Isolatie van endotheliale voorlopercellen van menselijke navelstrengbloed

Het algemene doel van deze procedure is om endotheel voorlopercellen te isoleren uit menselijk navelstrengbloed. Deze methode beschrijft de isolatie van endotheel voorlopercellen uit navelstrengbloed voor hun potentiële gebruik als autologe cellen voor de weefselengineering van vasculaire transplantaten. Het grote voordeel van deze techniek is dat de isolatieprocedure kan worden uitgevoerd in gespecialiseerde media zonder de noodzaak van enige aminosortering.

De geïsoleerde endotheel voorlopercellen kunnen worden gebruikt om neovascularisatie te bestuderen, en rapporten hebben ook gesuggereerd dat deze cellen kunnen worden gebruikt als biomarkers om patiënten met risico op hart- en vaatziekten te identificeren. Voordat u begint met de isolatieprocedure, bedek zes welborden vooraf met twee milliliter vers bereide rattenstaart een collageenoplossing per put. Breng de plaat in evenwicht in een 37 graden Celsius en 5% CO2-incubator gedurende ten minste een uur.

Verdun vervolgens ongeveer 25 milliliter navelstrengbloed met HBSS in een een-op-een-concentratie. Voeg vervolgens 20 milliliter dichtheidsgradiënt mediumreagens toe aan een 50 milliliter conische buis en giet voorzichtig 20 milliliter verdund navelstrengbloed langs de wand van de buis om het bloed op het medium te plaatsen. Scheid de cellen door centrifugatie, gevolgd door zorgvuldige verwijdering van de plasmalaag.

Gebruik een spuit met een 18-gauge naald om de mononucleaire cel bevattende buffycoat in een nieuwe 50 milliliter buis te verzamelen. Voeg een gelijk volume van endotheel basaal medium toe aan de cellen. Was de cellen door centrifugatie en lyseer de rode bloedcellen in de resulterende palate met vijf milliliter ammoniumchloride-oplossing op ijs.

Na vijf tot 10 minuten met af en toe schudden, verzamel de cellen door centrifugatie en resuspendeer het witte pellet in vers endotheelgroeimedium. Na het tellen, zuig het collageen uit elke put van de zes puttenplaat en was de putten drie keer in PBS. Zaai de mononucleaire cellen met een eenmaal 10 tot de zevende cellen per twee milliliter medium per put concentratie.

En breng de plaat terug naar de incubator gedurende 24 uur. De volgende dag, spoel de cellen een keer met vers endotheelgroeimedium. Vervang vervolgens de was met drie milliliter vers endotheelgroeimedium en breng de cellen terug naar de celkweekincubator.

Gebruik een helderveldmicroscoop om dagelijks beelden van de cellen te verkrijgen om de voortgang van de endotheelcelkolonies te controleren, markeer de platen waar de kolonies ontstaan om hun groei te volgen. Wanneer de endotheelcelkolonies ongeveer drie millimeter groot worden, bedek een T25-kweekfles met vers rattenstaart een collageen gedurende ten minste een uur in de celkweekincubator. Verzamel vervolgens de cellen met 150 microliter 0,05% Trypsin-EDTA per put in de celkweekincubator gedurende twee tot drie minuten.

Tik voorzichtig op de plaat om de gehechte cellen los te maken. Wanneer de cellen beginnen los te komen, voeg onmiddellijk twee milliliter vers endotheelgroeimedium toe en trek de cellen in een enkele 15 milliliter conische buis. Verzamel de cellen door centrifugatie en resuspendeer het pellet in vers endotheelgroeimedium.

Na het tellen, zaai de cellen in de collageen-gecoate fles met een vijfmaal 10 tot de vijfde cellen in drie milliliter medium per fles dichtheid, en markeer de fles als passage een. Breng vervolgens de fles terug naar de incubator en zaai de cellen opnieuw wanneer de kolonie 90% confluentie bereikt. Na zaaien op de met collageen behandelde platen, wordt de eerste kolonie uitgroeiing meestal waargenomen tussen dag vijf tot negen.

De kolonies blijven groeien en verwerven in de vroege stadia van de cultuur een spindelvormige celmorfologie, die later overgaat in een mozaïekachtige morfologie. Het totale aantal cellen dat bij elke passage wordt geoogst, neemt in directe correlatie toe met het totale aantal dagen in cultuur. Western blot-analyse onthult een vroege expressie van CD 31 en CD 34 door de gekweekte endotheelcellen, die lijkt af te nemen met opeenvolgende passagering.

De expressie van vasculair endotheelgroeifactor receptor twee echter, wordt gehandhaafd over tijd, hoewel op een iets lager niveau van expressie dan dat waargenomen na de eerste passage. Opmerkelijk is dat endotheel voorlopercellen niet positief zijn voor de mesenchymale celmarker alfa gladde spieractine, in tegenstelling tot bijvoorbeeld klepinterstitiële cellysaat, die kan worden opgenomen als een positieve controle. De volledige isolatieprocedure kan in minder dan vijf uur worden voltooid, afhankelijk van de verkregen navelstrengbloedeenheid.

Na het isoleren en zaaien van de mononucleaire cellen in endotheelgroeimedium, duurt het meestal tussen vijf en negen dagen voordat de EPC-kolonies in de cultuur verschijnen. De voorgestelde isolatiemethode gebruikt gespecialiseerd medium voor het kweken van de endotheel voorlopercellen en vermijdt het gebruik van een flowcytometer, voor zover vereist voor het hebben van endotheelmarkers. Deze methode biedt ook een efficiënt protocol voor het verkrijgen van grote hoeveelheden endotheel voorlopercellen over een korte periode.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u endotheel voorlopercellen kunt isoleren uit menselijke navelstrengbloedeenheden. Vergeet niet dat menselijk navelstrengbloed gevaarlijk kan zijn, en de juiste verwijdering van afgevallen bloed en celkweekproducten moet worden gevolgd.