Name: Geautomatiseerde Analyse van een Chemische Sensorische Preference Assay van een Nematodebevolking (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Leer een geautomatiseerde gedragsanalyse voor chemosensorische voorkeur van Caenorhabditis elegans populaties. Deze methode maakt gestandaardiseerde neurobiologisch onderzoek met meerdere replicaten tegelijk mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Sommige stammen werden verstrekt door het Caenorhabditis Genetics Center (CGC), dat wordt gefinancierd door NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Dit werk wordt ondersteund door het Howard Hughes Medical Institute, waarmee PWS een onderzoeker is.

<ol><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 314, 1-340 (1986).</li>
<li>Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensory+neurons+with+overlapping+functions+direct+chemotaxis+to+multiple+chemicals+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans.</a> Neuron. 7 (5), 729-742 (1991).</li>
<li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74 (3), 515-527 (1993).</li>
<li>Hilliard, M. A., Bargmann, C. I., Bazzicalupo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+responds+to+chemical+repellents+by+integrating+sensory+inputs+from+the+head+and+the+tail%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">C. elegans responds to chemical repellents by integrating sensory inputs from the head and the tail.</a> Curr Biol. 12 (9), 730-734 (2002).</li>
<li>Hilliard, M. A., Bergamasco, C., Arbucci, S., Plasterk, R. H., Bazzicalupo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worms+taste+bitter%3A+ASH+neurons%2C+QUI-1%2C+GPA-3+and+ODR-3+mediate+quinine+avoidance+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Worms taste bitter: ASH neurons, QUI-1, GPA-3 and ODR-3 mediate quinine avoidance in Caenorhabditis elegans.</a> EMBO J. 23 (5), 1101-1111 (2004).</li>
<li>Zariwala, H. A., Miller, A. C., Faumont, S., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Step+response+analysis+of+thermotaxis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Step response analysis of thermotaxis in Caenorhabditis elegans.</a> J Neurosci. 23 (10), 4369-4377 (2003).</li>
<li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 70 (3), 817-821 (1973).</li>
<li>Wicks, S. R., de Vries, C. J., van Luenen, H. G., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHE-3%2C+a+cytosolic+dynein+heavy+chain%2C+is+required+for+sensory+cilia+structure+and+function+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">CHE-3, a cytosolic dynein heavy chain, is required for sensory cilia structure and function in Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 221 (2), 295-307 (2000).</li>
<li>Jansen, G., Weinkove, D., Plasterk, R. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+G-protein+subunit+gpc-1+of+the+nematode+C.+elegans+is+involved+in+taste+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The G-protein subunit gpc-1 of the nematode C. elegans is involved in taste adaptation.</a> EMBO J. 21 (5), 986-994 (2002).</li>
<li>Srinivasan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+blend+of+small+molecules+regulates+both+mating+and+development+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).</li>
<li>Choe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascaroside+signaling+is+widely+conserved+among+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Ascaroside signaling is widely conserved among nematodes.</a> Curr Biol. 22 (9), 772-780 (2012).</li>
<li>Ezcurra, M., Tanizawa, Y., Swoboda, P., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Food+sensitizes+C.+elegans+avoidance+behaviours+through+acute+dopamine+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Food sensitizes C. elegans avoidance behaviours through acute dopamine signalling.</a> EMBO J. 30 (6), 1110-1122 (2011).</li>
<li>Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nat Neurosci. 11 (8), 916-922 (2008).</li>
<li>Kunitomo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+memory-dependent+synaptic+plasticity+of+a+taste+circuit+regulates+salt+concentration+chemotaxis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Concentration memory-dependent synaptic plasticity of a taste circuit regulates salt concentration chemotaxis in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Commun. 4, 2210(2013).</li>
<li>Snow, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+anterograde+intraflagellar+transport+motors+cooperate+to+build+sensory+cilia+on+C.+elegans+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons.</a> Nat Cell Biol. 6 (11), 1109-1113 (2004).</li>
<li>Tobin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+expression+of+TRPV+channel+proteins+defines+their+sensory+functions+and+subcellular+localization+in+C.+elegans+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Combinatorial expression of TRPV channel proteins defines their sensory functions and subcellular localization in C. elegans neurons.</a> Neuron. 35 (2), 307-318 (2002).</li>
<li>Waggoner, L. E., Zhou, G. T., Schafer, R. W., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+alternative+behavioral+states+by+serotonin+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Control of alternative behavioral states by serotonin in Caenorhabditis elegans.</a> Neuron. 21 (1), 203-214 (1998).</li>
<li>Sawin, E. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Genetic+and+cellular+analysis+of+modulated+behaviors+in+Caenorhabditis+elegans%22">Genetic and cellular analysis of modulated behaviors in Caenorhabditis elegans</a>. , M.I.T. Cambridge, MA. (1996).</li>
<li>Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+parallel+worm+tracker%3A+A+platform+for+measuring+average+speed+and+drug-induced+paralysis+in+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The parallel worm tracker: A platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes.</a> PLoS One. 3 (5), e2208(2008).</li>
<li>Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+behavioral+analysis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput behavioral analysis in C. elegans.</a> Nat Methods. 8 (7), 592-598 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een kritische stap in het protocol is ervoor te zorgen dat de analyseplaatjes een consistente droogheidsniveau hebben over verschillende experimentele dagen. Verschillende droogniveaus zullen resulteren in verschillende diffusiehoeveelheden van de oplossing in de agar en bijgevolg variaties in gedragsuitkomst. Aldus dienen analyseplaatjes altijd vóór de experimenten vers worden op de middag. Het aantal geteste testen per test moet ook gereguleerd worden om de vergelijkingen tussen behandelingen te vergemakkelijken. Ter referentie legt een wild-type worm 4-10 eieren / u gemiddeld&gt; 360 worms per assay als het bovenstaande wormsynchronisatieprotocol gevolgd is 17 . Als bepaalde mutantstammen slecht ei-leggen, kies dan meer volwassen volwassen wormen voor het ei-leggen om het doelnummer van de nakomelingen te bereiken. Een andere belangrijke stap in het protocol is om worms voorzichtig te behandelen tijdens het wasproces en de wormplaatsing. Worms zijn gevoelig voor mechanische stimuli, die dergelijke stressresponsen opwekken<html> S omkering en ei-liggende remming 18 . Bovendien moet erop worden gezorgd om de ROI nauwkeurig vast te stellen en de optimale drempelconstante waarde voor specifieke lichtomstandigheden te bepalen voordat u verder gaat met de videoanalyse. Het wordt ook aangeraden de kalibratie- en drempelprocessen te herhalen als er een langere periode is verstreken sinds het laatste experiment is uitgevoerd. Een beperking van deze methode is dat het niet geschikt is voor het analyseren van kleine wormbevolkingen. Als echter de juiste controles ter bepaling van de invloed van de aanwezigheid van voedsel op het zintuiglijke gedrag worden uitgevoerd, dan is het ook mogelijk om met deze instelling gebruik te maken van voedsel om de ruimtelijke verkennende locatie van de worm te beperken, zoals in de retentie-analyse. Bovendien is deze methode niet bedoeld voor het bestuderen van stimulusgradiëntnavigatie door de nabijheid en kleine hoeveelheden van de gebruikte controle- en experimentele oplossing druppels. E_content &quot;&gt; In de toekomst kan programmeringssoftware die multi-worm tracking en single-worm feature extractie mogelijk in dit systeem 19 , 20 integreren. Het opnemen van subtiele gedragsparameters van singlewormgedrag zoals omkeringssnelheden en amplitude van lichaamsbochten zullen zorgen voor Een meer gedetailleerde foto van het chemosensorische gedrag van een individuele worm in de context van een populatie gebaseerde test. De test kan ook worden aangepast om de habituatie te bestuderen door de gaten door de ROI te boren met behulp van spuitnaaldjes met de juiste gaugeformaat en het vullen van de gaten met ingeblazen agar Met de experimentele verbinding of controle buffer. Dit zorgt voor een consistente oppervlakconcentratie van de verbinding gedurende een langere periode van opnametijd zoals nodig is tijdens de wabituation studies. Een andere potentiële toepassing van deze methode is het uitvoeren van vergelijkende gedragsstudies over verschillende nematodespesies. Daarnaast is de gedragskamerKan op meerdere manieren worden aangepast om gedragsreacties op multimodale stimuli te bestuderen. Voor optogenetische toepassingen kunnen hoge intensiteit LED-arrays naast de camera-mount worden bevestigd om selectieve neuronen van belang te activeren tijdens de test. Verwarmingselementen, koelsystemen en temperatuursensoren kunnen ook worden toegevoegd aan de installatie om de effecten van temperatuur op sensorisch gedrag te bestuderen. Bovendien kunnen geurafleveringssystemen in de kamer geïnstalleerd worden om interacties tussen geur- en chemosensoriële modaliteiten te onderzoeken.

Voedingsdieren moeten ingangen van meerdere sensorische modaliteiten integreren en passende gedragsstrategieën selecteren om hun omgeving succesvol te kunnen navigeren. Het begrijpen hoe externe sensorische ingangen worden ontvangen en omgezet in neurale informatie om de actieselectie te begeleiden is een centraal doel op het gebied van neurobiologie. De genetische traceerbare nematode, C. elegans , is een aantrekkelijk modelorganisme om de neurale mechanismen van de sensorische biologie en multimodale integratie te bestuderen. Hoewel C. elegans slechts 302 neuronen heeft, kan het detecteren en discrimineren tussen een breed scala aan milieu-stimuli waaronder oplosbare verbindingen, vluchtige geurstoffen en omgevingstemperatuur 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . DeNematode C. elegans vertrouwt zwaar op zijn chemosensorische apparaat om voedselbronnen te lokaliseren en zich te waarschuwen voor mogelijke bedreigingen. Zo hebben gedragstesten die zijn ontworpen om de responsen van wildtype en mutant C. elegans naar chemische stimuli te screenen, een cruciale rol spelen in het dissecteren van de genetische, cellulaire en neurale mechanismen die onderliggend zijn aan C. elegans &#39;s opvallende sensorische mogelijkheden. Om het antwoord op oplosbare verbindingen te analyseren zijn drie typen analyses beschreven - de druppeltest, de chemotaxis-analyse en de retentie-analyse. In de valtest wordt een kleine druppel van de verbinding geplaatst op de staart van een bewegende worm en de beslissing van de worm om achteruit of vooruit wanneer de vloeistof bereikt het voorste sensorische inrichting gescoord 4. De druppeltest vereist weinig experimentele voorbereiding en is handig als de monstergrootte van wormen klein is, zoals bij laserworms. Echter, als slechts één wormKan tegelijkertijd worden geanalyseerd en de experimentator moet gedurende de gehele duur van de test aanwezig zijn, de druppeltest kan tijdrovend zijn. De druppeltest is ook kwetsbaar voor variaties in druppelafgifte tussen elke worm in een monster, die de algemene resultaten van de test kan beïnvloeden. Een andere beperking van de dalingstest is dat het alleen kan worden gebruikt om de reactie van de worm op aversieve verbindingen te analyseren, aangezien het niet mogelijk is om een ​​aantrekkelijk of neutraal effect van de verbinding te onderscheiden van de voorwaartse beweging van de worm. De chemotaxisassay voor oplosbare verbindingen omvat in het algemeen een agarplaat in vier kwadranten, waarbij de experimentele oplossing in de agar van twee tegenover elkaar gelegen kwadranten gemengd wordt en de controleoplossing gemengd in de andere twee kwadranten 8 , 9 . Bij het begin van de test wordt een druppel bufferwormen geplaatst in het midden van de plaat en het aantal wormen in<html> Elk kwadrant wordt op verschillende tijdstippen gescoord. De chemotaxis-analyse levert een grotere statistische kracht in vergelijking met de dalingstest, aangezien grote hoeveelheden wormen in elke test worden getest. Eén beperking van deze methode is echter dat de bereiding van de chemotaxis assay platen grote hoeveelheden van de experimentele verbinding vereist. Dit maakt het moeilijk om grootschalige gedragsschermen te voeren als een ingewikkeld zuiveringsproces met beperkte opbrengsten nodig is om de verbinding van belang te verkrijgen, zoals bij de ascaroside-signaleringsmoleculen 10 . Daarnaast is de manuele tellen van wormen in de test gevoelig voor fouten en de storing van de platen tijdens het tellen kan de resultaten beïnvloeden. In tegenstelling tot de twee bovengenoemde methoden gebruikt de retentie-analyse machinevisie, die de fout tijdens het scoreproces minimaliseert en de interferentie van de experimentator vermindert tijdens de analyse<html> &gt; 11. Geautomatiseerde analyse van video-opnames van wormgedrag kan ook mogelijk subtiele gedragsdynamiek onthullen die gemist wordt wanneer het scoren alleen op een paar discrete tijdspunten wordt uitgevoerd. In de retentietest worden twee oplossingsvlekken aan de tegenover elkaar gelegen kanten van een kleine cirkelvormige bacteriële voedingspatch toegevoegd, gevolgd door de plaatsing van een klein aantal wormen in het midden van de voedingspatch. Het gedrag van de wormen wordt dan opgenomen, geanalyseerd en een voorkeursindexwaarde wordt berekend op basis van het totale aantal wormpixels in elk oplossingsgebied. Hoewel de aanwezigheid van een aantrekkelijke voedingspatch minder maal populaties van wormen in elke test kan gebruiken, is eerder aangetoond dat het voedsel vermijdingsgedrag is opgelost aan oplosbare afstotende stoffen 12 . Bovendien tonen worms een fotofobische reactie op kortlichtlicht en het gebruik van microscooplichtbronnen die wit licht uitstoten in het gedragsopnameprogramma kan gedrag beïnvloedenS = &quot;xref&quot;&gt; 13. Het doel van de methode die in dit artikel wordt besproken is het opnemen en analyseren van C. elegans &#39; voorkeur voor oplosbare verbindingen door gebruik te maken van een populatie gebaseerde assay. Hiertoe integreert en verbetert de huidige werkwijze aspecten uit alle drie de eerder besproken methodes. Het maakt het mogelijk om grote populaties worms te testen en vereist slechts kleine hoeveelheden van de experimentele oplossing die bij elke test moet worden gebruikt. Daarnaast wordt de test uitgevoerd in een op maat gemaakte ingesloten gedragskamer met infrarood LED-achtergrondverlichting om de effecten van het korte golflicht op gedrag te minimaliseren. Elke kamer kan ook uitgerust worden met meerdere microscoopcamera&#39;s, waardoor de experimentele doorvoer wordt vergroot zonder de bankruimte in gevaar te brengen. Ten slotte geeft videoanalysesoftware de voorkeurindexwaarde voor elke video en een bijbehorende wormbezettingsgrafiek om de gedragsgedrag van de populatie over de tijd te visualiseren. De kameropstelling en aSsay protocol kan verder worden aangepast om multimodale gedragsreacties te bestuderen, zoals het effect van geurstoffen of temperatuur op chemosensorische gedragingen. In dit artikel wordt de constructie van de gedragskamer en het testprotocol beschreven. Het toont ook het nut van deze methode aan bij het analyseren van de respons van wild-type wormen en chemosensorische defecte mutanten aan de bekende oplosbare afstotende, koperionen 4 . Ten slotte wordt het videoanalyseproces met behulp van de meegeleverde software gedetailleerd beschreven.

<table><tbody><tr><td>Aluminium T-sleuven framingprofielen</td><td>McMaster-Carr</td><td>47065T101</td><td>Enkel profiel, 1" maat, massief</td></tr><tr><td>Haakjes</td><td>McMaster-Carr</td><td>47065T236</td><td>1" lang voor 1" hoge enkele profielextrusies</td></tr><tr><td>Compacte eindvoedingsbevestigingen</td><td>McMaster-Carr</td><td>47065T139</td><td>1" (enkel), pak van 4</td></tr><tr><td>Twist-in massieve paneelhouders</td><td>McMaster-Carr</td><td>47065T251</td><td>Voor 1" hoge extrusie</td></tr><tr><td>Kunststof eindkappen</td><td>McMaster-Carr</td><td>47065T91</td><td>Voor 1" hoge extrusie</td></tr><tr><td>Optisch helder gegoten acrylplaat</td><td>McMaster-Carr</td><td>8560K211</td><td>3/16" dik, 12" x 12"</td></tr><tr><td>Vinyl-gecoat polyesterweefsel</td><td>McMaster-Carr</td><td>88505K57</td><td>0.027" dik, 61" breedte, zwart</td></tr><tr><td>Messing rondsels</td><td>McMaster-Carr</td><td>9604K22</td><td>Handelsmaat 0, 0.545" buitendiameter</td></tr><tr><td>Stalen schijven</td><td>McMaster-Carr</td><td>90107A029</td><td>1/4" schroefmaat</td></tr><tr><td>Schroeven met afgeronde kop</td><td>McMaster-Carr</td><td>90272A546</td><td>1/4" - 20 draadmaat, 1 - 1/2" lang</td></tr><tr><td>Standaard werkende achtergrondverlichting</td><td>Smart Vision Lights</td><td>Zie lokale leverancier</td><td>8" x 8", infrarood 850 nm</td></tr><tr><td>IVP-C1 variabele regelpot</td><td>Smart Vision Lights</td><td>Zie lokale leverancier</td><td></td></tr><tr><td>T1 voeding</td><td>Smart Vision Lights</td><td>Zie lokale leverancier</td><td></td></tr><tr><td>Dino lite Pro AM4113T</td><td>Dino-Lite Digital Microscope</td><td>Zie lokale leverancier</td><td></td></tr><tr><td>MS09B microscoopstandaard</td><td>Dino-Lite Digital Microscope</td><td>Zie lokale leverancier</td><td></td></tr></tbody></table>

geautomatiseerde analyse van een chemische sensorische preference assay van een nematodebevolking

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

De nematode, het compacte zenuwstelsel van Caenorhabditis elegans van slechts 302 neuronen, ligt onder een divers repertoire van gedrag. Om de dissectie van de neurale circuits die onder deze gedragingen liggen te vergemakkelijken, is het nodig om robuuste en reproduceerbare gedragsanalyses te ontwikkelen. Vorige C. elegans gedragsstudies hebben gebruik gemaakt van variaties van een &quot;drop test&quot;, een &quot;chemotaxis assay&quot; en een &quot;retentie assay&quot; om het antwoord van C. elegans op oplosbare verbindingen te onderzoeken. De werkwijze beschreven in dit artikel beoogt de complementaire sterktes van de drie eerder genoemde assays te combineren. Kortom, een kleine cirkel in het midden van elke meetplaat is verdeeld in vier kwadranten met de controle en experimentele oplossingen afwisselend geplaatst. Na de toevoeging van de wormen worden de analyseplaatjes geladen in een gedragskamer waar microscopecamera&#39;s de ontmoetingen van de wormen opnemen bij de behandelde gebieden. Automatische video analyse wordt dan uitgevoerd aEn een waarde voor voorkeurindex (PI) voor elke video wordt gegenereerd. De videoverzameling en geautomatiseerde analysefuncties van deze methode minimaliseren de betrokkenheid van de experimentator en eventuele bijbehorende fouten. Bovendien worden kleine hoeveelheden van de experimentele verbinding per test gebruikt en de multicamera-setup van de gedragskamer verhoogt de experimentele doorvoer. Deze methode is bijzonder nuttig voor het uitvoeren van gedragsschermen van genetische mutanten en nieuwe chemische verbindingen. Deze methode is echter niet geschikt voor het bestuderen van stimulusgradiëntnavigatie door de nabijheid van de controle- en experimentele oplossingsgebieden. Het mag ook niet worden gebruikt als er slechts een kleine populatie wormen beschikbaar is. Hoewel geschikt voor het analyseren van reacties alleen op oplosbare verbindingen in zijn huidige vorm, kan deze methode gemakkelijk worden aangepast om multimodale sensorische interactie en optogenetische studies op te nemen. Deze methode kan ook worden aangepast om de chemosensorische reacties van andere nematodespecies te analyseren. </p&gt;

Figuur 3A toont de voorkeursindexwaarden die zijn verkregen voor verschillende genotype- en behandelingsparingen. Een voorkeursindexwaarde van 1 duidt op een sterke aantrekkingskracht op de oplossing die in de experimentele ROI wordt geplaatst terwijl een voorkeursindexwaarde van -1 een sterke afstoting aangeeft. Een voorkeursindex van 0,02 werd verkregen wanneer de M13 bufferoplossing in zowel de controle- als de experimentele ROI&#39;s werd geplaatst, waaruit blijkt dat er geen ruimtelijke voorspanning ten opzichte van ROI is. N2 worms vermeden de koperionen sterk vermeden, wat resulteerde in een voorkeurindex van -0,67, wat de vorige bevindingen bevestigt dat koperionen sterk afstotend zijn ( Supplementary Movie 1 ) 4 . Osm-3 mutanten, die een goede vorming van de distale segmenten van sensorische cilia ontbrak, vertoonde een significant verminderd vermijden van koperionen (PI = -0,19) 15 . Ocr-2 mutanten, welke zijn de<html> Fectief in veel ASH-gemedieerde nociceptieve reacties, waaronder kopervermijding, vertoont ook aanzienlijk verminderde vermijding en zelfs een zachte aantrekkingskracht op koperionen (PI = 0,19) ( Aanvullende Film 2 ) 16 . Figuur 3B toont representatieve wormbezettingsgraden, die de dichtheid van wormen in de controle versus de experimentele ROI&#39;s in de tijd in elke video aanduiden. Hoe donkerder de kleur van het plotgebied, hoe groter het aantal wormpixels in de ROI. De bezettingsgrafiek voor N2-wormen die behandeld zijn met de M13-bufferregeling, laat zien dat het aantal wormen in beide ROI&#39;s gelijk blijft tijdens de test. Echter, de bezettingsgrafiek voor N2-wormen die met koperionen behandeld zijn, duiden erop dat de wormen de experimentele ROI sterk en consistent doorlopen tijdens de test. Gimg &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 55963 / 55963fig1.jpg &quot;/&gt; Figuur 1: Foto en schematische representatie van gedragskamerontwerp. ( A ) Vooraanzicht van de gedragskamerinstelling (links) en bijbehorende schematische weergave van kamerkader (rechts). Opaque polyester lakens omsluiten de kamer op alle gezichten, behalve de onderkant, waardoor licht door het infrarood backlight paneel mogelijk maakt. De cijfers 1, 2 en 3 komen overeen met de extrusie lagen in (B). ( B ) Schematisch van bovenaanzicht van extrusielagen die het gedragskamerframe omvatten. Dit omvat de bovenste laag (1), de montagelaag (2) van de middencamera mount en de onderste laaglaag (3). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/55963fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55963/55963fig2.jpg"/&gt; Figuur 2: Oplossings-plaatsing en Plate-alignment Templates. ( A ) De oplossing-plaatsingsjabloon heeft vier kwadranten en nummeruitlijningstekeners. De besturingsoplossing wordt in de linkerboven- en rechterkwadranten geplaatst, terwijl de experimentele oplossing in de linkerbovenhoek en rechtsboven wordt geplaatst. ( B ) De plaatuitlijningsjabloon heeft alleen nummeruitlijningstekeners om de worms in het zichtveld te beperken tijdens video-opname en analyse. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/55963fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55963/55963fig3.jpg" /> Figuur 3: Voorbeeldgegevens verzameld met behulp van deze analyse. ( A ) Preference Index (PI) waarden voor wildtype N2 en mutant C. elegans </e<html> m&gt; in reactie op M13 buffer en 10 mM CuCl2. N2 worms lieten geen voorkeur zien tussen controle en experimentele ROI&#39;s wanneer de M13 controle oplossing in beide ROI&#39;s werd geplaatst, maar de experimentele ROI sterk vermeden toen koper ionen daarin werden geplaatst (respectievelijk PI = 0,02 en -0,67). Osm-3 (p802) mutanten en ocr-2 (ak47) mutanten toonden significant verminderd vermijden van koperionen ten opzichte van N2 (PI = -0,1 en 0,2 respectievelijk). N = 6 analyses voor elke genotypebehandeling pairing,&gt; 360 worms per assay, error bars geven ± 1 SEM, *** p &lt;0.001, eenrichtings ANOVA gevolgd door post-hoc Tukey Honestly Significant Difference (HSD) test. ( B ) Representatieve wormbezettingsplaatsen voor N2-wormen met M13-buffer in zowel ROIs (bovenste) als N2-wormen met M13-buffer in de controle ROI en koperionen in de experimentele ROI (bodem). De kleurenschaal onder elke bezettingsgrafiek vertegenwoordigt het aantal wormpixels.Pload / 55963 / 55963fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien. Aanvullende film 1: Gedragsreactie van N2-wormen tot 10 mM koperchloride. Worms worden aangetrokken tot de controle kwadranten met M13 buffer (linksboven en rechtsonder), maar vermijd de quadranten die koper ionen bevatten opgelost in M13 buffer (rechtsboven en linksonder). De video werd opgenomen op 1 frame per seconde en speelde 15x op. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/Supplementary_Video_1.mp4">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a> Aanvullende film 2: Gedragsreactie van ocr-2 (ak47) wormen tot 10 mM koperchlooride. Worms lopen in ongeveer de gelijke mate rond in zowel de controlequadranten met M13 buffer (linksboven en rechtsonder) en het kwadrantS die koper ionen bevatten, opgelost in M13 buffer (rechtsboven en linksonder) gedurende de opnameduur. De mutanten tonen een lichte voorkeur voor de kwadranten die koperionen bevatten bij het begin van de opname. De video werd opgenomen op 1 frame per seconde en speelde 15x op. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/Supplementary_video_2.mp4">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a> Aanvullend bestand: Solution-placement en Plate-alignment Templates. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/JoVE_template.pptx">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

We presenteren een gedragsopname-opstelling en protocol waarmee geautomatiseerde analyse van de nematode, Caenorhabditis elegans , de voorkeur geeft aan oplosbare verbindingen in een populatie gebaseerde assay. Dit artikel beschrijft de constructie van een gedragskamer, het gedragsprotocol en het gebruik van videoanalyse software.

Geautomatiseerde Analyse van een Chemische Sensorische Preference Assay van een Nematodebevolking

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Het algemene doel van deze opstelling en dit protocol voor gedragsregistratie is om de populatiegebaseerde chemosensorische voorkeur van C. elegans voor oplosbare verbindingen te kwantificeren met behulp van een video-acquisitiesysteem met meerdere camera's, gevolgd door geautomatiseerde videoanalyse. Deze methode kan het neurobiologisch onderzoek naar C. elegans faciliteren door een snellere en meer gestandaardiseerde gedragsanalyse van genetische mutanten mogelijk te maken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat meerdere replica's gelijktijdig onder identieke omstandigheden kunnen worden geanalyseerd, terwijl de temporele dynamiek van de respons van de nematodepopulatie op oplosbare signalen wordt gemonitord.De montage van de gedragskamer zal worden gedemonstreerd door Christopher Cronin, een staff scientist van dit laboratorium. Bereid eerst de stofhoezen, cameramontagestangen, hoekbeugels, extrusiestangen en de cameramontage-unit voor zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Bevestig vervolgens de camerastandaard en houders aan de cameramontage-unit, beginnend bij de kopstangen die aan de middenstang zijn bevestigd.Zet vervolgens het frame van de gedragskamer in elkaar. Begin met het bevestigen van vier aluminium profielen van 30 cm aan een vierkante polyester plaat. Schuif één profiel over de twee T-moeren van de stoffen plaat, waarbij het profiel in het midden van de breedte van de stof wordt geplaatst.Draai de bevestigingsmiddelen aan om het stoffen vel aan elke stang te zekeren. Verspreid het vierkante polyester vel op het werkoppervlak met de vier bevestigde aluminium stangen erbovenop. Schuif vervolgens acht hoekbeugels over de bovenvlakken van de vier aluminium stangen, één aan elk uiteinde van elke stang.Plaats de hoekbeugels op de stangen, waarbij de verticale poten van de beugels gelijk liggen met het uiteinde van de stangen, en zet ze vast door de schroeven in de T-moeren aan te draaien. Plaats in elke hoek een aluminium extrusieprofiel van één voet rechtop door het profiel over de T-moeren op de twee poten van de hoekbeugel te schuiven. Zet vervolgens de verticale stang vast aan de horizontale stangen door de bevestigingsmiddelen aan te draaien, waardoor de twee aangrenzende horizontale stangen met elkaar verbonden worden.Schuif de losse T-moeren van de H-vormige cameramontage naar beneden in de verticale stijlen van het frame. Laat de H geheel naar beneden glijden tot deze op de hoekbeugels in elke hoek van het frame rust. Zet de cameramontage vast door de vier schroeven van de hoekbeugels aan te draaien.Gebruik vervolgens de laatste vier aluminium extrusieprofielen van één voet om de onderste laag van de kamer te assembleren. Plaats de hoekbeugels zodanig dat de poten van de beugels vlak tegen het uiteinde van de balk aansluiten en draai de schroeven aan om deze vast te zetten. Schuif vervolgens de balken tussen de verticale frameprofielen, waarbij de losse T-moeren in de kanalen van de verticale profielen worden geplaatst.Positioneer de stang zodanig dat de bovenste randen van de hoekbeugels één inch onder het open uiteinde van de rechtopstaande stangen liggen en zet deze vast door de schroeven van de hoekbeugels aan te draaien. Schuif vervolgens de T-moeren van de vier rechthoekige polyester platen naar beneden in de kanalen van de rechtopstaande extrusieprofielen om de zijkanten van de kamer af te dekken en draai de bevestigingsmiddelen aan om ze op hun plaats te fixeren. Kies één zijde als deur voor toegang tot het interieur van de kamer en verwijder de twee schroeven en T-moeren aan de onderste laag van de kamer.Plaats een plastic dop op het uiteinde van elke hoek om als poten voor het voltooide frame te dienen. Zet het frame rechtop en plaats twee paneelhouders per schuif in de laag van de frameruimte, en draai ze vast om ze op hun plaats te fixeren. Plaats vervolgens een stuk helder acryl van 12 bij 12 inch bovenop de paneelhouders om een platform voor de assayplaten te bieden.Positioneer tot slot de camera en het template van de objecttafel zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Plaats de dag voor het experiment 28 lege platen van 35 millimeter in stapels van vijf of minder op een vlak oppervlak. Vul elke assayplaat met vijf milliliter nematode growth media agar en laat de assayplaten overnacht rechtop drogen bij kamertemperatuur met de deksels eraf.Schakel op de dag van het experiment de achtergrondverlichting in, start de computer op en open de software voor videocapturering van de microscoopcamera. Sluit de microscoopcamera aan op de computer en klik op de genummerde thumbnail van de camera bovenaan het softwarevenster om de live-feed van de camera te bekijken. Om de instellingen voor de video-opname aan te passen, opent u het menu voor videoformaat in de linkerbovenhoek van de camera-feed en selecteert u MJPG 1280x1024.Open vervolgens het mapmenu naast het menu voor vide 형식 en selecteer een map waarin de videobestanden moeten worden opgeslagen. Klik op het icoon voor automatische belichting in de rechterbovenhoek van de camerabeelden en schakel de automatische belichting uit. Klik vervolgens op het LED-icoon direct rechts van het icoon voor automatische belichting om de ingebouwde LED's van de microscoopcamera uit te schakelen.Klik op het aangrenzende instellingenpictogram en selecteer monochroom. Maximaliseer het contrast en pas de helderheid aan. Plaats een sjabloon voor de plaatsing van oplossingen bovenop het uitlijningssjabloon van de objecttafelplaat en klik op het pictogram voor timelapse-video-opname aan de linkerkant van de camerabeelden.Voer vijf seconden in voor de duur en één seconde voor het interval om een kalibratievideo van vijf seconden op te nemen met één frame per seconde. Gebruik een glazen pipette van vijf milliliter om 1,2 milliliters nematode growth media buffer toe te voegen aan een plaat met gesynchroniseerde wormen en schud de plaat voorzichtig om de wormen in de buffer te verplaatsen. Pipetteer de buffer van de plaat en breng de wormen in buffer over in een schone microcentrifugebuis.Laat de buisjes één tot twee minuten staan zodat de wormen naar de bodem kunnen zakken. Gebruik vervolgens een plastic pipetpunt om zoveel mogelijk wasbuffer uit de buisjes te verwijderen zonder het pellet van geaggregeerde wormen aan de bodem van de buisjes te verstoren. Vul het buisje opnieuw met één milliliter schoon nematode growth media buffer en herhaal de wasprocedure nog twee keer.Plak vervolgens een sjabloon voor de plaatsing van oplossingen bovenop de tafel van een dissectiemicroscoop. Plaats daarna een stripje dubbelzijdige tape aan weerszijden van een sjabloon voor de uitlijning van de plaat. Lijn de rand van de assayplaat uit met de cirkel op het uitlijningssjabloon en druk dit aan tot het sjabloon aan de onderkant van de plaat kleeft.Lijn vervolgens de markeringen van het assayplaat-sjabloonlid uit met de markeringen van het vloeistofplaatsings-sjabloonlid onder de dissectiemicroscoop. Gebruik daarna een P2-pipet om één microliter van de M13-buffer in elk van de kwadranten één en vier te plaatsen. Gebruik een nieuwe tip om één microliter van de 10 millimolaire CuCl2-oplossing in elk van de kwadranten twee en drie te plaatsen.Gebruik een glazen pasteurpipet om de gewassen wormen over te brengen naar de assayplaten zodra de druppels vloeistof volledig in de agar zijn geabsorbeerd. Plaats een druppel wormen op de gebieden boven en onder de circulaire behandelde regio's. Vouw het weefsel vier keer en gebruik de stompe zijde om overtollige wasbuffer op de assayplaten te absorberen.Plaats de assayplaten onmiddellijk onder de microscoopcamera's in de gedragskamer door de nummers op de hoeken van de sjabloon uit te lijnen. Wacht twee tot drie minuten zodat de wormen kunnen acclimatiseren aan de assayplaten. Klik vervolgens op het pictogram voor timelapse-video-opname aan de linkerkant van de camerabeeldstroom en voer 10 minuten in voor de duur en één seconde voor het interval om een video van 10 minuten met één frame per seconde op te nemen.Klik ten slotte op start om de video-opname te beginnen. Voor elk videoframe telt de voorkeursindexfunctie het aantal wormpixels in elk interessegebied en berekent het percentage van één pixel ten opzichte van het totaal aantal pixels in het interessegebied. De verkregen waarden van de voorkeursindex voor verschillende combinaties van genotype en behandeling worden hier getoond.Een positieve waarde van de preferentie-index duidt op een aantrekking tot de behandeling, terwijl een negatieve waarde van de preferentie-index duidt op afstoting. Een preferentie-index van 0,02 werd verkregen toen de M13-buffersolution in zowel de controle- als de experimentele regio's van interesse werd geplaatst, wat aantoont dat er geen ruimtelijke bias is. Deze grafiek laat ook zien dat N2-wormen de koperionen sterk vermeden, wat resulteerde in een preferentie-index van 0,67.Bovendien vertoonden osm-3-mutanten, die defect zijn in de vorming van sensorische cilia, en ocr-2-mutanten, die defect zijn in ASH-gemedieerde nociceptieve responsen, een verminderde vermijding en zelfs een lichte aantrekkingskracht tot koperionen. Tijdens het uitvoeren van dit protocol is het belangrijk om snel, maar ook soepel en consistent te werken. De opstelling voor registratie en het assay-protocol kunnen eenvoudig worden aangepast om populatiegebaseerde gedragsresponsen te karakteriseren die voortvloeien uit de interacties tussen verschillende sensorische varianten van C. elegans.

automated-analysis-nematode-population-based-chemosensory-preference

Research

JoVE Journal

Behavior

Gedrag

Deze video introduceert chemotaxis in het nematode C. elegans en toont een monsterprotocol dat chemotactische afkeer van kopersulfaat test.

C. elegans Chemotaxis Assay: een methode om chemosensatie in wormen te testen

Onderzoekers kunnen on-demand beweging in C. elegans activeren door een elektrisch veld toe te passen dat wormen voelen en erop reageren.  Deze video introduceert elektrotactisch gedrag en toont een voorbeeldprotocol dat wordt uitgevoerd in een microfluïdisch apparaat.

Electrotaxis Assay: een methode om voortbeweging te observeren in C. elegans

This video describes an osmotic avoidance assay to examine chemoavoidance behavior in a transgenic worm model. Avoidance behavior is tested in a plate in the presence of a high-osmotic barrier and chemoattractant. The worms with a functional loss of neurons get attracted by the chemoattractant, cross the high-osmotic barrier, and become paralyzed in the trap zone because of the anesthetic solution.

Examine Chemoavoidance Behavior in Transgenic Worms Using Osmotic Avoidance Assay

Werkwijze voor het kwantitatief beoordelen van de chemotactische respons...

C. elegans Chemotaxis Assay

Gedragstests bieden krachtige hulpmiddelen voor het begrijpen van neuronale functie. Hier presenteren we verschillende protocollen voor het kwantificeren van roofzuchtig voedingsgedrag dat wordt aangetroffen in het modelrondworm Pristionchus pacificus en zijn verwanten. Bovendien bieden we methoden voor het analyseren van roofzuchtige voedingsaanpassingen, inclusief mondstructuren en tanden.

Het testen van Predatory Feeding gedrag in<em&gt; Pristionchus</em&gt; En andere Nematoden

Hier presenteren we een Caenorhabditis elegans -specifieke test die is ontworpen om veranderingen in het koperen aversiegedrag te evalueren en het vermogen om een ​​gemeenschappelijke voedingsbron te lokaliseren, als het organisme zich voortbrengt van een goed gevoed aan hongerige voedingswaarde.

EEN<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Voedingsstatus gebaseerde Koper Aversion Assay

We beschrijven de protocollen voor het gebruik van het brede veld-of-view nematode tracking platform (WF-NTP), waarmee de fenotypische karakterisering van de high-throughput van grote populaties van Caenorhabditis elegans. Deze protocollen kunnen worden gebruikt voor subtiele gedragsveranderingen in gemuteerde stammen of in reactie op farmacologische behandeling in een uiterst schaalbaar mode karakteriseren.

Geautomatiseerde Behavioral analyse van grote C. elegans populaties met behulp van een breed veld-of-view Tracking Platform

Hier presenteren we een protocol om de neuroprotectieve activiteiten van testverbindingen in Caenorhabditis elegans te beoordelen, inclusief polyglutamineaggregatie, neuronale dood en chemoavoidancegedrag, evenals een voorbeeldige integratie van meerdere fenotypen.

Caenorhabditis elegans als een modelsysteem voor het ontdekken van bioactieve verbindingen tegen polyglutamine-gemedieerde neurotoxiciteit

Hier presenteren we een protocol om associatief leren te testen door klassieke conditionering uit te voeren in het modelorganisme C. elegans. Het paradigma is gebaseerd op het koppelen van de concentratie zout in het milieu aan de aan- of afwezigheid van voedsel, waardoor hun chemotaxis verandert in de richting van of weg van zout.

Meten van associatief leren bij chemotaxis van de nematode Caenorhabditis elegans

Dit protocol stelt methoden vast voor het extraheren en kwantificeren van reacties op het vluchtige seksferomoon in C. elegans, en biedt hulpmiddelen om chemische communicatie en navigatietraject te bestuderen.

Vluchtige seksferomoonextractie en chemo-aantrekkingstest bij Caenorhabditis elegans

Leer een geautomatiseerde gedragsanalyse voor chemosensorische voorkeur van Caenorhabditis elegans populaties. Deze methode maakt gestandaardiseerde neurobiologisch onderzoek met meerdere replicaten tegelijk mogelijk.

Geautomatiseerde Analyse van een Chemische Sensorische Preference Assay van een Nematodebevolking

Meer video's verkennen