Methoden en Tips voor intraveneuze toediening van Adeno-associated Virus voor ratten en evaluatie van het centrale zenuwstelsel transductie

Het algemene doel van deze gentransfer via adeno-geassocieerde virusvectoren is om het brein en het ruggenmerg van de rat op uitgebreide, grootschalige wijze genetisch te manipuleren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen binnen het vakgebied van gentransfer. Het is een zeer efficiënte manier om genen in-vivo te introduceren en is daarom een zeer krachtige en veelzijdige techniek.

Deze procedure is zowel snel als zeer reproduceerbaar. In verschillende publicaties hebben we deze grootschalige methode voor gentransfer gebruikt om een eiwit dat gerelateerd is aan amyotrofische laterale sclerose in het gehele ruggenmerg van ratten tot expressie te brengen. Mijn collega, Robert Dayton, zal de procedure demonstreren.

Mychal Grames zal Robert assisteren. Begin met het voorbereiden van het werkstation; maak eerst het oppervlak schoon met 70% ethanol. Plaats daarna een warmteplaat in het werkgebied en stel deze in op 37 °C.

Plaats een werkbankmat bovenop het warmtekussen. Controleer of er voldoende zuurstof en isofluraan aanwezig zijn voor de procedure. Reinig de inductiekamer en het anesthesiemasker met 70% ethanol en plaats het anesthesiemasker op de werkbankmat.

Zorg ervoor dat de volgende materialen aanwezig zijn: één vierkant stuk paraffinefolie van ongeveer 5 x 5 centimeter per dier, één alcoholdoekje en twee of drie gazen kompressen per dier, pipetpunten en een micropipet. Ontdooi vervolgens de vector bij kamertemperatuur en label voor elk dier een steriele microcentrifugebuis. Pipetteer het benodigde volume AAV in de betreffende buis en vul het volume aan tot het gewenste injectievolume met lactaatringeroplossing of fysiologisch zout.

Vortex het monster gedurende één of twee seconden en centrifugeer het vervolgens kortstondig gedurende vijf seconden om het monster naar de bodem van de buis te brengen. Pipetteer het totale injectievolume uit de buis op een vierkantje paraffinefolie. Plaats daarna een naald van 30 gauge op een spuit van één milliliter.

Plaats de naald met de schuine zijde naar beneden in de vector op de paraffinefolie. Trek de zuiger van de spuit naar achteren tot het volledige virus zich in de naald en de spuit bevindt. Anestheseer de rat op de juiste wijze met behulp van het anesthesiesysteem.

Bevestig dat er een adequaat anesthesieniveau is bereikt door de afwezigheid van een reactie op een knijpreflex in de teen. Plaats de rat vervolgens op zijn zij in het werkgebied en handhaaf de anesthesie met behulp van de neuskegel. Terwijl de rat op zijn zij ligt, moet één laterale staartвенаar naar boven wijzen.

De injectie vindt plaats op twee derde van de lengte van de staart. Veeg de injectieplaats schoon met het alcoholprep-doekje. Houd de staart stevig vast, net boven het injectiegebied, met één vinger direct boven de laterale staartader; dit zal de ader dilateren.

Lijn de naald met het schuine uiteinde naar boven uit in dezelfde richting als de zichtbare staartvene. Doorboor de huid over de staartvene, waarbij u er zeer zorgvuldig op toeziet dat de hand die de staart vasthoudt niet op de staartvene drukt. Verwijder de druk op de staartvene om een normale bloedstroom mogelijk te maken.

Beweeg vervolgens de naald in de ader. Om er zeker van te zijn dat de naald de staartader heeft doorboord, trekt u de zuiger voorzichtig naar achteren. Als de naald zich in de ader bevindt, zal er bloed in de naald stromen.

Stabiliseer de naald door het uiteinde van de spuit tegen de staart te houden, nadat de naald indien nodig opnieuw is gepositioneerd. Injecteer de vector langzaam in de staart met een snelheid van ongeveer 20 microliters per seconde. In het geval van een gebrekkige injectie zal het dier slechts gedeeltelijk worden getransduceerd en zullen de resultaten waarschijnlijk niet bruikbaar zijn.

Met oefening zijn goede injecties echter zeer reproduceerbaar en betrouwbaar. Nadat de vector is toegediend, wordt de naald uit de staart verwijderd en wordt een gaasje 30 tot 60 seconden tegen de injectieplaats gedrukt om het bloeden te stelpen. Schakel de isofluraan-anesthesie en de zuurstof uit.

Houd de rat in de gaten totdat deze weer bij bewustzijn is en plaats deze vervolgens terug in de kooi. Gooi materialen die mogelijk met AAV zijn besmet weg in een geschikte biohazard-container en maak het werkstation schoon met 70% ethanol. Neem coronale coupes van 50 micron uit het gefixeerde en cryobeschermde brein van een AAV-geïnjecteerd dier, met behulp van een glijmicrotoom met vriesplateau.

Maak na immunokleuring voor GFP en het monteren op objectglazen photomicrografieën van elke sectie in het gedefinieerde interessegebied met een objectief met lage vergroting met behulp van een microscoop. Houd de camera-instellingen gelijk voor alle te analyseren monsters en sla de gegevens op als TIFF-bestanden. Open de photomicrografie in het algemeen beschikbare programma Scion Image.

Er worden twee vensters geopend; sluit het venster dat is aangeduid als index color. Kies de opties en vervolgens density slice. Een reeks tinten wordt in het rood aangegeven in het venster van de look up table.

Gebruik in het venster de cursor om alleen de specifieke GFP-labeling in te vullen en stop zodra de niet-specifieke achtergrond in het beeld wordt opgepikt. Klik vervolgens op analyze en stel de schaal in. Op de vierde regel staat units; kies in de vervolgkeuzelijst pixels en klik daarna op okay.

Om het fluorescerende oppervlak te meten, klikt u op analyze en vervolgens op measure. Klik daarna op analyze en show results. Er verschijnt een resultatenvenster waarin de meting van het fluorescerende oppervlak onder de kop area staat.

Zodra alle metingen zijn geregistreerd, worden de waarden van drie tot zes secties per dier gemiddeld. Gebruik een passende statistische test om de getransduceerde gebieden tussen de groepen te vergelijken. Deze representatieve afbeelding toont GFP-immunofluorescentie in het cerebellum van de rat, vier weken na een injectie van AAV 9 GFP via de staartader.

Beeldanalyse-software werd gebruikt om het fluorescerende gebied selectief te markeren en de gemarkeerde pixels te kwantificeren. Dit is de GFP-afbeelding van een niet-getransduceerd dier. Analyse van deze afbeelding, met gebruik van dezelfde parameters als voor het GFP-geïnjecteerde dier, detecteert een zeer laag niveau van achtergrondsignaal.

Zodra de techniek onder de knie is, kan de injectie in ongeveer vijf minuten per rat worden uitgevoerd. Concluderend beschrijft deze techniek een manier om genen efficiënt in het CZS van de rat te introduceren, waarbij een eenmalige genoverdracht zorgt voor blijvende expressie en langetermijneffecten. Het belangrijkste is dat het centrale zenuwstelsel vanuit de periferie wordt gemanipuleerd.

Een relatief niet-invasieve intraveneuze vectorinjectie bereikt de hersenen en het ruggenmerg, het centraal zenuwstelsel (CZS).