Geautomatiseerde Analyse van een Chemische Sensorische Preference Assay van een Nematodebevolking
13 juli 2017
We presenteren een gedragsopname-opstelling en protocol waarmee geautomatiseerde analyse van de nematode, Caenorhabditis elegans , de voorkeur geeft aan oplosbare verbindingen in een populatie gebaseerde assay. Dit artikel beschrijft de constructie van een gedragskamer, het gedragsprotocol en het gebruik van videoanalyse software.
Het algemene doel van deze opname-instelling en het protocol voor gedrag is om de populatie-gebaseerde chemosensorische voorkeur van C Elegans voor oplosbare verbindingen te kwantificeren met behulp van een video-acquisitiesysteem met meerdere camera's, gevolgd door geautomatiseerde videoanalyse. Deze methode kan het onderzoek naar de neurobiologie van C Elegans vergemakkelijken door een snellere en meer gestandaardiseerde gedragsanalyse van genetische mutanten mogelijk te maken. Het grote voordeel van deze techniek is dat meerdere replica's tegelijkertijd onder identieke omstandigheden kunnen worden onderzocht terwijl de temporele dynamiek van de reactie van de nematode-populatie op oplosbare signalen wordt gemonitord.
Christopher Cronin, een stafwetenschapper van dit laboratorium, zal de assemblage van de gedragskamer demonstreren. Om te beginnen, bereid de stoffen covers, cameramontagestaven, hoekbeugels, extrusiestaven en de montage van de camerastandaard voor zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Begin met de eindstaven die aan de middelste staaf zijn bevestigd, bevestig de camerastandaard en holsters aan de montage van de camerastandaard.
Monteer vervolgens het frame van de gedragskamer. Begin met het bevestigen van vier aluminium extrusiestaven van een voet aan een vierkante polyesterplaat. Schuif een staaf op de twee T-moeren van omni van de stoffen plaat, centreer de staaf langs de breedte van de stof.
Verstel de bevestigingen om de stoffen plaat aan elke staaf te bevestigen. Spreid de vierkante polyesterplaat op het werkoppervlak met de vier bevestigde aluminiumstaven erop. Schuif vervolgens acht hoekbeugels op de bovenste oppervlakken van de vier aluminiumstaven, één aan elk uiteinde van elke staaf.
Plaats de hoekbeugels op de staven met de verticale poten van de beugels vlak bij het uiteinde van de staven en bevestig ze op hun plaats door de schroeven in de T-moeren vast te draaien. Plaats bij elke hoek een aluminium extrusie van een voet rechtop, door de extrusie over de T-moeren op de twee poten van de hoekbeugel te schuiven. Bevestig vervolgens de rechtopstaande staaf aan de horizontale staven door de bevestigingen vast te draaien, waardoor de twee aangrenzende horizontale staven worden verbonden.
Schuif de losse T-moeren van de H-vormige cameramontage aan de montage naar beneden in de rechtopstaande staven van het frame. Laat de H helemaal naar beneden glijden om op de hoekbeugels bij elke hoek van het frame te rusten. Bevestig de cameramontage in de plaats door de vier hoekbeugelschroeven vast te draaien.
Gebruik vervolgens de laatste vier aluminium extrusiestaven van een voet om de onderste laag van de kamer te monteren. Plaats de hoekbeugels met de poten van de beugels vlak bij het uiteinde van de staaf en draai de schroeven vast om ze op hun plaats te bevestigen. Schuif vervolgens de staven tussen de rechtopstaande staven van het frame met de losse T-moeren in de rechtopstaande kanalen.
Plaats de staaf zodat de bovenranden van hun hoekbeugels een inch onder het open uiteinde van de rechtopstaande staven komen en bevestig ze op hun plaats door de hoekbeugelschroeven vast te draaien. Schuif vervolgens de T-moeren van de vier rechthoekige polyestervellen in de kanalen van de rechtopstaande extrusiestaven om de zijden van de kamer te bedekken en draai de bevestigingen vast om ze op hun plaats te bevestigen. Selecteer één zijde om een deur te zijn voor toegang tot de binnenkant van de kamer en verwijder de twee schroeven en T-moeren op de onderste laag van de kamer.
Plaats een plastic dop op het bovenste uiteinde van elke hoek om als voet voor het voltooide frame te dienen. Draai het frame met de rechterkant omhoog en plaats twee paneelhouders per schuif in de frameruimtelaag en draai om ze op hun plaats te bevestigen. Plaats vervolgens een 12 bij 12 inch stuk helder acryl op de paneelhouders om een podium voor de testplaten te bieden.
Positioneer ten slotte de camera en het podiumsjabloon zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Plaats de dag voor het experiment 28 lege platen van 35 millimeter in stapels van vijf of minder op een vlakke ondergrond. Vul elke testplaat met vijf milliliter agar voor nematodengroeimedia en laat de testplaten rechtop drogen met hun deksels eraf, een nacht lang op kamertemperatuur.
Op de dag van het experiment, zet het achterlicht aan, start de computer op en start de video-opnamesoftware van de microscoopcamera. Verbind de microscoopcamera met de computer en klik op de genummerde cameraminiatuur bovenaan het softwarevenster om de live feed van de camera te bekijken. Om de video-opname-instellingen aan te passen, trekt u het videoformaatmenu naar beneden in de linkerbovenhoek van de camerafeed en selecteert u MJPG 1280x1024.
Trek vervolgens het mapmenu naar beneden naast het videoformaatmenu en selecteer een map waarin de videobestanden moeten worden opgeslagen. Klik op het pictogram voor automatische belichting in de rechterbovenhoek van de camerafeed en schakel de automatische belichting uit. Klik vervolgens op het LED-pictogram direct rechts van het pictogram voor automatische belichting om de ingebouwde LED's van de microscoopcamera uit te schakelen.
Klik op het aangrenzende instellingenpictogram en selecteer, monochroom. Maximaliseer het contrast en pas de helderheid aan. Lijn een oplossingsplaatsjabloon uit op het sjabloon voor de uitlijning van het podium en klik op het pictogram voor timelapse video-opname aan de linkerkant van de camerafeed.
Voer vijf seconden in voor de duur en één seconde voor het interval om een calibratievideo van vijf seconden op één frame per seconde op te nemen. Gebruik een glazen pipette van vijf milliliter om 1,2 milliliter nematodengroeimediabuffer toe te voegen aan een plaat met gesynchroniseerde wormen en schud de plaat voorzichtig om de wormen in de buffer te verplaatsen. Pipetteer buffer van de plaat en verdeel wormen in buffer in een schone microcentrifugebuis.
Laat de buisjes één tot twee minuten staan om de wormen tot op de bodem te laten bezinken. Gebruik vervolgens een plastic pipettentip om zoveel mogelijk wasbuffer uit de buisjes te verwijderen zonder de pellet van geaggregeerde wormen op de bodem van de buisjes te verstoren. Vul de buis opnieuw met één milliliter schone nematoden
Overzicht
Dit artikel presenteert een opstelling en protocol voor gedragsregistratie voor het analyseren van de nematode, Caenorhabditis elegans, in een populatiegebaseerde assay. Er wordt in detail ingegaan op de constructie van een gedragskamer, het protocol voor de gedragsassay en het gebruik van videoanalyse-software voor geautomatiseerde analyse.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Gedragsanalyse
- Genetische Mutanten
Achtergrond
- Het begrijpen van chemosensorische voorkeuren in C. elegans kan inzichten versnellen in de neurobiologie.
- Geautomatiseerde analyse maakt snellere en meer gestandaardiseerde gedragsbeoordelingen mogelijk.
- Populatiegebaseerde assays maken het mogelijk om meerdere replica's onder identieke omstandigheden te monitoren.
- Deze methode verbetert de studie van temporele dynamiek als reactie op oplosbare signalen.
Doel van de studie
- Om de chemosensorische voorkeur van C. elegans voor oplosbare verbindingen te kwantificeren.
- Om neurobiologisch onderzoek te faciliteren via verbeterde technieken voor gedragsanalyse.
- Om de assemblage en het gebruik van een gedragskamer voor experimenten te demonstreren.
Gebruikte methoden
- Constructie van een gedragskamer met gebruik van aluminium extrusieprofielen en polyester platen.
- Multi-camera video-acquisitiesysteem voor het registreren van het gedrag van nematoden.
- Geautomatiseerde videoanalyse voor het kwantificeren van responsen op oplosbare verbindingen.
- Bereiding van assayplaten met groeimedium voor nematoden ten behoeve van experimenten.
Belangrijkste resultaten
- De opstelling maakt gelijktijdige assays van meerdere herhalingen mogelijk.
- Geautomatiseerde analyse levert consistente en betrouwbare gegevens over gedragsreacties.
- De methode legt de temporele dynamiek vast van de reacties van C. elegans op stimuli.
- Aantoonbaar gemak bij de assemblage en bediening van de gedragskamer.
Conclusies
- Dit protocol verbetert de efficiëntie van gedragsstudies bij C. elegans.
- Geautomatiseerde videoanalyse is een waardevol instrument voor neurobiologisch onderzoek.
- Het ontwerp van de gedragskamer is praktisch voor diverse experimentele opstellingen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Deze methode maakt high-throughput, gestandaardiseerde kwantificering van chemosensorische responsen op populatieniveau in C. elegans mogelijk, wat vroege targetvalidatie en fenotypische screening ondersteunt. Door de acquisitie en analyse van video's te automatiseren, wordt de experimentele variabiliteit verminderd en de doorvoer voor genetische en compound-screeningcampagnes verhoogd. De aanpak levert kwantitatieve preference index (PI) outputs die mechanistische risicoreductie van neuroactieve targets en voorspellende betrouwbaarheid bij de identificatie van lead-candidates faciliteren.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de aantrekking of afstoting van oplosbare verbindingen te kwantificeren via metingen van de preferentie-index.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie door middel van reproduceerbare, populatiegebaseerde gedragsmatige readouts die gen-verbinding-interacties verduidelijken.
- Voorspellende waarde: Genereert kwantitatieve gegevens die helpen bij portfolio-triage door actieve van inactieve verbindingen te onderscheiden op basis van vermijdings- of aantrekkingsfenotypes.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Produceert gestandaardiseerde, reproduceerbare gedragsassays die compatibel zijn met multi-well plate-formaten en geautomatiseerde imaging-systemen.
- Schaalbaarheid: Maakt gelijktijdige analyse van meerdere replica's onder identieke omstandigheden mogelijk, waardoor de screeningsdoorvoer voor mutantbibliotheken of stofcollecties wordt verhoogd.
- Standaardisatie van de output: Genereert waarden voor de voorkeursindex (PI) als kwantitatieve, genormaliseerde readouts die geschikt zijn voor hit-selectie en dosis-responsmodellering.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Faciliteert de studie naar chemosensorische paden die geconserveerd zijn over nematodensoorten heen, wat bijdraagt aan targetvalidatie over verschillende soorten.
- Translationele continuïteit: Maakt fenotypische screening mogelijk van genetische mutanten die gekoppeld zijn aan sensorische verwerking, wat bijdraagt aan mechanistische modellen van neurologische aandoeningen.
- Voorspellende risicoreductie: Legt de temporele dynamiek van populatieresponses vast, waardoor onderscheid kan worden gemaakt tussen acute en adaptieve gedragingen, wat het aantal fout-positieven bij lead-optimalisatie vermindert.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode wordt geïntegreerd in vroege discovery-workflows door kwantitatieve gedragsfenotypes te leveren die de brug slaan tussen genetische perturbatie en de respons op verbindingen, waardoor lead-identificatie wordt ondersteund via gestandaardiseerde, gemultiplexte screening.
- Ontdekkingsbiologie: Maakt hypothesetoetsing van genfuncties in chemosensatie mogelijk door vermijding of aantrekking op populatieniveau voor oplosbare signalen te meten.
- Screening: Zorgt voor standaardisatie en reproduceerbaarheid van de assay via geautomatiseerde videoanalyse, waardoor operatorbias wordt geminimaliseerd en de betrouwbaarheid van de gegevens toeneemt.
- Analyses: Levert preference index (PI)-waarden als kwantitatieve output, waarmee vergelijkingen kunnen worden gemaakt tussen genotypen, behandelingen en tijdstippen.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt de continuïteit van genontdekking naar fenotypische validatie door mutanten van sensorische genen te koppelen aan veranderde chemosensorische reacties.
- Herbruikbaarheid op bedrijfsniveau: Creëert een herbruikbaar platform voor het screenen van genetische mutanten en chemische bibliotheken over meerdere projecten heen dankzij het modulaire ontwerp en de geautomatiseerde uitlezing.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit te verminderen via kwantitatieve, populatiegebaseerde gedragstype-analyse.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid via geautomatiseerde videoanalyse en parallellisatie met meerdere camera's, waardoor de handmatige tijd en variabiliteit tussen experimenten worden verminderd.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen bij lead-identificatie door duidelijke, kwantificeerbare fenotypische read-outs te leveren die uitval in een laat stadium door gebrekkige target-interactie verminderen.
- Impact op de portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering van verbindingen en genetische targets mogelijk op basis van robuuste high-throughput gedragsscreeninggegevens.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van C. elegans, het ontwerp van gedragsassays en het gebruik van basissoftware voor videoanalyse.
- Afhankelijk van een microscopie-opstelling met meerdere camera's, een gecontroleerde milieukamer en image-analysis-pipelines voor de berekening van de voorkeursindex.
- Standaardisatie van de wormvoorbereiding, plating-dichtheid en acclimatisatietijd is noodzakelijk om de consistentie van de assays tussen verschillende runs te waarborgen.
- Aanpassing aan andere nematode-soorten of sensorische modaliteiten kan aanpassingen vereisen in het ontwerp van de arena, de stimulusafgifte of de trackingparameters.
- Niet geschikt voor het bestuderen van chemotaxis in gradiënten of assays met zeer lage aantallen wormen vanwege ruimtelijke beperkingen en populatieafhankelijke readouts.
