Screening van bioactieve nanodeeltjes in phagocytische immuuncellen voor inhibitors van Toll-achtige Receptor Signalering

Het algemene doel van deze screeningsprocedure is om nieuwe bioactieve nanodeeltjes te identificeren die de signaaloverdracht van tol-achtige receptoren kunnen remmen. Deze methode kan u helpen om fysiek nieuwe nanoremmers te identificeren die zich richten op de signaaloverdracht van tol-achtige receptoren in aangeboren immuuncellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het snel, robuust en gemakkelijk uit te voeren is met behulp van reportercelsystemen.

De toepassingen van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van vele ontstekingsziekten omdat de signaaloverdracht van tol-achtige receptoren betrokken is gebleken bij de pathogenese van deze ziekten. Hoewel deze methode een hoge screening kan bieden op goud- en nanodeeltjes, kan deze ook worden toegepast op andere nanodeeltjessystemen, evenals therapeutische kleine moleculen en de biologie. Om deze procedure te starten, bereidt u de kweekmedia voor zoals beschreven in het tekstprotocol.

Voeg vervolgens 100 milliliter ultra-puur endotoxine-vrij water toe aan een schone 125 milliliter glazen fles. Voeg een zakje gesecreteerd embryonaal alkalisch fosfatase-substraatpoeder toe en draai de oplossing voorzichtig rond totdat het volledig is opgelost. Incubeer gedurende een uur op 37 graden Celsius om een volledige oplossing van de substraten te garanderen.

Filter de oplossing met behulp van een 0,2 micrometer membraan. Bewaar bij vier graden Celsius totdat u klaar bent om het te gebruiken. Voeg vervolgens een zakje luciferase-substraatpoeder toe aan een 50 milliliter centrifugeerbuisje met 25 milliliter ultrapuur endotoxine-vrij water.

Nadat het poeder volledig is opgelost, bewaar het bij vier graden Celsius gedurende maximaal een week totdat u klaar bent om het te gebruiken. Bereid vervolgens de stamoplossingen van alle andere reagentia voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Na het kweken en voorbereiden van de cellen, brengt u ze over van de kweekfles naar een centrifugeerbuis.

Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 300 keer G. Sla de cellen vervolgens op in het R-10-medium met een concentratie van 1 X 10 tot de 6 cellen per milliliter. Voeg aliquoten van de PMA-oplossing toe aan de celsuspensie zodat de uiteindelijke concentratie 50 nanogram per milliliter is.

Pour de celsuspensie in een steriele reagent reservoir. Gebruik een multikanaals pipetteerder om 100 microliters van de celsuspensie in elke put van een 96-well vlakbodem kweekplaat te brengen. Incubereer gedurende 24 uur in een celkweekincubator bij 37 graden Celsius.

Gebruik vervolgens een vacuüm aspirator om voorzichtig het kweekmedium te verwijderen. Controleer de cellen met behulp van een omgekeerd microscoop om ervoor te zorgen dat de afgeleide macrofagen aan de bodem van de put zijn gehecht. Was de cellen voorzichtig twee keer met 100 microliters PBS per put voor elke wasbeurt.

Voeg vervolgens 100 microliters vers R-10-medium toe aan elke put. Laat de cellen twee dagen rusten in een incubator bij 37 graden Celsius voordat u de reporterassay uitvoert. Bepaal eerst de optimale LPS-dosis zoals beschreven in het tekstprotocol.

Voeg vervolgens 180 microliters voorverwarmde Quanti-Blue-oplossing toe aan elke put van een nieuwe 96-well vlakbodem plaat. Breng vervolgens 20 microliters supernatant van elk monster over naar de plaat. Incubereer gedurende een tot twee uur bij 37 graden Celsius om de kleur te laten ontwikkelen van roze naar donkerblauw.

Zodra de optische dichtheid boven de een ligt, gebruikt u een plate reader om de absorptie bij 655 nanometer te bepalen. Om de analyse van IRF-activering te starten, brengt u 10 microliters vers supernatant van elk monster over naar een nieuwe 96-well heldere platte bodem witte plaat. Voeg met behulp van automatische injectie 50 microliters van de luciferase-oplossing toe aan elke put.

Verzamel vervolgens onmiddellijk de luminescentie put voor put om een dosisresponscurve te produceren om de optimale LPS-concentratie voor nanodeeltjesscreening te bepalen. Centrifugeer vervolgens 20 volumes van de peptide-GMP-hybride oplossing in 1,5 milliliter Eppendorfbuisjes bij 18.000 keer G gedurende 30 minuten. Gooi de supernatanten voorzichtig weg.

Breng de hybriden over naar een enkele verse buis en was ze twee keer met een milliliter PBS. Sla de gewassen hybriden vervolgens op in één volume R-10-medium. Meng gelijke volumes van de geconcentreerde hybriden en het LPS-bevattende R-10-medium zodat de uiteindelijke concentratie van de hybriden en LPS respectievelijk 100 nanomolair en 10 nanogram per milliliter is.

Verwijder vervolgens het kweekmedium van de macrofagen kweekplaat. Voeg 100 microliters van de hybride LPS-mengsel toe aan elke put, met drie replica's voor elke conditie. Voeg een negatieve controle en een LPS-controle toe.

Incubeer gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius. Breng vervolgens het medium van elke put over naar een aparte centrifugeerbuis. Centrifugeer de buisjes gedurende 30 minuten bij 18.000 keer G en vier graden Celsius.

Breng de supernatanten over naar een nieuwe 96-well ronde bodem plaat. Om de reporterassay op deze monsters te starten, voegt u 180 microliters voorverwarmde Quanti-Blue-oplossing toe aan elke put van een nieuwe 96-well vlakbodem plaat. Breng vervolgens 20 microliters van de supernatanten van elk monster over naar deze plaat.

Incubeer gedurende een tot twee uur bij 37 graden Celsius totdat de donkerblauwe kleur zich ontwikkelt tot een optische dichtheid van meer dan een. Gebruik vervolgens een plate reader om de absorptie bij 655 nanometer te registreren. Breng vervolgens 10 microliters vers supernatant van elk monster over naar een 96-well heldere platte bodem witte plaat.

Voeg met behulp van een automatische injector 50 microliters van de luciferase-oplossing toe aan elke put en registreer onmiddellijk de luminescentie put voor put. Valideer vervolgens het remmende effect van de potentiële kandidaten en evalueer de TLR-specificiteit zoals beschreven in het tekstprotocol. In