Bepaling van Sialic Acids in Lever en Melk Monsters van Wild-type en

Het algemene doel van deze methodologie is de detectie van N-acetylneuraminzuur en N-glycolylneuraminzuur in de lever en melk van wild-type en CMAH knock-out muizen met behulp van HPLC-analyse. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen in het veld van de glycoscience, specifiek het effect dat genotypes van CMAH-muismodellen hebben op de werkelijke sialinezuurgehaltes van deze dieren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van genetische screenings is dat relatieve sialinezuurspiegels ook voor heterozygote muizen bepaald kunnen worden.

Deze methode zal worden uitgevoerd door Cui Cao en Wang Wenjiao, twee promovendi uit ons laboratorium. Begin deze procedure met het verzamelen van muisuitmelk en leverweefsel van CMAH knock-out muizen, zoals beschreven in het tekstprotocol. Om sialinezuren uit de melk te isoleren, brengt u 50 µL melk over in een centrifugebuis van 1,5 mL en voegt u 1,2 mL van de bereide waterige azijnzuuroplossing toe.

Om sialinezuren uit leverweefsel te isoleren, ontdooi voorzichtig 20 tot 50 milligram muizenlever en breng dit over in een Dounce-weefselhomogeniseerder. Voeg 1,2 milliliter van de waterige azijnzuuroplossing toe en homogeniseer het weefsel door 10 seconden lang voorzichtig te scheren. Breng de resulterende suspensie over in een centrifugebuis van 1,5 milliliter.

Incubeer vervolgens de verzure melk of weefselsuspensie gedurende vier uur bij 80 °C. Centrifugeer het monster daarna 10 minuten bij 14.000 ×g. Draag de bovenste 1000 µL van het supernatant over naar een nieuwe centrifugebuis van 1,5 mL.

Verwijder het oplosmiddel door centrifugale verdamping bij kamertemperatuur tot volledige droogte. Los het monster opnieuw op in 500 microliters gedestilleerd water. Bereid vervolgens een microanionenuitwisselingskolom voor door 200 milligram anionenuitwisselingshars per monster over te brengen naar lege buizen van 3 milliliter met een bevestigde stopkraan.

Voeg 2 milliliters van de waterige azijnzuuroplossing toe om de chloride-ionen in de hars te vervangen door acetaat-ionen. Sluit de stopkraan zodra het oplosmiddel de bovenkant van de hars bereikt. Voeg voorzichtig 2 milliliters gedestilleerd water toe en open de stopkraan.

Stop de doorstroming zodra het grootste deel van het oplosmiddel de bovenkant van de hars bereikt. Zorg ervoor dat de hars altijd bedekt is met oplosmiddel. Was vervolgens de harskolom nog twee keer met twee milliliters gedestilleerd water om het overtollige acetaat te verwijderen.

Breng de resulterende 500 µL van het monsteroplosmiddel over op de harskolom en gooi de doorloop weg. Was de hars voorzichtig met 2 mL gedestilleerd water. Elueer de monsteranionen van de hars met 1 mL van een 50 mM ammoniumacetaatoplossing in een centrifugebuis van 1,5 mL.

Verwijder het oplosmiddel door centrifugale evaporatie bij kamertemperatuur tot droogheid. Weeg tussen de 5 en 8 milligram N-acetylneuraminzuur op een analytische balans af in een centrifugebuis van 1,5 milliliter. Noteer het exacte gewicht en voeg 164 microliters gedestilleerd water toe per milligram.

Verkrijg N-glycolylneuraminzuur in kleinere hoeveelheden tegen een redelijke prijs, bijvoorbeeld in aliquots van 1 milligram. Voeg 154 microliters gedestilleerd water direct toe aan de verbinding om een voorraadoplossing van ongeveer 20 millimolair Neu5Gc te verkrijgen. Overbreng de oplossing naar een centrifugebuis van 1,5 milliliter.

Deze oplossing kan tot 12 maanden worden bewaard bij -20 °C. Breng 5 µL van elke voorraadoplossing over in een nieuw centrifugebuisje van 1,5 ml. Verwijder vervolgens het oplosmiddel door centrifugale verdamping bij kamertemperatuur tot volledige droogte.

Voeg 20 µL van de OPD-oplossing toe aan de sialinezuurmonsters afkomstig van muis melk, muizenlever of de gemengde sialinezuurstandaard. Vortex het monster krachtig gedurende 30 seconden. Incubeer de monsters vervolgens vier uur lang bij 80 °C in het donker.

Laat de monsters vijf minuten afkoelen en voeg vervolgens 80 µL gedestilleerd water toe. Centrifugeer de buisjes daarna één minuut lang bij 14.000 ×g. Draag vervolgens 80 µL van de supernatant over naar een HPLC-vial van 300 µL met hoge recoverie.

De gederivatiseerde sialinezuurmonsters kunnen gedurende maximaal één week worden bewaard bij vier tot zes graden Celsius. Analyseer de monsters met een standaard HPLC-systeem dat is verbonden met een online fluorescentiedetector. Gebruik voor de analyse een reversed-phase C18-kolom met een lengte van 250 millimeter en een diameter van 4,6 millimeter.

Nadat oplosmiddel A en oplosmiddel B zijn voorbereid en de HPLC-run is ingesteld zoals gedetailleerd in het protocol, injecteert u 50 µL van de monsteroplossing in het HPLC-systeem. Monitor het eluaat met de fluorescentiedetector bij een excitatiegolflengte van 373 nm en een emissiegolflengte van 448 nm. Bereken ten slotte de relatieve hoeveelheid Neu5Gc zoals beschreven in het tekstprotocol.

Hier worden representatieve HPLC-chromatogrammen getoond van fluorescentie-gelabelde sialinezuren uit melkmonsters, afkomstig van homozygote knock-out CMAH-muizen en heterozygote knock-out CMAH-muizen. Wild-type muizen worden ook weergegeven. Op dezelfde wijze worden hier chromatogrammen getoond van fluorescentie-gelabelde sialinezuren afkomstig uit de lever van de muis.

Een vergelijking van de relatieve hoeveelheden Neu5Gc laat zien dat homozygote CMAH knock-out muizen geen Neu5Gc bevatten, terwijl heterozygote CMAH knock-outs en wild-type muizen tussen de 10 en 75% Neu5Gc bevatten. Wanneer de methode onder de knie is, kunnen monsters binnen acht uur worden voorbereid, mits de procedure correct is uitgevoerd. Daarnaast kunnen de monsters 's nachts via HPLC-autosampling worden geanalyseerd.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken de isolatie van sialinezuur en de derivatiseringsprocedure op dezelfde dag uit te voeren. Na de procedure kunnen andere methoden, zoals massaspectrometrische analyse, worden uitgevoerd om de aard van de verkregen fluorescentiesignalen te bevestigen. De ontwikkeling van deze techniek stelt onderzoekers in staat om de distributie van sialinezuur in biologische monsters te onderzoeken.

Vergeet niet dat werken met geconcentreerd azijnzuur en mierenzuur extreem gevaarlijk kan zijn, en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van beschermende kleding, tijdens het uitvoeren van deze procedure.