Name: Modelleren van Amyloid-β42 toxiciteit en neurodegeneratie in volwassen Zebrafish hersenen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Leer hoe je amyloïde-β42 peptiden synthetiseert en injecteert in volwassen zebrafish om een model voor Alzheimer te creëren. Deze methode onderzoekt de toxiciteit van amyloïde op neurale stamcellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gesteund door DZNE en de Helmholtz Association (VH-NG-1021), CRTD, TU Dresden (FZ-111, 043_261518), en DFG (KI1524/6) (CK); en door het Leibniz Association (SAW-2011-IPF-2) en goedgekeurd (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). Wij ook bedank Ulrike Hofmann voor peptide synthese en Nandini Asokan, Prayag Murawala en Elly Tanaka voor hulp tijdens het filmen van de procedure.

dit protocol is een standaardprocedure die is voorgesteld door de EU-richtsnoeren (2010/63) en de European Society for vis modellen in de biologie en de geneeskunde (EuFishBioMed) in Karlsruhe Instituut van technologie (KIT). Alle methoden die worden beschreven na hier zijn goedgekeurd door de ethische Commissie (Landesdirektion Dresden; documentnummer TVV-52/2015).
 1. voorbereiding van de Peptide van de Aβ42 <ol><li>Synthesize peptiden (Zie tabel 1) met behulp van de standaard 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)-chemie met 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3- tetramethyluronoiumhexafluorphosphate (HBTU) als de koppeling reagens op een geautomatiseerde solid-phase peptide synthesizer 52. De omvang van de synthese was 100 µmol.</li>
	<li>Laden de geautomatiseerde peptide synthesizer met 500 mg van de hars Fmoc-beschermd als de vaste fase (laadvermogen van 0,2 mmol/g). Laden van de opgeloste Fmoc-beschermd aminozuren in een concentratie van 0,5 M in het gebruikte volume en zoals berekend voor de respectieve synthesizer. 
	Opmerking: De berekeningen worden gemaakt om de koppeling van elk aminozuur Fmoc-beschermd tweemaal met 5 keer overmaat van elke bouwsteen naar de hars 47.</li>
	<li>Los de benodigde reagentia voor peptide synthese in dimethlyformamide (DMF). Bijvoorbeeld de activator, HBTU, met een concentratie van 0.48 M, 45% v/v N-Methylmorfoline (NMM) (de basis), en 5% v/v azijnzuur-Anhydride (de overkoepelende mengsel) voor te bereiden op het niet hebben gereageerd amino groepen cap.</li>
	<li>Alle de peptiden klieven van de hars door het continu mengen van de solide ondersteuning met behulp van een roerwerk in een mengsel van vers bereide decollete, bestaande uit trifluorazijnzuur (TFA): Triisopropylsilane(TIS): water: Dithiothreitol (DTT) bij 90 (v/v): 5 (v/v): 2.5 (v/v): 2,5 (m/v), voor 4 h. gebruiken 10 mL voor de omvang van de synthese van 100 µmol.</li>
	<li>Neerslag het gekloofd product door het decollete mengsel toevoegen aan 100 mL diethylether ijskoud. Passeren van een filtratie-eenheid met een filter van polytetrafluorethyleen (PTFE) met een poriegrootte van 0,45 µm en wassen met 20 mL diethylether ijskoude.</li>
	<li>De gefilterde peptide van het koffiefilter verzamelen en los 100 mg geprecipiteerde peptide in 5 mL gedestilleerd gedeïoniseerd water: acetonitril op 1:1.</li>
	<li>Zuiveren via omgekeerde-fase hogedruk vloeibare chromatografie (HPLC) op een semi-preparatieve HPLC uitgerust met een poreuze polystyreen divinylbenzeen kolom kraal maat 10 µm.
	<ol><li>Verwarm de kolom en onderhouden bij 50 ° C een kolom apparatuur voor verwarming gebruiken. Verzamelen van alle van de grote fracties met behulp van een geautomatiseerde breuk verzamelaar door houdende toepassing van een helling van 5% tot 100% oplosmiddel B meer dan 25 min op 4 mL/min. 
		Opmerking: Oplosmiddel A is 0,1% TFA in water en oplosmiddel B is 0,1% TFA in acetonitril 52.</li>
		<li>Toezicht op het chromatogram op 220 nm, de juiste pieken verzamelen en analyseren met behulp van de LC-MS.</li>
	</ol></li> <li>Bevestigen de zuiverheid door analytische omgekeerde fase ultra-hoge druk vloeibare chromatografie (UPLC) op 220 nm door te controleren met een UV-Detector tijdens het passeren van het monster door een kolom voor analytische C18 (kraal grootte 1.7 µm). Bevestig de peptide product door massaspectrometrie. 
	Opmerking: De UPLC is gekoppeld aan een electrospray ionisatie massaspectrometrie (ESI-MS) en Tandem vierpolige Detector.</li>
	<li>Lyophilize de juiste breuken van de gewenste peptide in een kolf met ronde bodem, door een vacuüm van 0.052 mbar, tot een pluizige poeder toe te passen. Koppel de vacuümpomp aan een bevriezing eenheid op-78 ° C. winkel bij-80 ° C, voor onbepaalde tijd gehandhaafd.</li>
	<li>De gelyofiliseerd peptide gebruiken om te bereiden van een stamoplossing van 1 mM in een mengsel van acetonitril: DMF: analytisch zuiver water 1:1:1 voor de experimenten. Deze oplossing kan worden opgeslagen voor ten minste 6 maanden, aangezien de peptiden niet in deze oplossing aggregaat doen.</li>
</ol> 2. Voorbereiding van het mengsel injectie <ol><li>-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM nb 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH 7.4) voor te bereiden voor het verdunnen van het gelyofiliseerd peptiden.</li>
	<li>Los de peptide aan een eindconcentratie van 20 µM in PBS. Deze oplossing vers bereiden. Meng goed en bewaren in de ijskast tot de injectie. Niet meer dan 30 minuten om te voorkomen dat de samenvoeging in oplossing.</li>
</ol> 3. Verdoving <ol><li>voorbereiden de stockoplossing van de verdoving, 0,1% ethyl-m-aminobenzoaat methanesulphonate (MESAB), in regelmatig vis water uit de circulerende systeem. Bereid de oplossing van de anaesthetization om een eindconcentratie van 0.0025% (v/v).</li>
	<li>Verwijderen van het gewenste aantal vis uit hun tanks in een container vervoer met 5 L systeem water.</li>
	<li>Half-Vul een plastic petrischaal (90 mm) met 40 mL verdoving. Gebruik dit gerecht voor injecties.</li>
	<li>De vis in de verdoving uit te broeden, totdat de operculaire beweging heeft opgehouden.</li>
</ol> 4. Cerebroventricular Microinjection <ol><li>voorbereiding van injectie apparatuur <ol><li>voorbereiden het glas injectie haarvaten met behulp van een naald trekker met de volgende parameters: verwarming cyclus, 537; trekken cyclus, 250; snelheid, 1.5 s; tijd, 80 ms.</li> <li>brengen de drukafstelling op de bron van de druk naar 25 psi.</li>
		<li>De microinjector parameters ingesteld op de volgende: ruim 20 psi druk; uitwerpen druk 10 psi periode waarde 2.5; gating waarde 100 ms.</li>
		<li>Laden de glazen viscometerbuizen met de oplossing voor injectie. De glazen viscometerbuizen in de houder microinjection invoegen. Aanpassen van de hoek van de injectie tot 45°. 
		Opmerking: Meer gedetailleerde protocollen kunnen worden gevonden zoals beschreven in verwijzingen 27 , 46.</li>
	</ol></li> <li>Plaats één vis in een nieuwe petrischaal gevuld met anaesthetization oplossing (zoals in stap 3.3).</li>
	<li>Houden de vis met de pincet en de Oriënt voor injectie.</li>
	<li>Genereren een spleet met de punt van een naald 30 G in de schedel via de optische tectum waar de twee zijdelingse platen elkaar ontmoeten. Voeg niet de tip in het hersenweefsel, dit zou bloeden en schade veroorzaken. Zie referenties 27 , 45 , 46 voor extra details.</li>
	<li>De glazen viscometerbuizen in de gleuf invoegen.
	<ol><li>Gebruiken van slechts het topje van de naald en niet meer dan 1 mm door de schedel doen doordringen. Houd ingedrukt de vis en breng de tip van de glazen capillaire via de site van de incisie.</li>
		<li>Oriënteren op het puntje van het glas capillaire naar de telencephalon in een hoek van 45°. Injecteren 1 µL van de oplossing. De vloeistof verspreidt onmiddellijk na injectie.</li>
	</ol></li></ol> 5. Herstel <ol><li>plaats de vis terug naar een container vervoer tot het herstelt. De container verbinden met het regelmatig circulerende water vis om optimale waterkwaliteit. 
	Opmerking: Het herstel moet normaal gesproken duren 1 min. Als het langer duurt, de vis moet worden bewaard in de verdoving voor een kortere tijd (dit moet worden geoptimaliseerd door de experimentator).</li>
</OL > 6. Weefsel voorbereiding en Sectioning <ol><li>wachten op een gewenste periode van tijd voordat de vis offeren. 
	Opmerking: Dit hangt af van de experimentele vraag. Amyloïde afzetting kan worden gezien zo spoedig 1 dag na injectie.</li>
	<li>De vis met de juiste methode afhankelijk van de ethische regels offeren (b.v., behandelen de vis met 0,1 M MESAB).</li>
	<li>De schedel boven de optische tectum met puntige forcep aan de dorsale zijde opengesneden en ontleden de kop net achter de borstvin met behulp van een scalpel.</li>
	<li>Bevestigen de hoofden met behulp van 2% paraformaldehyde (PFA) 's nachts bij 4 ° C. gebruik 3 mL PFA per hoofd in een kunststof buis met een schroefdeksel. 
	Let op: Draag de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen bij hantering van de PFA.</li>
	<li>Cryoprotection en botontkalking, wassen de hoofden driemaal in 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7.4), dan ze vervolgens overbrengen naar 20% sucrose/20% ethyleendiamminetetra (EDTA) oplossing en na een nacht bebroeden bij 4 ° C.</li>
	<li>Inbedden van het weefsel in de hars, afdelen bevriezen de hoofden in gelatin/20% 7,5% sacharoseoplossing in kunststof histologie mallen op droog ijs (ongeveer 3-5 min te bevriezen van een blok). Opslaan van de monsters bij-80 ° C of doorgaan naar de volgende stap (cryosectioning).</li>
	<li>Afdeling de hoofden in 12 µm dik cryosecties met behulp van een cryostaat als beschreven 28 , 42. De cryosecties rechtstreeks op glas dia's overzetten en opslaan bij-20 ° C voor langdurig gebruik.</li>
</ol> 7. Immunohistochemische kleuring en microscopie Opmerking: alle incubatie stappen in een bevochtigde kamer. En alle wassen stappen zijn voor elke 10 min.
<ol><li>De secties gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur drogen. Na het ontdooien, wassen de secties tweemaal in PBS en eenmaal in PBSTx (PBS met 0,03% Triton-X-100).</li>
	<li>Incubate met het primaire antilichaam (anti-Aβ42 antistof; 1:500 verdunning in PBSTx) bij 4 ° C's nachts. wassen na dag, één keer in PBS en tweemaal PBSTx.</li>
	<li>Broeden de secties met de secundair antilichaam (fluorescentie-coupled detection, 1:500 verdunning) samen met de DAPI (1 μg/mL) in PBSTx gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Wassen drie keer in PBSTx. Na het laatste wassen, mount de dia's met een dekglaasje aan met behulp van 100 μl 70% glycerol.</li>
	<li>Ophaal fluorescerende beelden met behulp van een confocal microscoop (bijvoorbeeld met 20 X PL APO N.A. 0,7 doelstelling met 488 excitatie bereik en een standaard groen filter; Figuur 2) 39.</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen

De amyloïde peptiden kunnen worden gewijzigd zodat reeks variaties of verschillende labels. Bijvoorbeeld, een gecodeerde amyloïde peptide kan worden gegenereerd, en de peptiden kunnen worden gelabeld met de fluorescerende labels op de N-terminus van de peptide-einde of gelabeld met vervoerder peptiden39. Ook in dit protocol is de peptide vervoerder de cel-penetrating peptide TR vanwege de doeltreffendheid ervan naar vervoer cargo diep in de hersenen weefsel39. Daarnaast zor...

AD is een chronische progressieve ziekte die wordt gekenmerkt door het verlies aan neuronen en synapses in de hersenschors1,2,3,4,5. De klassieke neuropathologische kenmerken van AD zijn de afzetting van amyloid peptiden en vorming van de neurofibrillary tangles (NFTs)6. Seniele plaques, ook bekend als amyloïde plaques, zijn samengesteld uit amyloid-β (Aβ) peptiden die vormen van β-geplooid structuren in de hersenen parenchym5. De ophoping van Aβ42 in AD patiënten heeft een vroege en kritische rol bij progressie van de ziekte. AD triggert een cascade van gebeurtenissen die leiden tot synaptic dysfunctie, verminderde plasticiteit en neuronale verlies7,8,9,10.
Het volwassen brein van teleost zebrafish dient als een uitstekend model voor het bestuderen van de regulering van de stamcel plasticiteit11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20 en diverse ziekten in het centrale zenuwstelsel (CNS), met inbegrip van AD21,22,23 ,24. Als gevolg van een breed scala van beschikbare experimentele methoden19,20,25,26,27,28,29, 30 , 31, deze studies zijn informatief en haalbaar. Zebrafish kan het aanvullen van de CNS13,15,32,33,34,35,,36,,37, 38, gedeeltelijk met behulp van moleculaire programma's geactiveerd na neuronale verlies19,39,40,41,42,43, 44. Daarom, tot oprichting van een neurodegeneratieve ziekte model in zebrafish kan helpen nieuwe kwesties met betrekking tot de regeneratieve vermogen en stamcel biologie in gewervelde hersenen.
Onlangs, ontwikkelde we een model van de amyloïde toxiciteit in volwassen zebrafish hersenen door het injecteren van synthetische Aβ42 peptiden (tabel 1)39. Deze financiële injectie veroorzaakt neurodegeneratie fenotypen denken aan menselijk brein pathologie (b.v., celdood, microglial activering, synaptic degeneratie en geheugen tekorten), die aangeeft dat zebrafish kan worden gebruikt voor het opwekken neurodegeneratie in zebrafish hersenen, Aβ42 peptiden kunnen worden opgespoord met immunohistochemische technieken, en moleculaire mechanismen van regeneratie in volwassen zebrafish die CNS kan worden geïdentificeerd39. In dit protocol tonen we de injectie van synthetische amyloïde peptiden in de hersenen van de zebravis met behulp van een cerebroventricular injectie (CVMI) methode27,39,45,46 om na te bootsen amyloïde afzetting (Figuur 1). CVMI biedt een nieuwe manier van het leveren van de peptiden, die statistische na injectie als β-sheet structuren en uitoefenen toxiciteit. De peptiden zijn gelijkmatig verspreid in de hersenen, gericht op de ventriculaire gebied langs de gehele rostro-caudal as45. Bovendien kunt deze methode voor het analyseren van de morfologische en moleculair reactie van de NSPCs in volwassen zebrafish hersenen na amyloïde insluitsels. Dergelijk onderzoek levert ons een inzicht voor succesvolle hersenen reparatie bij zoogdieren. Onze methode kan worden gebruikt om te begrijpen van de nodige moleculair mechanisme van de reactie van een succesvolle regeneratie na AD-achtige symptomen voor het opwekken van aanvulling van verloren neuronen en functionele herstel.

<table><tbody><tr><td>Fmoc-beschermde aminozuren</td><td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td><td></td><td>Fmoc-gebaseerde aminozuren voor solid phase peptide synthese (SPPS)</td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorofosfaat (HBTU)</td><td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td><td>RL-1030</td><td>Activator</td></tr><tr><td>Oxyma</td><td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td><td>RL-1180</td><td>Racemisatie-onderdrukker</td></tr><tr><td>N,N-Diisopropylethylamine</td><td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td><td>SOL-003</td><td>Base</td></tr><tr><td>Dimethylformamide</td><td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td><td>SOL-004</td><td>Solvent</td></tr><tr><td>N-Methylmorpholine</td><td>Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germany</td><td>A12158</td><td>Base</td></tr><tr><td>1-Hydroxybenzotriazoolhydraat (HOBT)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA)</td><td>157260 ALDRICH</td><td>Activator</td></tr><tr><td>Piperidine</td><td>MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)</td><td>822299</td><td>Fmoc deprotectie reagens</td></tr><tr><td>Dichlormethaan (DCM)</td><td>MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)</td><td>106050</td><td>Solvent</td></tr><tr><td>Mierenzuur (FA)</td><td>MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)</td><td>100264</td><td>Buffercomponent voor HPLC</td></tr><tr><td>Trifluorazijnzuur (TFA)</td><td>MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)</td><td>808260</td><td>Clevage Mixtuur reagens</td></tr><tr><td>Triisopropylsilaan(TIS)</td><td>MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)</td><td>233781 ALDRICH</td><td>Clevage Mixtuur reagens</td></tr><tr><td>Acetonitrile (voor UPLC/LCMS)</td><td>Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH</td><td>34967-1L</td><td>Solvent</td></tr><tr><td>Acetonitrile (voor HPLC)</td><td>VWR International Ltd, England</td><td>83639.320</td><td>Solvent</td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>VWR International Ltd, England</td><td>23811.326</td><td>Solvent voor peptide precipitatie</td></tr><tr><td>Dithiotritol (DTT)</td><td>VWR International Ltd, England</td><td>0281-25G</td><td>Clevage Mixtuur reagens</td></tr><tr><td>TentaGel S RAM Fmoc rink amide hars</td><td>Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany)</td><td>S30023</td><td>Solide fase voor SPPS</td></tr><tr><td>Peptide synthese 5 ml spuiten met inbegrepen filters</td><td>Intavis AG (Cologne, Germany)</td><td>34.274</td><td>Reactiebuis voor SPPS en voor clevage van de Solide Fase</td></tr><tr><td>Polytetrafluorethyleen (PTFE) filter</td><td>Sartorius Stedtim (Aubagne, France)</td><td>11806-50-N</td><td>Filtratie van geprecipiteerde peptiden</td></tr><tr><td>Polyvinylideenfluoride (PVDF) spuitfilter</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe</td><td>KC78.1</td><td>Pre-filtratie voor HPLC</td></tr><tr><td>Peptide Synthesizer</td><td>Intavis, Cologne, Germany</td><td>ResPep SL</td><td>Geautomatiseerde solid-phase peptide synthesizer</td></tr><tr><td>Water Alliance HPLC</td><td>Waters, Milford Massachusetts, USA</td><td>Waters 2998, Waters e2695</td><td>Semi-preparatieve omgekeerde fase hogedruk vloeistof chromatografie (HPLC)</td></tr><tr><td>PolymerX, korrelgrootte 10&mu;m, 250x10 mm</td><td>Phenomenex Ltd. Germany</td><td>00G-4328-N0</td><td>Poreuze polystyreen divinylbenzeen HPLC kolom</td></tr><tr><td>Milli-Q Advantage A10, met een Milli-Q filter</td><td>EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA</td><td>LCPAK0001</td><td>Water zuiveringssysteem</td></tr><tr><td>Filtratie unit</td><td>Sartorius Stedtim (Aubagne, France)</td><td>16307</td><td>Filtratie unit voor peptide precipitatie</td></tr><tr><td>UPLC Aquity met UV Detector</td><td>Waters, Milford Massachusetts, USA</td><td>M09UPA 664M</td><td>Analytische omgekeerde fase ultra HPLC voor LC-MS</td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC BEH C18, korrelgrootte 1.7 &mu;m, 50x2.1 mm</td><td>Waters, Milford Massachusetts, USA</td><td>186002350</td><td>Analytische C18 kolom</td></tr><tr><td>ACQUITY TQ Detector</td><td>Waters, Milford Massachusetts, USA</td><td>QBB908</td><td>Elektrospray ionisatie massa spectrometrie (ESI-MS)</td></tr><tr><td>CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6</td><td>Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany</td><td>16706, 101542</td><td>Lyofilisator met vacuümpomp</td></tr><tr><td>Paradigm plate reader</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MESAB (ethyl-m-aminobenzoaat methaansulfonaat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Sarstedt</td><td>821.472</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat-gebufferd zout oplossing</td><td>Life Technologies, GIBCO</td><td>10010-056</td><td></td></tr><tr><td>Naald</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305178</td><td></td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Olympus, Leica, Zeiss</td><td>Varies met de fabrikant</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Pincetten</td><td>World Precision Instruments</td><td>501985</td><td></td></tr><tr><td>Gillies Dissectietang</td><td>World Precision Instruments</td><td>501265</td><td></td></tr><tr><td>Glas injectie capillairen</td><td>World Precision Instruments</td><td>TWF10</td><td></td></tr><tr><td>PicoNozzle</td><td>World Precision Instruments</td><td>5430-12</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatische PicoPump</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>Ring verlichter; Ringlichtgeleider</td><td>Parkland Scientific</td><td>ILL-RLG</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr></tbody></table>

modelleren van amyloid-β42 toxiciteit en neurodegeneratie in volwassen zebrafish hersenen

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

De ziekte van Alzheimer (AD) is een slopende neurodegeneratieve ziekte in welke accumulatie van giftige amyloid-β42 (Aβ42) peptiden leidt tot synaptic degeneratie, ontsteking, neuronale dood, en leren van tekorten. Mensen kunnen niet verloren neuronen in het geval van AD ten dele als gevolg van verminderde proliferatieve capaciteit van de neurale stamcellen/voorlopercellen (NSPCs) en de verlaagde neurogenese regenereren. Daarom, efficiënte regeneratieve therapie moeten ook het versterken van de proliferatie neurogene capaciteit van NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) is een regeneratieve organisme, en we kunnen leren van de fundamentele moleculaire programma's waarmee we kunnen ontwerpen therapeutische benaderingen aan te pakken van AD. Om deze reden was de generatie van een AD-achtig model in zebrafish noodzakelijk. Met behulp van onze methodologie, kunnen we introduceren synthetische derivaten van Aβ42 peptide met weefsel indringend vermogen in het brein van volwassen zebrafish, en analyseren van de pathologie van de ziekte en de regeneratieve reactie. Het voordeel ten opzichte van de bestaande methoden of dierlijke modellen is dat zebrafish kan ons leren hoe een gewervelde brein kan natuurlijk regenereren, en dus helpen ons voor de behandeling van menselijke neurodegeneratieve ziekten beter richten op endogene NSPCs. Dus, het model van de amyloid-toxiciteit vastgesteld in de hersenen van volwassen zebrafish kan openen nieuwe mogelijkheden voor onderzoek op het gebied van de neurowetenschappen en klinische geneeskunde Bovendien is de eenvoudige uitvoering van deze methode zorgt voor kosteneffectieve en efficiënte experimentele evaluatie. Dit manuscript beschrijft de synthese en de injectie van Aβ42 peptiden in zebrafish hersenen.

HPLC werd gebruikt voor het zuiveren van de gesynthetiseerde peptide en massaspectrometrie is gebruikt voor het karakteriseren van de gezuiverde amyloïde β-peptiden. De HPLC-kolom werd verwarmd tot 50 ° C om de scheiding van de Aβ peptiden en alle fracties werden verzameld. Om te identificeren van de correct samengestelde peptide, werd massaspectrometrie analyse uitgevoerd voor alle fracties. Het chromatogram UPLC toont de zuiverheid van de stof. De HPLC-fractie dat leverde één piek op de...

Dit protocol beschrijft de synthese, karakterisering en injectie van monomeer amyloid-β42 peptiden voor het genereren van amyloïde toxiciteit in volwassen zebrafish om een model van de ziekte van Alzheimer, gevolgd door histologische analyses en detectie van samenvoegingen.

Modelleren van Amyloid-β42 toxiciteit en neurodegeneratie in volwassen Zebrafish hersenen

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Het algemene doel van deze methode is om amyloïde bèta 42-peptiden te synthetiseren en deze in de hersenen van volwassen zebravisjes te injecteren, om zo een specifiek model van amyloïde doses te genereren zoals wellicht gezien bij de ziekte van Alzheimer. Deze methode kan ons helpen om belangrijke vragen binnen het neurowetenschappelijke veld te beantwoorden, zoals het effect van amyloïde-toxiciteit op neurale stamcellen en hoe we de rejuvenatierespons kunnen opwekken onder dergelijke nadelige omstandigheden. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat deze betrouwbaar is, reproduceerbaar is en dat de fenotypes die we verkrijgen sterk doen denken aan de ziekte van Alzheimer in menselijke hersenen.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van de ziekte van Alzheimer, omdat het een natuurlijk gewervdenmodel biedt dat in staat is om neurale stamcellen te activeren onder ziektecondities; zebrafish kunnen ons daarom leren hoe neurodegeneratie kan worden hersteld. Om het amyloïde bèta 42-peptide te bereiden, laad een automatische peptidesynthesizer met 500 milligram FMOC-beschermde hars als vaste fase. Laad vervolgens 0,5 molair opgeloste FMOC-bescherm

modeling-amyloid-42-toxicity-neurodegeneration-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In this video, fertilized zebrafish embryos are dechorionated under a stereo microscope and then exposed to a cholesterol synthesis inhibitor, leading to the development of blood vessel ruptures and brain hemorrhages in the larvae. Hemorrhagic larvae, identifiable by distinct red spots, are subsequently separated under a microscope for further analysis.

Modeling Drug-Induced Hemorrhage in Zebrafish Larva

This video demonstrates the procedure of injecting monomeric amyloid peptides into the forebrain of adult zebrafish to generate amyloid toxicity, mimicking the neuronal damage seen in Alzheimer's...

Establishing an Alzheimer&#39;s Disease Model in Zebrafish Brain Through Amyloid Peptide Injection

Hier presenteren we een systematische aanpak voor het ontwikkelen van fysiologisch relevante, gevoelige en...

In vivo modellering van de Morbid Human Genome behulp Danio rerio

Gegevensmanipulaties om gerichte stress of dood in individuele cellen te veroorzaken, zijn relatief moeilijk te bereiken. Hier wordt een ablatie-aanpak met een resolutie van één cel beschreven om selectief stress te veroorzaken en individuele cellen in celkweek en levende dieren te doden, gebaseerd op een standaard confocale UV-laser.

Triggering Cell Stress en Dood met behulp van conventionele uv laser confocale microscopie

Dit werk beschrijft methodes om acute en chronische hyperglycemie modellen in zebravis te bepalen. Het doel is om de invloed van hyperglycemie op fysiologische processen te onderzoeken, zoals constitutieve en schade-geïnduceerde neurogenese. Het werk benadrukt ook het gebruik van zebravis om radioactieve gelabelde moleculen te volgen (hier, [ 18 F] -FDG) met behulp van PET / CT.

Acute en chronische modellen van hyperglycemie bij zebravis: een methode om de impact van hyperglycemie op neurogenese te beoordelen en de biodistributie van radiolabelde moleculen

We presenteren een gedragskamer die is ontworpen om cognitieve prestaties te beoordelen. We verstrekken gegevens waaruit blijkt dat zebravissen, eenmaal verworven, de taak 8 weken later onthouden. We tonen ook aan dat hyperglycemische zebravissen de cognitieve prestaties hebben veranderd, wat aangeeft dat dit paradigma van toepassing is op studies die cognitie en geheugen beoordelen.

De driekamerkeuzegedragstaak met Zebrafish als modelsysteem

We hebben het Marmarou-gewichtsverliesmodel voor volwassen zebravissen aangepast om een breed scala aan pathologieën te onderzoeken na traumatisch hersenletsel met stompe kracht (TBI) en de mechanismen die ten grondslag liggen aan de daaropvolgende neuronale regeneratie. Dit Botte kracht TBI-model is schaalbaar, induceert een milde, matige of ernstige TBI en vat heterogeniteit van letsel samen die wordt waargenomen bij menselijke TBI.

Een schaalbaar model om de effecten van blunt-force letsel bij volwassen zebravissen te bestuderen

Leren en geheugen zijn krachtige maatstaven bij het bestuderen van ontwikkelings-, ziekteafhankelijke of door het milieu veroorzaakte cognitieve stoornissen. De meeste cognitieve beoordelingen vereisen gespecialiseerde apparatuur en uitgebreide tijdsbestedingen. De shuttle box assay is echter een associatief leermiddel dat een conventionele gelbox gebruikt voor een snelle en betrouwbare beoordeling van de cognitie van volwassen zebravissen.

Shuttle Box Assay als een associatief leermiddel voor cognitieve beoordeling bij leer- en geheugenstudies met behulp van volwassen zebravissen

Dit protocol demonstreert de micro-injectie van lipopolysaccharide in het ventriculaire gebied van de hersenen in een zebravislarvemodel om de resulterende neuro-inflammatoire respons en neurotoxiciteit te bestuderen.

Hersenventrikelmicro-injecties van lipopolysaccharide in larvale zebravissen om neuro-inflammatie en neurotoxiciteit te beoordelen

Het doel van het huidige protocol is om de stappen te schetsen die nodig zijn om een sociale voorkeurstest voor volwassen zebravissen op te zetten en te gebruiken en aan te tonen dat deze kan worden gebruikt om door ethanol geïnduceerde sociale defecten te karakteriseren.

Modellering van foetale alcoholspectrumstoornissen bij zebravissen om de impact van een ongunstige embryonale omgeving op het sociale gedrag van volwassenen te karakteriseren

Dit protocol biedt een gestandaardiseerde, high-throughput verbindingsscreeningsmethode waarbij in vivo zebravissen worden gebruikt om dopaminerge neuronverlies en bewegingsgedragsproblemen te kwantificeren, waardoor efficiënte screening van neuroprotectieve verbindingen mogelijk is.

In vivo fenotypering van dopaminerge neurodegeneratie in zebravislarven met behulp van gedragsanalyse en beeldvorming met hoge inhoud

Leer hoe je amyloïde-β42 peptiden synthetiseert en injecteert in volwassen zebrafish om een model voor Alzheimer te creëren. Deze methode onderzoekt de toxiciteit van amyloïde op neurale stamcellen.

Modelleren van Amyloid-β42 toxiciteit en neurodegeneratie in volwassen Zebrafish hersenen

Meer video's verkennen