MS, MALDI-MS is sneller, en gaat niet over het reinigen en opnieuw evenwichtsinstelling van LC-kolommen dus er zijn geen problemen met overdracht en verontreiniging, waardoor het meer geschikt voor high-throughput onderzoek14. Immuno-MALDI technologie is ontwikkeld in ons laboratorium immuno-verrijking combineren met MALDI-MS voor gevoelige en specifieke kwantificering van peptides en proteïnen (gebaseerd op de kwantificatie van proteotypic peptiden)15,16 ,17. Na immuno-verrijking, de kralen worden gestort op een MALDI doel plaat, de oplossing van de matrix is toegevoegd aan de kralen en de plaat is klaar voor analyse door een MALDI-TOF-MS na het drogen. Elutie van de peptides van de kralen wordt niet uitgevoerd als een afzonderlijke stap, maar affiniteit-gebonden analyten worden geëlueerd door de MALDI matrix oplossing wanneer het wordt toegevoegd aan de parel vlekken, daardoor vereenvoudiging van de bereiding van de monsters en het minimaliseren van monster verlies. De iMALDI-technologie is toegepast in een verscheidenheid van toepassingen18,19, en onlangs is geautomatiseerd en gebruikt voor het meten van angiotensine I (Ang ik) voor het bepalen van de plasma renine activiteit (PRA)20. Dit protocol zal de procedure gebruikt voor het uitvoeren van een geautomatiseerde iMALDI assay aantonen. De PRA test nemen als voorbeeld, Inter dag CVs van minder dan 10% hebben bereikt door middel van automatisering, met de mogelijkheid voor het meten van 744 monsters per dag20.
De iMALDI PRA assay aangetoond in dit manuscript vereist geen eiwit spijsvertering, als de doelmolecule (Ang ik) is een peptide met een moleculair gewicht van 1295.7 Da. In andere testen waar eiwit spijsvertering noodzakelijk is en een peptide wordt gebruikt als de surrogaat voor het intact eiwit, dient de geselecteerde peptide voor iMALDI uniek en specifiek voor de proteïne van de doelstelling, met een massa van meer dan 800 Da dus dat zij gemakkelijk kan worden onderscheiden van de c chemische lawaai van de MALDI matrix oplossing. Anti-peptide antilichamen zijn nodig voor de immuno-verrijking van de peptiden. Het protocol voor een bepaling van de iMALDI meten van PRA bestaat uit vier stappen: 1) generatie van Ang ik in menselijk plasma; 2) immuno-verrijking van Ang mij using antilichaam beklede kralen; 3) overdracht van parels aan een MALDI doel plaat en toevoegen matrix oplossing; en 4) signaal overname door een MALDI-TOF-MS en data analyse-20.

<table><tbody><tr><td>Healthy control human plasma</td><td>Bioreclamation</td><td>HMPLEDTA2</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium citrate dibasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>09833</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS (>=98%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9426</td><td></td></tr><tr><td>Albumin from chicken egg white (>98%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70990</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85172</td><td>LC-MS grade</td></tr><tr><td>acetonitrile</td><td>Fluka</td><td>34967</td><td>LC-MS grade</td></tr><tr><td>water</td><td>Fluka</td><td>39253</td><td>LC-MS grade</td></tr><tr><td>acetic acid</td><td>Fluka</td><td>320099</td><td>LC-MS grade</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td><td>Roche Diagnostics</td><td>3118169001</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G magnetic beads</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td>2.8 &mu;m, 30 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-Ang I goat polyclonal antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7419</td><td></td></tr><tr><td>Nat and SIS Ang I</td><td>synthesized at the University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automated liquid handling system</td><td>Agilent</td><td>16050-102</td><td>Agilent Bravo robotic workstation</td></tr><tr><td>Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td>Invitrogen DynaMag-2 magnet</td></tr><tr><td>Tube rotator</td><td>Theromo Scientific</td><td>400110Q</td><td>Labquake Tube Rotator</td></tr><tr><td>Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12027</td><td>DynaMag-96 side skirted magnet</td></tr><tr><td>Magnet</td><td>VP Scientific</td><td>771RM-1</td><td>used to pull the beads to the bottom of the well</td></tr><tr><td>MALDI-TOF</td><td>Bruker</td><td></td><td>Bruker Microflex LRF instrument</td></tr></tbody></table>

peptide en proteïne kwantificering met behulp van geautomatiseerde immuno-maldi (imaldi)

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI (iMALDI)

De Spectrometrie van de massa (MS) is één van de meest gebruikte technologieën voor het kwantificeren van de eiwitten in complexe monsters, met uitstekende assay specificiteit als gevolg van de directe detectie van de verhouding van de massa-naar-charge van elke doelmolecule. Echter, op basis van MS proteomics, net als de meeste andere analytische technieken, heeft een voorkeur voor het meten van hoge-overvloed analyten, dus het is uitdagend om detectie beperkt voor lage ng/mL of pg/mL in complexe monsters, en dit is het concentratiebereik voor velen ziekte-relevante eiwitten in biofluids zoals menselijk plasma. Om te helpen bij de opsporing van lage-overvloed analyten, is immuno-verrijking geïntegreerd in de bepaling te concentreren en te zuiveren van de analyt voor MS meting, aanzienlijke verbetering van de gevoeligheid van de test. In dit werk, is de immuno - Matrix-Assisted Laser desorptie/ionisatie (iMALDI) technologie gepresenteerd voor de kwantificering van de eiwitten en peptiden in biofluids, op basis van immuno-verrijking op parels, gevolgd door meting van de MALDI-MS zonder voorafgaande elutie. De anti-peptide antilichamen zijn matiemaatschappij op magnetische kralen en geïncubeerd met monsters. Na het wassen, de kralen zijn rechtstreeks overgezet naar een MALDI doel plaat, en de signalen door een MALDI-Time van de vlucht (MALDI-TOF) instrument worden gemeten nadat de matrix-oplossing is vereffend met de kralen. De voorbereiding van de voorbeeldprocedure wordt vereenvoudigd ten opzichte van andere immuno-MS testen, en de MALDI-meting is snel. De hele monsterverwerking is geautomatiseerd met een vloeistof handling systeem, met verbeterde assay reproduceerbaarheid en een snellere doorgifte. In dit artikel, de bepaling van de iMALDI wordt gebruikt voor het bepalen van het peptide angiotensine I (Ang ik) concentratie in plasma, dat klinisch als uitlezing van plasma renine activiteit wordt gebruikt voor de screening van primaire aldosteronisme (PA).

Een geautomatiseerde iMALDI procedure voor het meten van Ang ik is afgebeeld in Figuur 1. Doel peptiden (endogene peptiden of peptiden uit verteerd eiwit) zijn verrijkt op anti-peptide magnetische kralen, en vervolgens de kralen zijn overgebracht naar een doel-plaat voor MALDI meting. De hele procedure is vereenvoudigd ten opzichte van andere immuno-MS technologieën waarvoor extra peptide elutie stappen. Automatisering van de bepaling van de iMALDI zorgt voor...

Een protocol voor de kwantificering van de eiwitten in complexe biologische vloeistoffen met behulp van geautomatiseerde immuno-MALDI (iMALDI) technologie wordt gepresenteerd.

Peptide en proteïne kwantificering met behulp van geautomatiseerde Immuno-MALDI (iMALDI)

Mass spectrometry (MS) is one of the most commonly used technologies for quantifying proteins in complex samples, with excellent assay specificity as a ...

Het algemene doel van deze geautomatiseerde immuno-MALDI-assay is om peptiden en intacte eiwitten in complexe biologische vloeistoffen op een nauwkeurige en gevoelige manier te kwantificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de kwantitatieve proteomics, zoals het kwantificeren van eiwitniveaus voor diagnostiek of voor het monitoren van de respons van een patiënt op een behandeling. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat eiwitniveaus zeer gevoelig en nauwkeurig uit complexe monsters kunnen worden gekwantificeerd.Deze techniek maakt de diagnose van ziekten in een vroeg stadium mogelijk, omdat de immuno-verrijkingsstap van de analyse de kwantificering van eiwit- en peptidebiomarkers met een lage abundantie mogelijk maakt. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de plasma-renineactiviteit, kan deze ook worden toegepast op andere ziektegerelateerde studies, zoals de kwantificering van kankergerelateerde eiwitten voor prognose, diagnose en behandelbeheer. Om deze procedure te starten, ontdooi humaan plasmaproefmateriaal gedurende vijf minuten in een waterbad op kamertemperatuur.Plaats de monsters vervolgens op ijs tot ze volledig ontdooid zijn. Draag daarna handmatig 200 µL van elk plasmamonster over naar afzonderlijke putjes van een deep well plate van 1,1 mL. Centrifugeer de plaat gedurende 10 minuten bij 2 °C en 3.000 rpm.Gebruik vervolgens de Bravo om een Ang-1 NAT-standaardoplossing van 500 femtomole per microliter serieel te verdunnen om zes kalibratoroplossingen te bereiden met kippeneiwitalbuminen. Pipetteer na centrifugatie 200 microliters van elke kalibrator in een putje en 125 microliters generatiebuffer in de monsterplaat. Meng met behulp van een geautomatiseerd vloeistofbehandelingssysteem 125 microliters plasmasupernatant of 125 microliters van de kippeneiwitalbuminenoplossing met 25 microliters angiotensin I-generatiebuffer in een nieuwe 1,1 milliliter deep well plate.Breng nu de oplossingen automatisch over naar een 96-wells plaat met drie replica's per oplossing en 34 µL oplossing per well. Incubeer de plaat vervolgens drie uur lang bij 37 °C. Voor de conjugatie van het antilichaam met proteïne G-beads wordt eerst 78 µL van de eerder bereide bead-suspensie overgebracht naar een 1,5 mL buisje.Was de beads zeven keer met één milliliter 25% acetonitril in PBSC en drie keer met één milliliter PBSC, waarbij een magnetische standaard wordt gebruikt om de beads tussen elke wasbeurt te pelletteren. Resuspendeer de beads na het wassen in 110 microliters PBSC en voeg 110 microliters anti-angiotensine I-antilichaam toe. Meng de beads en de oplossing door te pipetteren.Incubeer de beads vervolgens één uur bij kamertemperatuur terwijl ze met acht rpm worden geroteerd. Was de beads daarna drie keer met één milliliter PBSC. Resuspendeer de beads vervolgens in 1.100 microliters PBSC.Breng nu de bolletjesoplossing handmatig over naar een 96-wells plaat. Laat vervolgens de Bravo de bolletjes in dezelfde 96-wells plaat aliquoteren. Plaats de incubatieplaat na de generatieperiode van drie uur voor angiotensin I gedurende 10 minuten op ijs om de generatie van angiotensin I te beëindigen. Verdun automatisch een stockoplossing van een stabiel isotoopstandaardpeptide 100-voudig met PBS-buffer. Verdeel vervolgens de verdunning van het stabiele isotoop standaardpeptide automatisch over een 96-well PCR-plaat. Breng 10 µL van de verdunde peptidesolutie over naar elke well van de incubatieplaat. Meng de verdunde peptidesolutie met de plasmaproeven of de kippenei-albuminesolutie.Voeg de monster- of standaardoplossingen automatisch toe aan de bead-oplossingen in de incubatieplaat en meng deze. Na een incubatie van één uur worden de beads automatisch drie keer gewassen met een vijf millimol ammoniumbicarbonaatoplossing. Gebruik na elke wasbeurt een magneet om de beads naar de bodem te trekken.Voeg na de laatste wasbeurt 10 µL van de ammoniumbicarbonaatoplossing toe aan elke put om de beads opnieuw te suspenderen. Breng automatisch zeven µL van de beadsuspensie over naar een MALDI-targetplaat met een spotgrootte van 2.600 µm. Zodra de beads zijn opgedroogd, voegt u automatisch twee µL van de eerder bereide HCCA-matrixoplossing vanuit de matrixput toe aan elke monsterspot op de targetplaat.Analyse vervolgens de monsterplekken met een MALDI-TOF-instrument in de positieve reflector-modus. Voer interne kalibratie, dataglatting en basislijncorrectie uit met de softwarespecifieke software van de leverancier. De geautomatiseerde iMALDI-procedure voor het meten van angiotensine I maakt high-throughput analyse van een groot aantal monsters mogelijk met een intra-dag variatiecoëfficiënt van minder dan 10%Representatieve spectra verkregen door het meten van angiotensine I in menselijke plasmamonsters worden hier weergegeven.Hier wordt de correlatie weergegeven tussen de PRA-waarden van 188 patiëntmonsters verkregen met de geautomatiseerde iMALDI-assay en de PRA-waarden verkregen via een klinische LC-MS/MS-procedure. De twee methoden hebben een correlatiecoëfficiënt van 0,98; het verschil tussen de hellingen kan worden toegeschreven aan het gebruik van verschillende interne standaarden of verschillende antilichamen. Het lineaire bereik van de assay en de precisie van de assay worden hier getoond.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in ongeveer vijf uur worden uitgevoerd. Denk er bij het uitvoeren van deze procedure aan om de tipkop en de snelheid van de vloeistofverplaatsing correct aan te passen. Na deze procedure kunnen aanvullende methoden worden gebruikt om primair aldosteronisme bij patiënten te bevestigen, waaronder orale zoutbelasting of zoutoplossingsinfusietesten.De geautomatiseerde iMALDI-techniek maakt specifieke en nauwkeurige high-throughput kwantitatieve screening van biologische monsters, waaronder patiëntenmonsters, mogelijk voor ziekte-gerelateerde eiwitten of peptiden. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een geautomatiseerde iMALDI-assay uitvoert voor eiwit- en peptidekwantificering op basis van massaspectrometrie. Vergeet niet dat het werken met biologische monsters, zoals menselijk plasma, uiterst risicovol is en dat er altijd de nodige veiligheidsvoorzorgsmaatregelen moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van de procedure.

peptide-and-protein-quantification-using-automated-immuno-maldi-imaldi

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Stabiele Isotopen Normen en Capture door Anti-peptide antilichamen (SISCAPA) paren affiniteit verrijking van peptiden met stabiele isotoop verdunning massaspectrometrie (MRM-MS) voor kwantitatieve meting van peptiden te bieden als surrogaat voor hun respectievelijke eiwitten. Hier beschrijven we het protocol met behulp van magnetische deeltjes in een deels geautomatiseerde formaat.

Kwantificering van eiwitten met behulp van immuno-peptide Verrijking gekoppeld aan massaspectrometrie

Wij ontwikkelden een technologie op basis van silica mesoporeuze dunne film voor het selectief herstel van laagmoleculaire peptiden en eiwitten van humaan serum. De fysisch-chemische eigenschappen van onze mesoporeuze chips zijn volledig afgestemd op grote controle in peptide verrijking 'en derhalve profiel van de serum proteoom voor diagnostische doeleinden.

Laag moleculair gewicht eiwitverrijking op mesoporeuze silica dunne films voor de ontdekking van biomarkers

Stabiele isotoop labeling van peptiden door reductieve dimethylering (Redi etikettering) is een snelle, goedkope strategie voor nauwkeurige massa-spectrometrie gebaseerde kwantitatieve proteomics. Hier laten we een robuuste werkwijze voor de bereiding en analyse van eiwitmengsels met de Redi aanpak die kan worden toegepast op vrijwel elk type monster.

Kwantitatieve Proteomics behulp Reductieve dimethylering voor stabiele isotopen Labeling

Dit protocol beschrijft hoe absolute kwantificeringsanalyses van doeleiwitten binnen complexe biologische monsters kunnen worden uitgevoerd met behulp van geselecteerde reactiebewaking. Het werd gebruikt om eiwitten van de muis macrofaag chemotaxis signaleringsroute nauwkeurig te kwantificeren. Selectie van doelpeptiden, ontwikkeling van analyses en kwalitatieve en kwantitatieve analyses worden in detail beschreven.

Geselecteerde Reaction Monitoring Massaspectrometrie voor Absolute Protein kwantificering

Hier beschrijven we een chromatografische test in combinatie met de ion mobiliteit scheiding van peptide precursoren gevolgd door de hoge resolutie (~ 30.000) MS-detectie van peptide fragmenten voor de kwantificering van puntige peptide normen in een monoclonal antilichaam Digest.

Een HS-MRM Assay voor de kwantificering van de gastheercel eiwitten in Protein biofarmaceutica door vloeistofchromatografie Ion mobiliteit QTOF massaspectrometrie

We beschrijven het gebruik van kwantitatieve immunoblotting te valideren immunofluorescentie histologie beeldanalyse wordt gekoppeld als een middel voor het kwantificeren van een proteïne van belang in formaline-vaste, paraffine-ingebedde weefselsteekproeven van (FFPE). Onze resultaten tonen aan dat het nut van immunofluorescentie histologie voor het vaststellen van de relatieve hoeveelheid biomerker eiwitten in routine biopsie monsters.

Kwantitatieve Immunoblotting van cellijnen als een standaard voor het valideren van de immunofluorescentietest voor het kwantificeren van Biomarker eiwitten in Routine weefselsteekproeven

We presenteren een methode voor de zuivering, detectie en identificatie van diGly peptiden die afkomstig zijn van ubiquitinated eiwitten uit complexe biologische monsters. De gepresenteerde methode is reproduceerbaar, robuust en presteert beter dan gepubliceerde methoden met betrekking tot het diepteniveau van de ubiquitinomenanalyse.

Detectie van eiwitubiquitinatiesites door peptideverrijking en massaspectrometrie

Deze workflow beschrijft de prestaties van tijd- en kostenefficiënte verrijking van meerdere eiwitposttranslationele modificaties (PTM's) tegelijkertijd voor kwantitatieve wereldwijde proteomische analyse. Het protocol maakt gebruik van peptide-niveau PTM verrijking met meerdere geconjugeerde antilichamen, gevolgd door data-onafhankelijke acquisitie massaspectrometrie analyse om biologische inzichten te krijgen in PTM crosstalk.

Gelijktijdige affiniteitsverrijking van twee posttranslationele wijzigingen voor kwantificering en sitelokalisatie

Gecombineerde precursor isotopic etikettering en isobaric tagging (cPILOT) is een verbeterde monster multiplexing strategie die in staat is het verhogen van het aantal monsters die gelijktijdig kunnen worden geanalyseerd met de beschikbare isobaric tags. De integratie van een robotplatform heeft de experimentele doorvoer, reproduceerbaarheid en kwantitatieve nauwkeurigheid sterk verhoogd.

Geautomatiseerde voorbeeldbixing met behulp van gecombineerde precursor-isotopenlabeling en isobaric tagging (cPILOT)

Hier presenteren we een protocol voor de zuivering van MHC klasse I en klasse II peptidecomplexen uit muis- en menselijke cellijnen die hoogwaardige immunopeptidomics-gegevens leveren. Het protocol richt zich op monstervoorbereiding met behulp van in de handel verkrijgbare antilichamen.

Immunopeptidomics: isolatie van muis en humane MHC klasse I- en II-geassocieerde peptiden voor massaspectrometrie-analyse

Hier beschrijven we een proteomics workflow voor de karakterisering van het celoppervlakteproteoom van verschillende celtypen. Deze workflow omvat verrijking van celoppervlakte-eiwitten, daaropvolgende monstervoorbereiding, analyse met behulp van een LC-MS/MS-platform en gegevensverwerking met gespecialiseerde software.

"Celoppervlakvangst"-werkstroom voor labelvrije kwantificering van het celoppervlak-proteoom

Leer geautomatiseerde iMALDI voor kwantitatieve proteomics en vroege diagnose van ziekten met behulp van menselijk plasma. Deze methode kwantificeert laag abundante eiwitten en peptiden nauwkeurig.

Peptide en proteïne kwantificering met behulp van geautomatiseerde Immuno-MALDI (iMALDI)

Meer video's verkennen