Name: Bepaling van Sialic Acids in Lever en Melk Monsters van Wild-type en CMAH Knock-out Muizen. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Leer hoe u sialinezuren in lever en melk van CMAH knock-out muizen detecteert met HPLC-analyse. Deze methode maakt kwantificering van N-acetylneuraminezuur en N-glycolylneuraminezuur mogelijk voor glycoscience-onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Natuurwetenschappelijke Stichting van China (subsidie ​​nummers 31471703, A0201300537 en 31671854 voor JV en LL) en het 100 Foreign Talents Plan (subsidienummer JSB2014012 tot JV).

Procedures waarbij dieren betrokken zijn, zijn goedgekeurd door het Ethisch Comité van het Experimentele Dierscentrum van de Landbouwuniversiteit van Nanjing overeenkomstig de nationale richtlijnen voor experimentele dierenwelzijn (Ministerie van Wetenschap en Technologie, PR van China, 2006) bij de dieren in een SPF Faciliteit (toestemming ID: SYXK-J-2011-0037). 1. Cmah Knock-out Muis Model <ol><li> Gebruik wildtype C57Bl / 6 muizen van het Comparative Medicine Center van Yangzhou University (China). OPMERKING: Cmah knock-out muizen werden gegenereerd op basis van de informatie die werd verstrekt uit eerdere Cmah knock-out studies 17 , 19 en commercieel verkregen met behulp van een CRISPR / Cas9 20 strategie door 92 basisparen uit exon 6 van het Cmah gen te verwijderen, dat ook Verwijderd in het humane CMAH gen 19 . Positieve F 0 &lt;/ sub&gt; -mice (2 personen) werden gekruist met wild type muizen heterozygote F1 -mice verkrijgen. Na het passeren heterozygote F1 -mice (5 personen) kan CMAH homozygote knock-out F2 -mice succes verkregen (3 individuen). </li><li> Voer genotypering van muizen uit door middel van genomisch DNA volgens de methode die wordt getoond door Zangala 21 onder gebruikmaking van een commerciële DNA zuiveringsset. <ol><li> Versterk een overeenkomstig DNA-fragment van het Cmah- gen door gebruik te maken van commercieel DNA-polymerase en het primerpaar 5&#39;gaaagggctcggctctgtgtgaga3 &#39;en 5&#39;tttaaaatgtcccgggtgagaagc3&#39;. Voer de genamplificatie uit met behulp van 34 PCR cycli die bestaan ​​uit denaturatie bij 40 ° C bij 94 ° C, annealing bij 63 ° C gedurende 40 seconden en verlenging bij 72 ° C gedurende 1 minuut. </li><li> Visualiseer PCR-producten op een 1% agarosegel. Men zou een enkele band (0,5 kb) moeten observeren voor het wildtype individu, een dubbele band (0,4 en 0,5 kb) voor deHeterozygote knock-out individu en een enkele band (0,4 kb) voor het homozygote uitschakel-individu. </li></ol></li></ol> 2. Sample Collection <ol><li> Verzamel muismelk met behulp van het protocol beschreven door Willingham et al. 22 . </li><li> Verzamel de leverweefsel van de muis door gebruik te maken van het protocol beschreven door Gonçalves et al. 23 en monsters opslaan bij -80 ° C. </li></ol> 3. Isolatie van Sialic Acids uit Melk <ol><li> Bereiden 100 ml van een 2 M azijnzuur door toevoeging van 12 ml ijsazijn in 88 ml gedestilleerd H2O </li><li> Breng 50 μl melk in een 1,5 ml centrifugebuis en voeg 1,2 ml van de bereide waterige azijnzuuroplossing toe. </li><li> Incubeer de suspensie gedurende 4 uur bij 80 ° C en centrifugeer het monster bij 14.000 xg gedurende 10 minuten. </li><li> Breng de bovenste 1000 μL van de supernatant over in een verse 1,5 ml centrifugebuis en remOve het oplosmiddel door middel van centrifugale verdamping bij kamertemperatuur om droogheid te voltooien (afhankelijk van de bijgevoegde vacuümpomp neemt dit 4 - 20 uur). Opnieuw oplossen van het monster in 500 pl gedestilleerd H2O </li><li> Bereid een micro-anion uitwisselingskolom op. Deze stap zal specifiek anionische verbindingen verrijken en kationische en neutrale verbindingen uit de melk- en levermonsters verwijderen en verhoogt daarom de selectiviteit van het fluorogene OPD-etiketteringsmiddel voor sialzuur derivatisatie. <ol><li> Breng voor elk monster 200 mg van de anionuitwisselingshars (Dowex 1X8) in lege 3 ml kolombuizen met een bijgeleverde stopcock. </li><li> Voeg 2 ml van de waterige azijnzuuroplossing bereid in stap 3.1 toe om de chloride-ionen in de hars te vervangen door acetaationen. Sluit de stopkraan zodra het oplosmiddel de bovenkant van de hars bereikt. </li><li> Voeg 2 ml gedestilleerde H 2 O voorzichtig toe, open de stopcock en stop de stroom zodra het meeste oplosmiddel bereiktDe top van de hars. Zorg ervoor dat de hars altijd bedekt is met oplosmiddel. </li><li> Was de harskolom twee maal met 2 ml gedestilleerd H2O ter verwijdering van de overmaat acetaat. </li></ol></li><li> Breng de resulterende 500 μl monsteroplosmiddel uit stap 3.4 over. Op de harskolom en verwijder de doorstroming. Voorzichtig te wassen van het hars met 2 ml gedestilleerd H2O Elueer de monster-anionen uit de hars met gebruik van 1 ml van een 50 mM ammoniumacetaatoplossing (386 mg ammoniumacetaat opgelost in 100 ml gedestilleerd H2 O) in een 1,5 mL Centrifuge buis. Verwijder het oplosmiddel door middel van centrifugale verdamping bij kamertemperatuur tot droogheid. OPMERKING: Droge monsters kunnen tot 12 maanden bij 4-6 ° C worden opgeslagen. </li></ol> 4. Isolatie van Sialic Acids uit Leverweefsel <ol><li> Ontdooi 20 tot 50 mg muislever voorzichtig en verplaats het in een Dounce weefselmolen (1 ml of 2 ml volume). Voeg 1,2 ml van de waterige azijnzuuroplossing toeBereid in stap 3.1 en homogeniseren het weefsel door zacht scheren gedurende 10 s. Breng de resulterende suspensie over in een 1,5 ml centrifugebuis. </li><li> Volg stappen 3.3. Naar 3.6. OPMERKING: Droge monsters kunnen tot 12 maanden bij 4-6 ° C worden opgeslagen. </li></ol> 5. Bereiding van een Mixed Sialic Acid Standard <ol><li> Weeg tussen 5 - 8 mg N-acetylneuraminezuur op een analytische balans in een 1,5 ml centrifugebuis. Let op het exacte gewicht en voeg 164 μL gedestilleerde H 2 O toe voor elke mg ( dwz als het gewicht van Neu5Ac 7,2 mg is en voeg dan 7,2 x 164 = 1, 181 μl gedestilleerde H 2 O) toe. Dit resulteert in een 20 mM Neu5Ac voorraadoplossing die gedurende maximaal 12 maanden bij -20 ° C kan worden opgeslagen. </li><li> Verkrijg N-glycolylneuraminezuur in kleinere hoeveelheden tegen een gematigde prijs, zoals in 1 mg porties. Voeg 154 ul gedestilleerd H2O direct naar verbinding om een ~ 20 mM Neu5Gc voorraadoplossing te verkrijgen. Verplaats deOplossing in een 1,5 ml centrifugebuis. Deze oplossing kan maximaal 12 maanden bij -20 ° C worden opgeslagen. </li><li> Combineer 5 μl van elke voorraadoplossing van stap 5.1 en 5.2 in een verse 1,5 ml centrifugebuis en verwijder het oplosmiddel door middel van centrifugale verdamping bij kamertemperatuur tot droogheid. OPMERKING: De gemengde sialinezuurstandaard kan maximaal 12 maanden bij 4 - 6 ° C worden opgeslagen. </li></ol> 6. Fluorescentie Derivatisatie van Sialic Acids <ol><li> Bereid 10 ml OPD-oplossing, bestaande uit 100 mg o-fenyleendiamine en 208 mg natriumwaterstofsulfiet in 10 ml gedestilleerd H2O </li><li> Voeg 20 μL OPD-oplossing toe aan de siaalzuurmonsters afgeleid van muismelk (stap 3), muizenlever (stap 4) of de gemengde sialinezuurstandaard (stap 5). Vortex krachtig gedurende 30 s en incubateer monsters gedurende 4 uur bij 80 ° C in het donker ( dwz wikkel de microtubes in aluminiumfolie). </li><li> Laat de monsters 5 minuten afkoelen, voeg 80 μm toe, L gedestilleerd H2O en centrifugeer de buizen bij 14.000 xg gedurende 1 minuut. </li><li> Breng 80 μl van de supernatant over in een 300 μL HPLC-injectie met hoge herstelfunctie. De afgeleide sialinezuurmonsters kunnen gedurende maximaal een week bij 4 - 6 ° C worden opgeslagen. </li></ol> 7. HPLC Analyse van Sialic Acid Derivatives <ol><li> Analyseer de monsters met behulp van een standaard HPLC systeem aangesloten op een online fluorescentiedetector. </li><li> Gebruik een omgekeerde fase C18 kolom met de standaard afmetingen van 250 mm lengte en 4,6 mm diameter voor de analyse. </li><li> Bereid oplosmiddel A op door 200 ml voorraadoplossing te verdunnen met 800 ml LCMS-gehalte water (LCMS - vloeistofchromatografie massaspectrometrie). De voorraadoplossing zelf kan als volgt worden bereid: <ol><li> Voeg 46 g mierenzuur toe aan 800 ml LCMS-gehalte H 2 O. </li><li> Pas de pH op bij 4,5 druppelsgewijs toevoeging van ammoniumhydroxideoplossing (puriss. Pa). </li><li> Breng het oplosmiddel over naar aMeetcilinder en vul tot 1000 ml met LCMS-klasse H 2 O. Deze voorraadoplossing kan gedurende maximaal 3 maanden bij 4 - 6 ° C worden opgeslagen. </li></ol></li><li> Voor oplosmiddel B gebruik LCMS-gehalte acetonitril. </li><li> De derivaten van sialiczuren scheiden bij een stroom van 1 ml / min met de volgende gradiëntelutatie: <ol><li> Begin door 10% van oplosmiddel B gemengd aan oplosmiddel A toe te voegen. </li><li> Van 0 min tot 15 min verhoogt het percentage oplosmiddel B geleidelijk met een lineair gradiënt tot 60%. </li><li> Van 15 min tot 16 min verhoogt het aandeel oplosmiddel B snel met een lineair gradiënt van 60% tot 90%. Dit initieert de was van de HPLC kolom. </li><li> Om de HPLC-kolom verder te wassen, houd het niveau van oplosmiddel B op 90% tussen 16 minuten en 18 minuten voordat u het niveau van oplosmiddel B opnieuw tot 10% tussen 18 minuten en 19 minuten geleidelijk verlaagt. </li><li> Herkwilibreer HPLC-kolom aan de startomstandigheden van 10% B tussen 19 en 24 min. </li></ol></li><li> In50 μL monster in het HPLC-systeem brengen. </li><li> Monitor eluenten met behulp van de excitatie- / emissiegolflengten van de fluorescentiedetector van 373/448 nm, en de afgeleide sialinezuren kunnen worden verwacht bij de geschatte retentietijden van 9 minuten (voor Neu5Gc-OPD) en 10 minuten (voor Neu5Ac-OPD). </li><li> Bereken de relatieve hoeveelheid Neu5Gc (F Neu5Gc ) van de fluorescentiepiekarea&#39;s van de Neu5Ac (A Neu5Ac ) en Neu5Gc (A Neu5Gc ) als volgt: F Neu5Gc [%] = 100 × A Neu5Gc / (A Neu5Ac + A Neu5Gc ). Bij de melk- en levermonsters van de homozygote Cmah- knock-out muis F Neu5Gc dient 0% te zijn, terwijl de waarden voor F Neu5Gc van heterozygote en wilde-type muizen sterk kunnen variëren afhankelijk van de leeftijd van de muis en het weefseltype (tussen 2% En&gt; 90%) met de verwachte foutmarges van ± 12%. </li></ol>

<ol><li>Lamari, F. N., Karamanos, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+methods+for+sialic+acids+and+critical+evaluation+of+their+biologic+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Separation methods for sialic acids and critical evaluation of their biologic relevance.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 781 (1-2), 3-19 (2002).</li>
<li>Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+for+the+absence+of+N-glycolylneuraminic+acid+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans.</a> J Biol Chem. 273 (25), 15866-15871 (1998).</li>
<li>Chou, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+in+human+CMP-sialic+acid+hydroxylase+occurred+after+the+Homo-Pan+divergence%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A mutation in human CMP-sialic acid hydroxylase occurred after the Homo-Pan divergence.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (20), 11751-11756 (1998).</li>
<li>Rehan, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Scale+Glycomics+of+Livestock%3A+Discovery+of+Highly+Sensitive+Serum+Biomarkers+Indicating+an+Environmental+Stress+Affecting+Immune+Responses+and+Productivity+of+Holstein+Dairy+Cows%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Large-Scale Glycomics of Livestock: Discovery of Highly Sensitive Serum Biomarkers Indicating an Environmental Stress Affecting Immune Responses and Productivity of Holstein Dairy Cows.</a> J Agric Food Chem. 63 (48), 10578-10590 (2015).</li>
<li>Wang, B., McVeagh, P., Petocz, P., Brand-Miller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+ganglioside+and+glycoprotein+sialic+acid+in+breastfed+compared+with+formula-fed+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Brain ganglioside and glycoprotein sialic acid in breastfed compared with formula-fed infants.</a> Am J Clin Nutr. 78 (5), 1024-1029 (2003).</li>
<li>Yao, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+sialic+acids+in+red+meat+by+UPLC-FLD+using+indoxylsialosides+as+internal+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Quantification of sialic acids in red meat by UPLC-FLD using indoxylsialosides as internal standards.</a> Glycoconj J. 33 (2), 219-226 (2016).</li>
<li>Nguyen, D. H., Tangvoranuntakul, P., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+natural+human+antibodies+against+a+nonhuman+sialic+acid+that+metabolically+incorporates+into+activated+and+malignant+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Effects of natural human antibodies against a nonhuman sialic acid that metabolically incorporates into activated and malignant immune cells.</a> J Immunol. 175 (1), 228-236 (2005).</li>
<li>Byres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+a+non-human+glycan+mediates+human+susceptibility+to+a+bacterial+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Incorporation of a non-human glycan mediates human susceptibility to a bacterial toxin.</a> Nature. 456 (7222), 648-652 (2008).</li>
<li>Hedlund, M., Padler-Karavani, V., Varki, N. M., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+human-specific+mechanism+for+diet+and+antibody-mediated+inflammation+in+carcinoma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Evidence for a human-specific mechanism for diet and antibody-mediated inflammation in carcinoma progression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (48), 18936-18941 (2008).</li>
<li>Tangvoranuntakul, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+uptake+and+incorporation+of+an+immunogenic+nonhuman+dietary+sialic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (21), 12045-12050 (2003).</li>
<li>Svennerholm, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+estimation+of+sialic+acids.+II.+A+colorimetric+resorcinol-hydrochloric+acid+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Quantitative estimation of sialic acids. II. A colorimetric resorcinol-hydrochloric acid method.</a> Biochim Biophys Acta. 24 (3), 604-611 (1957).</li>
<li>Warren, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thiobarbituric+acid+assay+of+sialic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The thiobarbituric acid assay of sialic acids.</a> J Biol Chem. 234 (8), 1971-1975 (1959).</li>
<li>Kakehi, K., Maeda, K., Teramae, M., Honda, S., Takai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+sialic+acids+by+gas+chromatography+of+the+mannosamine+derivatives+released+by+the+action+of+N-acetylneuraminate+lyase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Analysis of sialic acids by gas chromatography of the mannosamine derivatives released by the action of N-acetylneuraminate lyase.</a> J Chromatogr. 272 (1), 1-8 (1983).</li>
<li>Wheeler, S. F., Domann, P., Harvey, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivatization+of+sialic+acids+for+stabilization+in+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry+and+concomitant+differentiation+of+alpha%282+--%3E+3%29-+and+alpha%282+--%3E+6%29-isomers%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Derivatization of sialic acids for stabilization in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and concomitant differentiation of alpha(2 --> 3)- and alpha(2 --> 6)-isomers.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 23 (2), 303-312 (2009).</li>
<li>Hurum, D. C., Rohrer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+sialic+acids+in+infant+formula+by+chromatographic+methods%3A+a+comparison+of+high-performance+anion-exchange+chromatography+with+pulsed+amperometric+detection+and+ultra-high-performance+liquid+chromatography+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dairy+Sci%22%5BJournal%5D)">Determination of sialic acids in infant formula by chromatographic methods: a comparison of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection and ultra-high-performance liquid chromatography methods.</a> J Dairy Sci. 95 (3), 1152-1161 (2012).</li>
<li>Ito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+fluorometric+high-performance+liquid+chromatography+method+for+sialic+acid+determination%3A+an+internal+standard+method+and+its+application+to+sialic+acid+analysis+of+human+apolipoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22E.+Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">An improved fluorometric high-performance liquid chromatography method for sialic acid determination: an internal standard method and its application to sialic acid analysis of human apolipoprotein.</a> E. Anal Biochem. 300 (2), 260-266 (2002).</li>
<li>Naito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germinal+Center+Marker+GL7+Probes+Activation-Dependent+Repression+of+N-Glycolylneuraminic+Acid%2C+a+Sialic+Acid+Species+Involved+in+the+Negative+Modulation+of+B-Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation.</a> Mol Cell Biol. 27 (8), 3008-3022 (2007).</li>
<li>Manzi, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pressure+liquid+chromatography+of+sialic+acids+on+a+pellicular+resin+anion-exchange+column+with+pulsed+amperometric+detection%3A+a+comparison+with+six+other+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">High-pressure liquid chromatography of sialic acids on a pellicular resin anion-exchange column with pulsed amperometric detection: a comparison with six other systems.</a> Anal Biochem. 188 (1), 20-32 (1990).</li>
<li>Hedlund, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-glycolylneuraminic+acid+deficiency+in+mice%3A+implications+for+human+biology+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">N-glycolylneuraminic acid deficiency in mice: implications for human biology and evolution.</a> Mol Cell Biol. 27 (12), 4340-4346 (2007).</li>
<li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li>
<li>Zangala, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+genomic+DNA+from+mouse+tails%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of genomic DNA from mouse tails.</a> J Vis Exp. (6), e246(2007).</li>
<li>Willingham, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milk+collection+methods+for+mice+and+Reeves%27+muntjac+deer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Milk collection methods for mice and Reeves' muntjac deer.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li>
<li>Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+isolation+of+murine+hepatocytes+for+in+vitro+malaria+liver+stage+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies.</a> Malar J. 6, 169(2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het hierin gepresenteerde protocol laat de fenotypische beoordeling van homozygote Cmah- knock-out-muizen toe door de relatieve hoeveelheden Neu5Gc van melk- en levermonsters te analyseren en kwantificeren. De analyse werd uitgevoerd met behulp van een standaard HPLC setup met fluorescentiedetectie. De meest kritische stap van deze procedure is de bereiding van de anionuitwisselingszolen en het uitvoeren van de anionuitwisselingschromatografie; Om de hars goed te regelen en de juiste was- en elueringsf...

N-acetylneuraminezuur (Neu5Ac) en N-glycolylneuraminezuur (Neu5Gc) zijn de meest voorkomende sialinezuren bij de meeste zoogdieren 1 . Hoewel het mogelijk is om Neu5Ac endogeen te synthetiseren, kunnen mensen niet Neu5Gc produceren door een primaire exon deletie op het CMAH gen dat codeert voor een CMP-Neu5Ac hydroxylase 2 , 3 . Dierlijke voedingsmiddelen kunnen echter voedingsbronnen zijn van Neu5Gc 4 , 5 , 6 , wat leidt tot de productie van anti-Neu5Gc antilichamen en leidt daarom tot een immuunrespons tegen Neu5Gc 7 . Dit dieet effect van Neu5Gc wordt vermoedelijk bij te dragen aan chronische ontsteking en diverse andere aandoeningen 8 , 9 , 10 . Om de effecten van Neu5Gc in h te begrijpenUmans, is een diermodel voor de systematische studie van de effecten van voedselgedragen sialicuren zeer wenselijk. Hoewel protocols op basis van polymerase kettingreactie (PCR) voor het analyseren van knock-out muizen goed gevestigd zijn en een handige manier zijn voor de genotypische beoordeling, vereist de functionele analyse van fenotype op het metabolische niveau meer specifieke analysemethoden. Het fenotype van een Cmah knock-out muis model kan worden beoordeeld door het isoleren en analyseren van de samenstelling van sialinezuren in lever- of melkmonsters. Verscheidene methoden voor de detectie van sialinezuren in dierlijke weefsels zijn eerder gemeld: het reageren van sialzuren met resorcinol 11 of thiobarbituriczuur 12 resulteert in de vorming van een chromophorisch product en kan eenvoudig worden geanalyseerd met behulp van een platereader gebaseerde opstelling, maar alleen de totale sialische Zuurgehalte kan worden bepaald. Als alternatief werd ook de analyse van sialinezuren beschreven onder toepassing van gaschromatografie13 , MALDI-ToF-massaspectrometrie 14 of amperometrische methoden 15 . De meest gebruikelijke sialinezuuranalysemethoden zijn echter gebaseerd op hydrolytische afgifte, gevolgd door fluorescentiedivatisering en daaropvolgende vloeibare chromatografie 16 , 17 , 18 met hoge prestaties.

<table><tbody><tr><td>Chemicals:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-acetylneuraminic acid</td><td>Sigma</td><td>A0812</td><td></td></tr><tr><td>N-glycolylneuraminic acid</td><td>Sigma</td><td>50644</td><td>1 mg aliquot moet voldoende zijn</td></tr><tr><td>o-Phenylenediamine</td><td>Sigma</td><td>694975</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydrogen sulfite</td><td>J&amp;K Scientific Ltd</td><td>75234</td><td></td></tr><tr><td>Tools/Materials:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 mL SPE tubes</td><td>Supelco</td><td>Sigma 57024</td><td>lege solid phase extractie kolommen</td></tr><tr><td>Luer stopcock</td><td>Sigma</td><td>S7396</td><td>om de stroom van de SPE tube te stoppen</td></tr><tr><td>Dowex 1X8</td><td>Dow Chemicals</td><td>Sigma 44340</td><td>200 - 400 mesh</td></tr><tr><td>Dounce tissue grinder</td><td>Sigma</td><td>D8938</td><td>strakke pasvorm</td></tr><tr><td>HPLC Analysis:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>High-recovery HPLC vial</td><td>Agilent Technologies</td><td>#5188-2788</td><td></td></tr><tr><td>HPLC System</td><td>Shimadzu</td><td>Nexera</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Detector voor HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>RF-20Axs</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Column</td><td>Phenomenex</td><td>Hyperclone ODS</td><td>250 x 4.6 mm</td></tr><tr><td>LCMS-grade H2O</td><td>Merck Millipore</td><td>#WX00011</td><td></td></tr><tr><td>LCMS-grade Acetonitrile</td><td>Merck Millipore</td><td>#100029</td><td>Hypergrade</td></tr><tr><td>Ammonium hydroxide solution</td><td>Fluka</td><td>#44273</td><td>puriss. P.a.</td></tr></tbody></table>

bepaling van sialic acids in lever en melk monsters van wild-type en<em&gt; cmah</em&gt; knock-out muizen.

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

CMAH (cytidine monofosfaat-N-acetylneuraminezuurhydroxylase) is verantwoordelijk voor de oxidatie van cytidine monofosfaat-N-acetylneuraminezuren bij zoogdieren. Echter, mensen kunnen cytidine monofosfaat-N-acetylneuraminezuur niet oxideren tot cytidine monofosfaat-N-glycolylneuraminezuur als gevolg van een primaire exon deletie van het CMAH gen. Om de effecten en implicaties van het ontbreken van CMAH-activiteit in meer detail te begrijpen, is een Cmah- knock- outmodel in muizen een grote interesse in basis en toegepast onderzoek. De analysemethode voor het bepalen van het fenotype van dit muismodel wordt hierin gedetailleerd beschreven en is gebaseerd op de detectie van zowel N-acetylneuraminezuur als N-glycolyleenzuurzuur in de lever en melk van wild-type en Cmah- knock- outmuizen . Endogene sialiczuren worden vrijgemaakt en afgeleid met o-fenylendiamine om fluorogene derivaten te genereren, die vervolgens met behulp van HPLC kan worden geanalyseerd. Het gepresenteerde protocol kan zijnOok aangevraagd voor de analyse van melk- en weefselmonsters uit verschillende andere herkomst, en kan van nut zijn om de voedings- en gezondheidseffecten van N-glycolylneuraminezuur te onderzoeken.

Een schematisch overzicht van de beschreven analysemethode is weergegeven in Figuur 1 en omvat de isolatie van sialinezuren uit melk- en levermonsters van wild-type en Cmah- knock-out mutantmuizen en de fluorescentiedivatisering en HPLC-analyse van deze componenten. Figuur 2 en Figuur 3 tonen representatieve HPLC chromatogrammen van afgeleide sialinezuren van melk- en levermons...

We beschrijven een HPLC-gebaseerde methode voor de bepaling van N-acetylneuraminezuur en N-glycolylenuraminezuur in muizenlever en melk.

Bepaling van Sialic Acids in Lever en Melk Monsters van Wild-type en<em&gt; CMAH</em&gt; Knock-out Muizen.

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in ...

Het algemene doel van deze methodologie is de detectie van N-acetylneuraminzuur en N-glycolylneuraminzuur in de lever en melk van wild-type en CMAH knock-out muizen met behulp van HPLC-analyse. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen in het veld van de glycoscience, specifiek het effect dat genotypes van CMAH-muismodellen hebben op de werkelijke sialinezuurgehaltes van deze dieren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van genetische screenings is dat relatieve sialinezuurspiegels ook voor heterozygote muizen bepaald kunnen worden.Deze methode zal worden uitgevoerd door Cui Cao en Wang Wenjiao, twee promovendi uit ons laboratorium. Begin deze procedure met het verzamelen van muisuitmelk en leverweefsel van CMAH knock-out muizen, zoals beschreven in het tekstprotocol. Om sialinezuren uit de melk te isoleren, brengt u 50 µL melk over in een centrifugebuis van 1,5 mL en voegt u 1,2 mL van de bereide waterige azijnzuuroplossing toe.Om sialinezuren uit leverweefsel te isoleren, ontdooi voorzichtig 20 tot 50 milligram muizenlever en breng dit over in een Dounce-weefselhomogeniseerder. Voeg 1,2 milliliter van de waterige azijnzuuroplossing toe en homogeniseer het weefsel door 10 seconden lang voorzichtig te scheren. Breng de resulterende suspensie over in een centrifugebuis van 1,5 milliliter.Incubeer vervolgens de verzure melk of weefselsuspensie gedurende vier uur bij 80 °C. Centrifugeer het monster daarna 10 minuten bij 14.000 ×g. Draag de bovenste 1000 µL van het supernatant over naar een nieuwe centrifugebuis van 1,5 mL.Verwijder het oplosmiddel door centrifugale verdamping bij kamertemperatuur tot volledige droogte. Los het monster opnieuw op in 500 microliters gedestilleerd water. Bereid vervolgens een microanionenuitwisselingskolom voor door 200 milligram anionenuitwisselingshars per monster over te brengen naar lege buizen van 3 milliliter met een bevestigde stopkraan.Voeg 2 milliliters van de waterige azijnzuuroplossing toe om de chloride-ionen in de hars te vervangen door acetaat-ionen. Sluit de stopkraan zodra het oplosmiddel de bovenkant van de hars bereikt. Voeg voorzichtig 2 milliliters gedestilleerd water toe en open de stopkraan.Stop de doorstroming zodra het grootste deel van het oplosmiddel de bovenkant van de hars bereikt. Zorg ervoor dat de hars altijd bedekt is met oplosmiddel. Was vervolgens de harskolom nog twee keer met twee milliliters gedestilleerd water om het overtollige acetaat te verwijderen.Breng de resulterende 500 µL van het monsteroplosmiddel over op de harskolom en gooi de doorloop weg. Was de hars voorzichtig met 2 mL gedestilleerd water. Elueer de monsteranionen van de hars met 1 mL van een 50 mM ammoniumacetaatoplossing in een centrifugebuis van 1,5 mL.Verwijder het oplosmiddel door centrifugale evaporatie bij kamertemperatuur tot droogheid. Weeg tussen de 5 en 8 milligram N-acetylneuraminzuur op een analytische balans af in een centrifugebuis van 1,5 milliliter. Noteer het exacte gewicht en voeg 164 microliters gedestilleerd water toe per milligram.Verkrijg N-glycolylneuraminzuur in kleinere hoeveelheden tegen een redelijke prijs, bijvoorbeeld in aliquots van 1 milligram. Voeg 154 microliters gedestilleerd water direct toe aan de verbinding om een voorraadoplossing van ongeveer 20 millimolair Neu5Gc te verkrijgen. Overbreng de oplossing naar een centrifugebuis van 1,5 milliliter.Deze oplossing kan tot 12 maanden worden bewaard bij -20 °C. Breng 5 µL van elke voorraadoplossing over in een nieuw centrifugebuisje van 1,5 ml. Verwijder vervolgens het oplosmiddel door centrifugale verdamping bij kamertemperatuur tot volledige droogte.Voeg 20 µL van de OPD-oplossing toe aan de sialinezuurmonsters afkomstig van muis melk, muizenlever of de gemengde sialinezuurstandaard. Vortex het monster krachtig gedurende 30 seconden. Incubeer de monsters vervolgens vier uur lang bij 80 °C in het donker.Laat de monsters vijf minuten afkoelen en voeg vervolgens 80 µL gedestilleerd water toe. Centrifugeer de buisjes daarna één minuut lang bij 14.000 ×g. Draag vervolgens 80 µL van de supernatant over naar een HPLC-vial van 300 µL met hoge recoverie.De gederivatiseerde sialinezuurmonsters kunnen gedurende maximaal één week worden bewaard bij vier tot zes graden Celsius. Analyseer de monsters met een standaard HPLC-systeem dat is verbonden met een online fluorescentiedetector. Gebruik voor de analyse een reversed-phase C18-kolom met een lengte van 250 millimeter en een diameter van 4,6 millimeter.Nadat oplosmiddel A en oplosmiddel B zijn voorbereid en de HPLC-run is ingesteld zoals gedetailleerd in het protocol, injecteert u 50 µL van de monsteroplossing in het HPLC-systeem. Monitor het eluaat met de fluorescentiedetector bij een excitatiegolflengte van 373 nm en een emissiegolflengte van 448 nm. Bereken ten slotte de relatieve hoeveelheid Neu5Gc zoals beschreven in het tekstprotocol.Hier worden representatieve HPLC-chromatogrammen getoond van fluorescentie-gelabelde sialinezuren uit melkmonsters, afkomstig van homozygote knock-out CMAH-muizen en heterozygote knock-out CMAH-muizen. Wild-type muizen worden ook weergegeven. Op dezelfde wijze worden hier chromatogrammen getoond van fluorescentie-gelabelde sialinezuren afkomstig uit de lever van de muis.Een vergelijking van de relatieve hoeveelheden Neu5Gc laat zien dat homozygote CMAH knock-out muizen geen Neu5Gc bevatten, terwijl heterozygote CMAH knock-outs en wild-type muizen tussen de 10 en 75% Neu5Gc bevatten. Wanneer de methode onder de knie is, kunnen monsters binnen acht uur worden voorbereid, mits de procedure correct is uitgevoerd. Daarnaast kunnen de monsters 's nachts via HPLC-autosampling worden geanalyseerd.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken de isolatie van sialinezuur en de derivatiseringsprocedure op dezelfde dag uit te voeren. Na de procedure kunnen andere methoden, zoals massaspectrometrische analyse, worden uitgevoerd om de aard van de verkregen fluorescentiesignalen te bevestigen. De ontwikkeling van deze techniek stelt onderzoekers in staat om de distributie van sialinezuur in biologische monsters te onderzoeken.Vergeet niet dat werken met geconcentreerd azijnzuur en mierenzuur extreem gevaarlijk kan zijn, en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van beschermende kleding, tijdens het uitvoeren van deze procedure.

determination-sialic-acids-liver-milk-samples-wild-type-cmah-knock

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In this video, we demonstrate the detection of sialic acids, N-acetylneuraminic acid and N-glycolylneuraminic acid, using high-performance liquid chromatography, HPLC, following derivatization with a suitable fluorescent labeling reagent to aid in fluorescence detection.

Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography: A Robust Method for Quantitation of Fluorescently Labeled and Derivatized Sialic Acids Isolated from Mouse Liver

De indirecte immunofluorescentie protocol beschreven in dit artikel laat de detectie en de lokalisatie van eiwitten in de muis borstklier. Een complete methode wordt gegeven voor te bereiden borstklier monsters, om immunohistochemie uit te voeren, om de afbeelding van het weefsel secties met behulp van fluorescentie microscopie, en om beelden te reconstrueren.

Indirecte Immunofluorescentie op Bevroren Secties van Muis borstklier

De overdracht van bm12-lymfocyten naar een C57BL/6-ontvanger is een gevestigd model van systemische lupus erythematosus. Hier beschrijven we hoe de ziekte kan worden geïnitieerd met behulp van dit model en hoe T-folliculaire helpercellen, germinale centrum B-cellen en plasmacellen kunnen worden gekenmerkt door middel van flowcytometrie.

De bm12 Induceerbare model van systemische lupus erythematosus (SLE) in C57BL / 6 muizen

Dit protocol beschrijft hoe te bepalen of farmacologische behandelingen voor experimentele auto-immuun encefalomyelitis CNS-bescherming vertonen als gevolg van het onderdrukken van immuuncel-infiltratie of neuroprotectief zijn tijdens de aanval van immuuncel-infiltratie.

Het bepalen van onderdrukking van het immuunsysteem versus CNS Bescherming voor farmacologische interventies bij auto-Demyelinisatie

In deze methode presenteren wij biochemische procedures voor snelle en efficiënte isolatie van intermediaire filament (IF) eiwitten uit meerdere muisweefsels. Geïsoleerde IF's kunnen worden gebruikt om veranderingen te onderzoeken in post-translatie modificaties door massaspectrometrie en andere biochemische analyses.

Isolatie van intermediaire filamentproteïnen uit meerdere muisweefsels om te bestuderen veroudering-geassocieerde post-translationele modificaties

Sialic acid is een typische monosaccharide-eenheid gevonden in glycoconjugates. Het is betrokken bij een overvloed van moleculaire en cellulaire interacties. Hier presenteren we een methode als u wilt wijzigen van cel oppervlakte sialic zuur expressie metabole glycoengineering met N- acetylmannosamine derivaten.

Metabole Glycoengineering van Sialic zuur met N-acyl-gewijzigd Mannosamines

Speekselklier hypofunction is een frequente gevolg van auto-immune ziekte en straling therapie. Reproduceerbaar evaluatie van speekselklier functie in muismodellen van deze ziekten is een technische uitdaging. Hier wordt een eenvoudige methode voor nauwkeurige en reproduceerbare meting van speeksel productie in muizen beschreven.

Een methode voor het meten van speekselklier functie in muizen

Hier presenteren we een protocol voor het onderzoek naar het effect van de ongeldigheidsverklaring van gustation-gerelateerde genen op immuunresponsen bij een dextran sulfaat natrium (DSS)-geïnduceerde muismodel van inflammatory bowel disease (IBD).

Effecten van smaak signalering eiwitten afschaffing op ontsteking van de darm in een muismodel van Inflammatory Bowel Disease

We beschrijven een in vivo immunisatie, translationeel hepatitismodel in BALB / c-muizen dat kan worden gebruikt om de pathogenese van door geneesmiddelen geïnduceerde auto-immune hepatitis te bestuderen, inclusief geslachtsverschillen die bij deze ziekte worden waargenomen. We zullen beschrijven hoe dit model reproduceerbare analyses demonstreert met behulp van in vivo en in vitro experimentele technieken.

Inductie van geneesmiddel-geïnduceerde, auto-immune hepatitis bij BALB / c-muizen voor de studie van de pathogene mechanismen

De traanklier (LG) heeft twee soorten cellen uitdrukken α-Smooth spier actine (αSMA): Myo cellen (MECs) en pericyten. MECs zijn van ectodermale oorsprong, gevonden in vele klier weefsels, terwijl pericyten zijn vasculaire gladde spiercellen van endodermal oorsprong. Dit protocol isoleert MECs en pericyten van muizen LGs.

Isolatie van Myo cellen van volwassen muizen traan en submandibulaire klieren

In dit artikel wordt beschreven hoe u een apparaat in elkaar zet dat kan worden gebruikt om melk van laboratoriummuizen op te vangen. Dit apparaat is betaalbaar, draagbaar en maakt het mogelijk om 0,1-0,5 ml melk op te halen door één getraind persoon. Er is ook een gedetailleerd melkprotocol opgenomen.

Een efficiënte eenpersoonstechniek voor het bemonsteren van melk van laboratoriummuizen

Leer hoe u sialinezuren in lever en melk van CMAH knock-out muizen detecteert met HPLC-analyse. Deze methode maakt kwantificering van N-acetylneuraminezuur en N-glycolylneuraminezuur mogelijk voor glycoscience-onderzoek.

Bepaling van Sialic Acids in Lever en Melk Monsters van Wild-type en

Meer video's verkennen