Name: Biomoleculaire DSC profielen met Thermolabile liganden te karakteriseren snel vouwen en inbinden van interacties te meten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Leer hoe je biomoleculaire vouwen en bindingsinteracties karakteriseert met differentiële scanningscalorimetrie en thermolabiele liganden. Deze methode versnelt thermodynamische analyses voor biocalorimetrie en medicijnontwerp.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

R. W. H. V werd gesteund door het McGill Natural Sciences and Engineering Research Raad van Canada (NSERC) Training Program in Bionanomachines. A. K. M. en P. E. J. werden ondersteund door NSERC subsidies 327028-09 (A. K. M) en 238562 (P. E. J.).

1. de monstervoorbereiding
<ol><li>Zuiveren de gewenste Biomolecuul13. Opmerking: Dit protocol gebruikt gekocht cocaïne-bindende DNA aptamer MN4 na uitwisselen tegen 2 M NaCl driemaal gevolgd door drie rondes van gedeïoniseerd water met behulp van een centrifugaal filter met een 3 kDa molecuulgewicht cut-off membraan.</li>
	<li>Synthetiseren en zuiveren, of koop het gewenste thermolabile ligand-13. Opmerking: MN4 bindt de thermolabile ligand cocaïne. MN4 bindt ook kinine, die wordt gebruikt als een negatieve controle voor ligand thermolability bij deze experimentele temperaturen.</li>
	<li>Buffers voorbereiden door dialyse van de gezuiverde Biomolecuul en ontbinding van liganden (20 mM natriumfosfaat en 140 mM NaCl buffer, pH 7.4, voor MN4 en de liganden gebruikt hier).</li>
	<li>Dialyze de Biomolecuul tegen ten minste 2 liter voor buffer met behulp van dialyse buis met 0,5 - 1,0 kDa cut-off.</li>
	<li>Filtreer de definitieve buffer (hierna: werkende buffer) door een 0,2 µm filter dat grondig heeft zijn geëquilibreerd met buffer.</li>
	<li>Weeg de gewenste massa's van de liganden en los ze op in gefilterde werkende buffer. Als de gewenste ligand concentraties massa's die te klein vereist zijn om nauwkeurig wegen, maken een geconcentreerde ligand-stockoplossing (10 x bijvoorbeeld). Opmerking: Het is van cruciaal belang dat alle DSC experimenten de zelfde werkende buffer voor het monster gebruiken en ligand, dat wil zeggen, nooit uit te voeren een experiment waar de ligand wordt opgelost in een andere partij van werkende buffer dan de Biomolecuul omdat dit zal leiden tot de buffer mismatch artefacten in de gegevens.</li>
	<li>Filtreer de stockoplossing Biomolecuul door een 0,2 µm filter dat grondig heeft zijn geëquilibreerd met werkende buffer.</li>
	<li>Bepaal de concentratie Biomolecuul extinctie metingen (260 nm voor nucleic zuren zoals MN4 en 280 nm voor eiwitten).</li>
	<li>Opslaan van de bereid Biomolecuul en ligand in de koelkast 4 ° C (geschikt voor MN4 en de liganden gebruikt hier), of bij -20 of -80 ° C als de Biomolecuul en liganden bevriezing en lange termijn opslag tolereren vereist is. Degas de buffer en Biomolecuul ligand oplossingen in een tafelblad Ontgasser (Zie Tabel van materialen) vóór het laden in de DSC. Opmerking: Ontgassing helpt te voorkomen dat de zeepbel vorming in de DSC bij hogere temperaturen. Bubbels veroorzaken signaal artefacten die obscure DSC piek vormen en basislijnen.</li>
</ol>2. DSC voorbereiding
<ol><li>Draai het handvat van de druk van de DSC (Zie Tabel van materialen).</li>
	<li>Siliconen slang uit de werkende buffer uitvoeren en deze koppelen aan de voorste flens (metalen openen) van het referentie-capillair.</li>
	<li>Geen brug maken tussen de referentie- en monster haarvaten door het aansluiten van de achterste referentie-flens aan de voorzijde monster flens.</li>
	<li>Een stuk van silicium buis hechten aan de achterste monster-flens die over in een maatkolf van afval met een vacuüm lijn toegevoegd loopt.</li>
	<li>De vacuüm lijn voor het spoelen van de DSC met 200 mL werkende buffer inschakelen.</li>
	<li>Laad de verwijzing capillair van de DSC met werkende buffer. Ongeveer 3-5 cm secties van silicium buis aan koppelen de verwijzing capillaire flenzen.</li>
	<li>Een 1 mL pipet tip invoegen in de achterste flens Siliconen slang. Tekenen van 0,8 milliliters werkende buffer met een pipet en breng de tip van de pipet met buffer in de voorste referentie flens van silicium buis.</li>
	<li>Druk zachtjes op de zuiger van de pipet naar pass de buffer werken via de voorste Siliconen slang in het capillair verwijzing en tot in de achterste flens aangesloten pipette uiteinde. De plunjer van de Pipet ingedrukt te houden totdat de buffer werkniveau net boven de voorste silicium-tubing bereikt, en laat vervolgens de plunjer van de pipet totdat de buffer werkniveau net boven de achterste silicium-buis bereikt.<ol>
<li>Herhaal langs de werkende buffer om heen en weer te zuiveren van het volume in het capillair referentie van bubbels. Opmerking: Meestal 10 doorgangen van de oplossing heen en weer zijn voldoende om alle bubbels wissen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cap de achterste pipette uiteinde met de duim en voorzichtig optrekken op de achterste pipette uiteinde en front pipet om ze te verwijderen uit de verwijzing flenzen met de Siliconen slang aangesloten.</li>
	<li>Het laden van het monster capillair met werkende buffer zoals in stappen 2.6-2.9. Plaats een zwarte plastic dop op de achterste verwijzing en proef de flenzen, verlaten de voorzijde flenzen aan het licht gebracht.</li>
	<li>Bevestig de druk greep.</li>
	<li>De DSC-software niet openen (Zie Tabel van materialen) en druk uitoefenen van het instrument door te klikken op de rode pijl aan de bovenkant van de interface omhoog zodra de macht lezing gestabiliseerd; de DSC-macht wordt aangegeven in een doos bij de bovenkant van de interface samen met de instrument temperatuur en druk lezing. Opmerking: Monitor de bevoegdheid lezen als de DSC pressurizes. Veranderingen in de kracht van meer dan ~ 10 μW geven luchtbel vorming in de haarvaten, die leiden artefacten in de gegevens tot kan. De oplossingen moeten worden verwijderd en ontgast verdere voordat u verdergaat.</li>
	<li>Equilibreer de DSC met werkende buffer door een voorwaartse en omgekeerde scan uit te voeren. Zorg dat de "Scannen" optie uit te voeren van de DSC in temperatuur scanmodus is geselecteerd in het tabblad "Experimentele methode" aan de linkerzijde van het scherm. Opmerking: Experimentele parameters zijn de temperatuur bereik, scanfrequentie, hoge en lage temperaturen equilibratietijd en aantal scans scannen.<ol>
<li>De inzet van de "Temperatuur Parameters" onder het tabblad "Experimentele methode", klik op de knop voor "Verwarming". Voer 1 en 100 ° C voor de boven- en ondergrenzen experimentele temperaturen, 1 ° C/min. voor de scan rate en 60 s voor de periode van evenwichtsinstelling.</li>
		<li>Klik op de knop "Toevoegen Series" onder het invoerveld voor de periode van evenwichtsinstelling. Geef 2 op in het veld 'Stappen om toe te voegen' in het pop-up venster (voor één verwarming en één koeling scan) en vink het vakje "alternatieve verwarming/koeling". Klik op "OK"; de toegevoegde scans worden weergegeven in het onderste gedeelte van de interface. Controleer of de parameters voor elke scan als zijn gewenste.</li>
		<li>Start het experiment door te klikken op de groene "play" knop aan de bovenkant van de interface. Navigeer naar de gewenste map en een bestandsnaam voor het opslaan van het experiment in het pop-upvenster kunnen invoeren. Het experiment voortgang weergeven door te klikken op het tabblad "Gegevens" rechts van het tabblad "Experimenteren methode".</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. het verzamelen van Thermolabile Ligand DSC Datasets
Opmerking: De minimale procedure bestaat uit vijf experimenten: buffer referentie experimenten met en zonder ligand (gebruikt voor aftrekken van de basislijn, Zie discussie), proeven van experimenten met de gratis Biomolecuul, de ligand-gebonden Biomolecuul, en de ligand-gebonden Biomolecuul met een langere equilibratietijd hoge temperatuur.
<ol><li>Referentie experimenten voor aftrekken van de basislijn van de voorbeeldgegevens worden uitgevoerd. Laden van de DSC met werkende buffer in beide haarvaten en verzamelen van meerdere scans voor voorwaartse en omgekeerde over een passende temperatuurbereik bij 1 ° C min-1 met een bovenste (hoge temperatuur) equilibratietijd van 120 s.<ol>
<li>De vorige buffer evenwichtsinstelling scans uit het onderste gedeelte van de interface verwijderen door elk afzonderlijk te markeren en te klikken op de rode X naar het midden rechts van de interface. De nieuwe scans toevoegen door te klikken op de knop "Toevoegen Series", 20 invoeren in het veld voor "Stappen om toe te voegen" en de "alternatieve verwarming/koeling" vakje aan te vinken. Klik op OK en voer het experiment door te klikken op de groene afspeelknop zoals hierboven.</li>
		<li>Herhaal stap 3.1 - 3.1.1 met werkende buffer met de gewenste concentratie van ligand in beide haarvaten de objectverwijzing experimenten voor de ligand (verzamelen van twee aparte experimenten met behulp van 120 s en 600 s hoogtemperatuur evenwichtsinstelling tijden respectievelijk worden gebruikt in het verwerven van de tarief-constante voor thermolabile ligand conversie). Opmerking: De hier gebruikte scanfrequentie zorgt ervoor dat de Biomolecuul in latere experimenten bij thermisch evenwicht in de voorwaartse en omgekeerde scans (Zie discussie). Scan tarieven < 0,1-0,2 ° C min-1 leiden tot een luidruchtige thermograms en zijn niet van toepassing in DSC experimenten. De temperaturen moeten uitbreiden uit put beneden de smelttemperatuur van de gratis Biomolecuul tot ruim boven de smelttemperatuur van Biomolecuul ligand-verzadigd (~ 20-80 ° C voor MN4). Controleer de reproduceerbaarheid van de scans (bij voorbeeld, 10 vooruit en 10 omgekeerde scans voor 20 totaal is voldoende).</li>
		<li>Als meerdere liganden (zoals cocaïne en kinine) gebruikt, spoel de DSC met 200 mL werkende buffer (Herhaal vanaf stap 2.5) tussen runs ligand verwijderen uit de haarvaten te voorkomen van kruisbesmetting. Opmerking: Het is nuttig om te voeren een repliceren experiment op de gratis Biomolecuul na een run ligand-gebonden om te controleren of de vorige ligand sterk aan de capillaire wanden absorbeert en is niet voldoende verwijderd met de buffer leegmaken. Als de thermograms voor de gratis Biomolecuul lijken te worden verschoven naar een grotere omvang en hogere denaturatie temperatuur na de ligand-gebonden experimenteren, is het waarschijnlijk dat de vorige ligand nog steeds aanwezig in de calorimeter na het spoelen is. De geadsorbeerde ligand verwijderen door het broeden van de haarvaten met 20% Contrad-70 gedurende 1 uur bij 60 ° C met de plastic doppen en druk handvat af. De DSC-software, Wijzig in de experimentele modus "Isothermische" onder de tab. Kies 3.600 s van de experimentele methode voor de duur en 60 ° C voor de isothermische temperatuur, met nul voor de equilibratietijd ingevoerd. Klik op "Toevoegen aan experimentele methode". De isothermische experiment wordt weergegeven in het onderste gedeelte van het scherm. Na voltooiing, het instrument met 2 L gedeïoniseerd water spoelen en herhaal vanaf stap 2.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monster experimenten met behulp van hetzelfde DSC laden procedure en experimentele parameters zoals de verwijzing scandering uitvoeren Controleer het capillair verwijzing bevat de werkende buffer terwijl het capillair monster de gratis Biomolecuul op de gewenste concentratie in werkende buffer bevat voor de gegevensset gratis Biomolecuul.<ol>
<li>Voor de ligand-gebonden experimenten, Controleer dat de ligand in de buffer van de werken in het capillair verwijzing is en de Biomolecuul plus ligand in werkende buffer in het capillair monster. Spoel het systeem tussen toevoegingen van verschillende liganden zoals in stap 2.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voer een extra experiment met de Biomolecuul gebonden aan de thermolabile ligand waar de hoge temperatuur evenwichtsinstelling periode wordt verhoogd tot 600 s en alle andere experimentele parameters zijn hetzelfde als stap 3.2.1. Opmerking: De duur van de evenwichtsinstelling hoge temperatuur voor het tweede ligand-gebonden experiment is gewoon gekozen om ervoor te zorgen dat de ligand sneller verarmd dan het korte evenwichtsinstelling tijd experiment. Als het ligand-gebonden pieken van de eerste verval langzaam als functie van de scan nummer experimenteren (bijvoorbeeldde verschillen in opeenvolgende piek maxima zijn ≤ 0,5 ° C), 10 - aan 20 keer verhogingen gedurende de evenwichtsinstelling hoge temperatuur om te schatten voldoende uitputten het ligand tijdens het tweede experiment. De nauwkeurige berekening van de constant voor ligand omzetting vereist dat de tweede experiment snellere uitputting van het ligand ten opzichte van de eerste heeft. De concentraties van de ligand geëxtraheerd uit de globale analyse van de twee experimenten zullen soortgelijke en dus onbruikbaar als het ligand uitputting wordt niet voldoende versneld in het tweede experiment.</li>
</ol>4. verwerking van de gegevens
<ol><li>Open de DSC experimenteren bestanden in de software van de analyse van de gegevens van DSC (Zie Tabel van materialen) en de rauwe kracht gegevens exporteren als werkbladen.</li>
	<li>De spreadsheets met de ruwe kracht gegevens in software voor data passend importeren.</li>
	<li>De voorbeeldgegevens basislijn aftrekken door af te trekken van de buffer gegevens van de macht van het vrije verkeer en de ligand-gebonden Biomolecuul experimenten. Opmerking: Voor de thermolabile ligand-experiment, de concentratie van de oorspronkelijke ligand afneemt met elke scan. Het is daarom ideaal om aftrekken van de buffer scan 1 van monster scan 1, enzovoort. We hebben vastgesteld dat de buffer scans met cocaïne niet aanzienlijk veranderen als de ligand conversie opbrengst en daarom een enkele thermolabile ligand buffer scan kan worden gebruikt voor alle thermolabile ligand-gebonden gegevens aftrekken.</li>
	<li>De macht voorbeeldgegevens basislijn-afgetrokken omzetten in warmtecapaciteit. Opmerking: De conversie vereist van de Biomolecuul gedeeltelijke specifieke volume, die naar schatting14,15,16 worden kan. De vergelijking voor het omzetten van stroom naar warmtecapaciteit heeft al eerder beschreven17.</li>
</ol>5. de gegevensanalyse
<ol><li>Wereldwijd passen de korte evenwichtsinstelling tijd thermolabile ligand-gebonden warmtecapaciteit dataset met een enkele set van basislijn, ligand concentratie, vouwen en ligand bindende parameters zoals eerder beschreven4.</li>
	<li>Herhaal dat de globale geschikt voor de lange evenwichtsinstelling tijd dataset om te berekenen van de constante snelheid voor thermolabile ligand conversie zoals eerder beschreven4.</li>
</ol>

<ol><li>Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+calorimetry+in+life+science%3A+thermodynamics%2C+stability%2C+molecular+recognition+and+application+in+drug+design%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design.</a> Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).</li>
<li>Privalov, P. L., Dragan, A. I. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/profile/Anatoliy_Dragan/publication/7002826_Microcalorimetry_of_biological_macromolecules/links/0912f507f62e09cd1b000000.pdf">Microcalorimetry of biological macromolecules.</a> Biophys Chem. 126 (1-3), 16-24 (2007).</li>
<li>Brandts, J. F., Lin, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+strong+to+ultratight+protein+interactions+using+differential+scanning+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Study of strong to ultratight protein interactions using differential scanning calorimetry.</a> Biochemistry. 29 (29), 6927-6940 (1990).</li>
<li>Harkness, R. W., Slavkovic, S., Johnson, P. E., Mittermaier, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+characterization+of+folding+and+binding+interactions+with+thermolabile+ligands+by+DSC%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">Rapid characterization of folding and binding interactions with thermolabile ligands by DSC.</a> Chem Commun. 52 (92), 13471-13474 (2016).</li>
<li>Garbett, N. C., Chaires, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+studies+for+drug+design+and+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Dis%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic studies for drug design and screening.</a> Expert Opin Drug Dis. 7 (4), 299-314 (2012).</li>
<li>Holdgate, G. A., Ward, W. H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+binding+thermodynamics+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Measurements of binding thermodynamics in drug discovery.</a> Drug Discov Today. 10 (22), 1543-1550 (2005).</li>
<li>Plotnikov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+autosampling+differential+scanning+calorimeter+instrument+for+studying+molecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions.</a> Assay Drug Dev Technol. 1 (1), 83-90 (2002).</li>
<li>Schon, A., Lam, S. Y., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics-based+drug+design%3A+strategies+for+inhibiting+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics-based drug design: strategies for inhibiting protein-protein interactions.</a> Future Med Chem. 3 (9), 1129-1137 (2011).</li>
<li>Periánez Parraga, L., G-L, A., Gamón Runnenberg, I., Seco Melantuche, R., Delgado Sánchez, O., Puigventós Latorre, F. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2173508511000141">Thermolabile Drugs. Operating Procedure In the Event of Cold Chain Failure.</a> Farmacia Hospitalaria. 35 (4), 1-28 (2011).</li>
<li>Murray, J. B., Alshora, H. I. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2710.1978.tb00096.x/full">Stability of Cocaine in Aqueous-Solution.</a> J Clin Pharmacy. 3 (1), 1-6 (1978).</li>
<li>Waterman, K. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12066569">Hydrolysis in pharmaceutical formulations.</a> Pharm. Dev. Technol. 7 (2), 113-146 (2002).</li>
<li>Mergny, J. L., Lacroix, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15025917">Analysis of thermal melting curves.</a> Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).</li>
<li>Neves, M. A., Reinstein, O., Johnson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+a+stem+length-dependent+binding+mechanism+for+the+cocaine-binding+aptamer.+A+combined+NMR+and+calorimetry+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study.</a> Biochemistry. 49 (39), 8478-8487 (2010).</li>
<li>Bonifacio, G. F., Brown, T., Conn, G. L., Lane, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+electrophoretic+and+hydrodynamic+properties+of+DNA+and+RNA+oligonucleotide+duplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Comparison of the electrophoretic and hydrodynamic properties of DNA and RNA oligonucleotide duplexes.</a> Biophys J. 73 (3), 1532-1538 (1997).</li>
<li>Hinz, H. -J. Chapter 3. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDurchschlag%2C+H+%22Thermodynamic+Data+for+Biochemistry+and+Biotechnology%22">Thermodynamic Data for Biochemistry and Biotechnology</a>. , Springer. Berlin Heidelberg. 45-128 (1986).</li>
<li>Hellman, L. M., Rodgers, D. W., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenomenological+partial-specific+volumes+for+G-quadruplex+DNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Biophys+J+Biophy%22%5BJournal%5D)">Phenomenological partial-specific volumes for G-quadruplex DNAs.</a> Eur Biophys J Biophy. 39 (3), 389-396 (2010).</li>
<li>Farber, P., Darmawan, H., Sprules, T., Mittermaier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+Protein+Folding+Cooperativity+by+Differential+Scanning+Calorimetry+and+NMR+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Analyzing Protein Folding Cooperativity by Differential Scanning Calorimetry and NMR Spectroscopy.</a> J Am Chem Soc. 132 (17), 6214-6222 (2010).</li>
<li>Reinstein, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quinine+binding+by+the+cocaine-binding+aptamer.+Thermodynamic+and+hydrodynamic+analysis+of+high-affinity+binding+of+an+off-target+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Quinine binding by the cocaine-binding aptamer. Thermodynamic and hydrodynamic analysis of high-affinity binding of an off-target ligand.</a> Biochemistry. 52 (48), 8652-8662 (2013).</li>
<li>Tellinghuisen, J. <a target="_blank" href="https://web.stanford.edu/~kimth/www-mit/8.13/error_propagation.pdf">Statistical error propagation.</a> J Phys Chem. A. 105 (15), 3917-3921 (2001).</li>
<li>Drobnak, I., Vesnaver, G., Lah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+thermodynamic+analysis+of+reversible+unfolding+processes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Model-based thermodynamic analysis of reversible unfolding processes.</a> J Phys Chem B. 114 (26), 8713-8722 (2010).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Wijzigingen en probleemoplossing
De details van de analyse van de wereldwijde montage gebruikt in Figuur 1 en Figuur 2 zijn eerder4beschreven. We schetsen hier, praktische aspecten van het uitvoeren en analyseren van DSC bindende experimenten met thermolabile liganden. Merk op dat een basislijn DSC verkregen voor de thermolabile ligand alleen wordt afgetrokken van het ligand + Biomolecuul datase...

Differentiële scanning calorimetrie (DSC) is een krachtige methode om quantitating biomoleculaire bindende en opvouwbare interacties1,-2,3. De sterke punten van DSC omvatten haar capaciteit te verhelderen bindend en vouwen van mechanismen en opleveren van het desbetreffende thermodynamische parameters2,3. Bovendien, DSC kan worden uitgevoerd in de oplossing in de buurt van de fysiologische omstandigheden en vereist geen etikettering van de Biomolecuul of ligand, bijvoorbeeldmet fluorophores, spin-etiketten of nucleaire isotopen4. Het instrument scant in temperatuur, het meten van de hoeveelheid warmte die nodig is om te denatureren van de Biomolecuul in de aanwezigheid en de afwezigheid van ligand. De resulterende thermograms worden gebruikt voor het uitpakken van de thermodynamische parameters betreffende de ligand bindend en vouwen van processen. De door de DSC- of andere thermodynamische technieken verstrekte informatie is cruciaal voor het begeleiden van het ontwerp van drugs gericht op biomoleculen1,5,6,7,8. Echter de herhaalde scannen naar hoge temperaturen (~ 60-100 ° C) problematisch kan zijn. Bijvoorbeeld, veel farmaceutisch belangrijke stoffen ondergaan omlegging of ontleding bij langdurige blootstelling aan hoge temperaturen9,10,11, dat wil zeggen, ze zijn thermolabile. Behandeling van bindende interacties door DSC meestal meebrengt dat meerdere voorwaartse en omgekeerde scans om na te gaan van de reproduceerbaarheid van het thermogram voor thermodynamische analyses12. Thermische conversie van een eerste ligand naar een secundaire vorm met gewijzigde bindende eigenschappen leidt tot uitgesproken verschillen in de vorm en positie van opeenvolgende thermograms, aangezien de concentratie van de oorspronkelijke ligand met elke scan terwijl afneemt de thermische conversie producten ophopen. Deze datasets zijn niet vatbaar voor traditionele analyses.
Onlangs hebben we een globale montage methode voor thermolabile ligand DSC datasets dat de opbrengst van de complete set van thermodynamische parameters betreffende de Biomoleculaire vouwen en bindende interacties van een enkele ligand-gebonden experiment waarnaar wordt verwezen naar de vereiste thermogram voor de gratis Biomolecuul4. De analyse vermindert de experimentele tijd en monster vereist door ~ 10-fold in vergelijking met standaard DSC benaderingen. We hebben goed voor ligand thermische conversie door de veronderstelling dat dit gebeurt tijdens het gedeelte van de hoge temperatuur van elke scan waar de thermogram niet afhankelijk ligand concentratie. Daarom is de ligand concentratie een constante in het gedeelte van het thermogram die wordt gebruikt voor het uitpakken van de thermodynamische parameters. We laten bovendien zien hoe de constant voor ligand thermische conversie kan worden verkregen door het uitvoeren van één aanvullende experiment met een langere equilibratietijd hoge temperatuur. Voor systemen waar ligand thermische conversie minder afhankelijk van de temperatuur is (dat wil zeggen, zich merkbaar bij alle temperaturen), de analyse kan worden gewijzigd als u wilt opnemen van variabele ligand concentraties. Hier laten wij zien deze procedure voor de aptamer van DNA MN4 in aanwezigheid van de cocaïne thermolabile ligand, die snel worden omgezet in benzoylecgonine bij hoge temperaturen (> 60 ° C). Kinine wordt gebruikt als een negatieve controle voor ligand thermolability omdat het geen conversie bij deze experimentele temperaturen ondergaan en ook aan MN4 bindt. We beschrijven de overname van thermolabile ligand DSC datasets en hun analyse opbrengst thermodynamische en kinetische parameters van de vouwing, bindende en ligand conversie processen.

<table><tbody><tr><td>Sodium chloride</td><td>Chem Impex</td><td>#00829</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71502</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Deioinized water for molecular biology</td><td>Millipore</td><td>H20MB1001</td><td></td></tr><tr><td>0.2 micron sterile syringe filters</td><td>VWR</td><td>CA28145-477</td><td></td></tr><tr><td>3 kDa centrifugal filters</td><td>Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>131048</td><td></td></tr><tr><td>Silicon tubing</td><td>VWR</td><td>89068-474</td><td></td></tr><tr><td>Plastic DSC flange caps</td><td>TA Instruments</td><td>6111</td><td></td></tr><tr><td>DNA aptamer MN4</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>https://www.idtdna.com/site/order/menu</td><td></td></tr><tr><td>Cocaine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C008</td><td></td></tr><tr><td>Quinine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22620</td><td></td></tr><tr><td>NanoDSC-III microcalorimeter</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/nanodsc/</td><td></td></tr><tr><td>DSCRun software</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td><td></td></tr><tr><td>NanoAnalyze software</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td><td></td></tr><tr><td>Contrad-70</td><td>VWR</td><td>89233-152</td><td></td></tr></tbody></table>

biomoleculaire dsc profielen met thermolabile liganden te karakteriseren snel vouwen en inbinden van interacties te meten

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Differentiële scanning calorimetrie (DSC) is een krachtige techniek voor het kwantificeren van de thermodynamische parameters bestuur biomoleculaire vouwen en bindende interacties. Deze informatie is cruciaal in het ontwerp van nieuwe farmaceutische stoffen. Er zijn echter vele farmaceutisch relevante liganden chemisch onstabiele bij de hoge temperaturen gebruikt in DSC analyses. Dus is bindende interacties te meten uitdagend omdat de concentraties van liganden en thermisch-geconverteerde producten voortdurend binnen de calorimeter-cel veranderen. Hier presenteren we een protocol met behulp van thermolabile liganden en DSC voor het snel verkrijgen thermodynamische en kinetische gegevens op de vouwing, bindende en ligand conversie processen. We hebben onze methode toegepast op de aptamer van DNA MN4 dat zich aan de thermolabile ligand cocaïne bindt. Met behulp van een nieuwe globale montage analyse die goed is voor thermolabile ligand conversie, de complete set van vouwen en bindende parameters worden verkregen van een paar van DSC experimenten. Bovendien laten we zien dat de constante snelheid voor thermolabile ligand conversie met slechts één aanvullende DSC dataset kan worden verkregen. De richtsnoeren voor het identificeren en analyseren van gegevens uit verschillende ingewikkelder scenario's worden gepresenteerd, met inbegrip van onomkeerbare bundeling van de Biomolecuul, langzame vouwing, langzame bindende en snelle uitputting van de thermolabile ligand.

Representatieve gegevens voor de thermolabile ligand-DSC zijn afgebeeld in Figuur 1. De positie en de hoogte van de thermolabile ligand-gebonden piek verschuift achtereenvolgens naar beneden naar die van de niet-afhankelijke Biomolecuul aangezien de thermolabile ligand is uitgeput met elke scan (Figuur 1a). Het gratis denaturatie profiel wordt gebruikt als referentie voor het eindpunt van de thermolabile ligand conversie (<strong...

Presenteren we een protocol voor snelle karakterisering van biomoleculaire vouwen en inbinden interacties met thermolabile liganden met behulp van differentiële scanning calorimetrie.

Biomoleculaire DSC profielen met Thermolabile liganden te karakteriseren snel vouwen en inbinden van interacties te meten

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Het algemene doel van deze methodologie is om de thermodynamische parameters die biomoleculaire vouwing en bindingsinteracties bepalen te extraheren via differentiële scanningcalorimetrie, of DSC, met behulp van een thermolabiel ligand in slechts twee experimenten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de velden van biocalorimetrie en geneesmiddelenontwerp, zoals: wat zijn de relatieve magnitudes van de thermodynamische parameters die de interacties tussen biomoleculen en sterk bindende inhibitoren bepalen? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat een volledige ligandtitratie in één enkel experiment wordt uitgevoerd, wat een snelle extractie van thermodynamische parameters uit de globale fittingsanalyse mogelijk maakt.Begin met het bereiden van buffers voor de dialyse van het gezuiverde biomolecuul in een oplossing van liganden. Dialyseer het biomolecuul tegen ten minste één liter buffer met behulp van dialysebuisjes met een cutoff van 0,5 tot 1,7 kilodalton. De belangrijkste stap voor het verkrijgen van hoogwaardige DSC-gegevens is de dialyse van het biomolecuul-ligand tegen de gewenste buffer.Dit garandeert dat er geen artefacten door buffer-mismatch aanwezig zijn in de DSC-gegevens. Filtreer de uiteindelijke buffer, aangeduid als de werkbuffer, door een 0,2-micron filter dat volledig is geëquilibreerd met buffer. Weeg de gewenste massa's van de liganden af en los deze op in gefilterde werkbuffer.Als de gewenste ligandconcentraties massa's vereisen die te klein zijn om nauwkeurig af te wegen, maak dan een geconcentreerde ligand-stockoplossing. Filtreer de stockoplossing van het biomolecuul door een 0,2-micron filter dat volledig is geëquilibreerd met de werkbuffer. Bepaal vervolgens de concentratie van het biomolecuul via absorbantiemetingen.Bewaar het voorbereide biomolecuul en ligand in een koelkast van 4 °C of bij -20 of -80 °C als het biomolecuul en de liganden vriesbestendig zijn en langdurige bewaring vereist is. Ontgas de buffer en de biomolecuul- en ligandoplossingen in een tafelmodel ontgasser voordat ze in de differentiële scanningcalorimeter (DSC) worden geladen. Draai de drukknop van de DSC los.Sla vervolgens een siliconen slang door van de werkbuffer en bevestig deze aan de voorste flens van de referentiecapillair. Creëer een brug tussen de referentie- en monstercapillairs door de achterste referentieflens te verbinden met de voorste monsterflens. Bevestig vervolgens een stuk siliconen slang aan de achterste monsterflens die naar een afvalkolf loopt waaraan een vacuümlijn is bevestigd.Zet de vacuümlijn aan om de DSC te spoelen met 200 milliliters werkbuffer. Begin met het bevestigen van stukken siliconen slang van ongeveer drie tot vijf centimeter aan de flensen van de referentiecapillaire. Plaats vervolgens een tip van een een-milliliter pipette in de siliconen slang van de achterste flens.Zuig 0,8 milliliters werkbuffer op met een pipet en plaats de pipetpunt met buffer in de siliconen slang van de voorste referentiflens. Druk de zuiger van de pipet voorzichtig in om de werkbuffer door de voorste siliconen slang naar de referentiecapillair en verder in de aangehechte pipetpunt van de achterste flens te drukken. Druk de pipetzuiger in totdat het niveau van de werkbuffer net boven de voorste siliconen slang reikt, en laat de zuiger vervolgens los totdat het niveau van de werkbuffer net boven de achterste siliconen slang reikt.Blijf de werkbuffer heen en weer door de referentiecapillair leiden om alle luchtbellen te verwijderen. Plaats vervolgens de wijsvinger op de achterste pipetpunt en trek de achterste pipetpunt en de voorste pipet voorzichtig omhoog om ze, samen met de bevestigde siliconen slang, uit de referentieflenzen te verwijderen. Vul de monstercapillair als eerder beschreven met werkbuffer.Plaats een zwarte plastic dop op de achterste flenzen van het referentiemonster en laat de voorste flenzen onbedekt. Bevestig de drukhendel aan de DSC, open vervolgens de DSC-software en zet het instrument onder druk door op de rode pijl omhoog bovenaan de interface te klikken zodra de vermogensmeting is gestabiliseerd. Het vermogen van de DSC wordt aangegeven in een vak rechtsboven in de interface, samen met de temperatuur- en drukmeting van het instrument.Equilibreer de DSC met de werkbuffer door een voorwaartse en omgekeerde scan uit te voeren in het tabblad experimentele methode aan de linkerzijde van het scherm. Zorg ervoor dat de scanoptie is geselecteerd om de DSC en de temperatuurscanmodus uit te voeren. Klik in het inzetvenster voor temperatuurparameters onder het tabblad experimentele methode op de knop voor verwarming.Voer 1 en 100 °C in voor de lage en hoge experimentele temperaturen, 1 °C per minuut voor de scansnelheid en 60 seconden voor de equilibratieperiode. Klik op de knop AddSeries onder het invoerveld voor de equilibratieperiode. Voer twee in bij het veld 'steps to add' in het pop-upvenster en vink het vakje Alternate Heating/Cooling aan.Klik op OK. De toegevoegde scans verschijnen in het onderste gedeelte van de interface. Controleer of de parameters voor elke scan naar wens zijn. Start het experiment door op de groene afspeelknop bovenaan de interface te klikken.Navigeer naar het gewenste venster en voer in het pop-upvenster een bestandsnaam in om het experiment op te slaan. Bekijk de voortgang van het experiment door op het tabblad 'data' rechts van het tabblad 'experiment methode' te klikken. Voer referentie-experimenten uit voor een basislijncorrectie van de monstergegevens door de DSC opnieuw te laden met werkbuffer in beide capillairen.Voer meerdere voorwaartse en achterwaartse scans uit over een geschikt temperatuurbereik met een snelheid van één graad Celsius per minuut en een equilibratietijd van 120 seconden bij het omhoog gaan. Verwijder de vorige buffer-equilibratiescans uit het onderste gedeelte van de interface door elke scan afzonderlijk te selecteren en op de rode X in het midden rechts van de interface te klikken. Voeg de nieuwe scans toe door op de knop AddSeries te klikken, 20 in te voeren in het veld voor het aantal toe te voegen stappen en het vakje Alternate Heating/Cooling aan te vinken.Klik vervolgens op OK en voer het experiment uit door, zoals eerder, op de groene afspeelknop te klikken. Herhaal deze stappen met werkbuffer die de gewenste ligandconcentratie bevat in beide capillairen om de referentie-experimenten voor de ligand te verkrijgen. Voer twee afzonderlijke experimenten uit om de snelheidsconstante voor de thermolabiele conversie te bepalen.Zorg er bij de dataset voor de vrije biomolecuul daarvoor dat de referentiecapillair de werkbuffer bevat, terwijl de monstercapillair de vrije biomolecuul in de gewenste concentratie in werkbuffer bevat. Voer vervolgens de monsterexperimenten uit met behulp van dezelfde DSC-laadprocedure en experimentele parameters als bij de referentiescans. Zorg bij de experimenten met ligandbinding dat het ligand in de werkbuffer in de referentiecapillair zit en de biomolecuul plus ligand in de werkbuffer in de monstercapillair zitten.Spoel het systeem tussen de toevoegingen van verschillende liganden zoals voorheen. Voer één extra experiment uit met het biomolecuul gebonden aan het thermolabiele ligand, waarbij de equilibratieperiode bij hoge temperatuur wordt verhoogd naar 600 seconden en alle overige experimentele parameters gelijk blijven aan voorheen. Ga over tot de gegevensverwerking en analyse zoals beschreven in het tekstprotocol.De positie en hoogte van de piek van het gebonden thermolabiele ligand verschuiven opeenvolgend naar beneden richting die van het ongebonden molecuul naarmate het thermolabiele ligand bij elke scan wordt uitgeput. Het 3D-rijpingsprofiel wordt gebruikt als referentie voor het eindpunt van de conversie van het thermolabiele ligand. Een verlenging van de equilibratieperiode bij hoge temperatuur resulteert in meer uitgesproken reducties van de concentratie van het thermolabiele ligand bij elke scan in vergelijking met de dataset met een korte equilibratieperiode.Met behulp van de geoptimaliseerde parameters voor de globale fit-concentratie uit de twee datasets kan de snelheidsconstante voor ligandconversie bij de hoge equilibratietemperatuur worden berekend. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in 72 uur worden voltooid mits correct uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken het biomolecuul-ligand ook te ontgassen om luchtbellen uit de DSC-capillairen te verwijderen met behulp van de vulpipet, teneinde data-artefacten te voorkomen.Na het bekijken van deze video en het lezen van het artikel zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u DSC-experimenten op biomoleculen uitvoert, evenals van de implementatie van globale fitting-analyses om snel thermodynamische parameters te extraheren die de vouwings- en bindingsinteracties bepalen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in interacties van vouwing en binding in evenwicht, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals biomoleculen die een trage vouwings- en/of ligandbindingskinetiek vertonen.

measuring-biomolecular-dsc-profiles-with-thermolabile-ligands-to

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Een algemeen protocol voor het gebruik van isotherme titratie calorimetrie de bindende thermodynamica voor biologische systemen te volgen met matige bindingsaffiniteiten wordt gepresenteerd.

Isotherme Titratie Calorimetrie voor het meten van macromolecuul-ligand Affiniteit

This video demonstrates differential scanning calorimetry — a technique to study the interaction between a biomolecule and a ligand. The binding of a DNA aptamer and a thermolabile ligand is studied by applying repeated heating and cooling cycles to the sample and obtaining scans for thermodynamic analysis.

Differential Scanning Calorimetry to Study DNA Aptamer-Thermolabile Ligand Interaction

Microschaal thermophoresis (MST) op grote schaal kunnen worden gebruikt voor de bepaling van de bindingsaffiniteit zonder zuivering van het doelwit eiwit uit cellysaten. Het protocol omvat overexpressie van GFP-gefuseerde eiwit, cellyse in niet-denaturerende omstandigheden en detectie van MST signaal in de aanwezigheid van variërende concentraties van het ligand.

Eiwitzuivering-vrij bindwijze affiniteit Bepaling door Microschaal thermophoresis

Differentiële scannen fluorimetrie is een veelgebruikt methode voor het screenen van bibliotheken van kleine moleculen op interacties met eiwitten. Hier presenteren we een eenvoudige methode om deze analyses uit te breiden om een schatting te geven van de dissociatieconstante tussen een klein molecuul en zijn eiwitpartner.

Bepaling van proteïne-ligand interacties gebruiken Differential Scanning Fluorimetrie

Differentiële scanning calorimetrie meet de thermische overgangstemperatuur (s) en de totale warmte-energie nodig is om een ​​eiwit te denatureren. De resultaten worden gebruikt om de thermische stabiliteit van eiwitantigenen beoordelen vaccinformuleringen.

Differentiecalorimetrie - Een methode voor het beoordelen van de thermische stabiliteit en conformatie van eiwitantigeen

Hier presenteren we een protocol voor de productie en zuivering van eiwitten die zijn gemarkeerd met stabiele isotopen, en verdere karakterisering van eiwit-eiwitinteractie met behulp nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie en MicroScale Thermophoresis (MST) experimenten.

Meten van interacties van bolvormige en filamenteuze eiwitten door nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (NMR) en Microscale Thermophoresis (MST)

Thermoforese op microschaal verkrijgt snel bindingsconstanten tegen lage materiaalkosten. Gelabelde of labelvrije thermoforese op microschaal is in de handel verkrijgbaar; labelvrije thermoforese is echter niet in staat tot de diversiteit aan interactiemetingen die kunnen worden uitgevoerd met behulp van fluorescerende labels. Wij bieden een protocol voor gelabelde thermoforesemetingen.

Gebruik van thermoforese op microschaal om eiwit-lipide-interacties te meten

Het monitoren van veranderingen in de smelttemperatuur van een doeleiwit(d.w.z.thermische verschuivingstest, TSA) is een efficiënte methode voor het screenen van fragmentbibliotheken van een paar honderd verbindingen. We presenteren een TSA-protocol dat robotica-ondersteunde nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF) implementeert voor het monitoren van intrinsieke tryptofaanfluorescentie en lichtverstrooiing voor fragmentscreening.

Nanodifferentiële scanningfluormetrie voor screening in fragmentgebaseerde looddetectie

Dit protocol beschrijft een unieke methode voor het detecteren van de binding tussen verbindingen en eiwitmoleculen, en biedt de voordelen van minimaal verlies van eiwitmonsters en een hoge nauwkeurigheid van de gegevens.

Detectie van CD40-eiwit-umbelliferon-interactie via differentiële scanfluorescentie

Hier presenteren we de thermische verschuivingstest, een op fluorescentie gebaseerde techniek met hoge doorvoer die wordt gebruikt om de binding van kleine moleculen aan interessante eiwitten te onderzoeken.

Gebruik makend van thermische verschuivingstest om substraatbinding aan selenoproteïne O te sonden

Leer hoe je biomoleculaire vouwen en bindingsinteracties karakteriseert met differentiële scanningscalorimetrie en thermolabiele liganden. Deze methode versnelt thermodynamische analyses voor biocalorimetrie en medicijnontwerp.

Biomoleculaire DSC profielen met Thermolabile liganden te karakteriseren snel vouwen en inbinden van interacties te meten

Meer video's verkennen