Een gemodificeerd Yeast-One Hybrid System voor Heteromere Proteïne Complex-DNA Interactie Studies

Het algemene doel van dit experiment is om de interactie tussen heteromere eiwitcomplexen en DNA te bestuderen en te valideren in een heteroloog systeem voor functionele genomische studies in een reguliere laboratoriumsetting. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de functionele genomica, zoals geplande genomica. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het interacties tussen eiwitten en DNA detecteert waarbij meer dan één eiwit of transcriptiefactor betrokken is.

Begin deze procedure in de middag van wat wordt aangeduid als dag één. Start een cultuur van 5 milliliter in synthetisch gedefinieerd medium of SD-medium zonder uracil vanaf een vers uitgeplaat Petri-schaal. Incubeer dit gedurende de nacht in een schudincubator bij 30 °C.

Inoculeer de volgende middag 10 milliliters YPDA-medium met 500 microliters van de overnight-cultuur en incubeer dit overnight in een schudincubator bij 30 degree Celsius. Inoculeer vroeg in de ochtend van de volgende dag 100 milliliters YPDA-medium met 2 milliliters van de overnight-cultuur. Laat deze verse cultuur groeien bij 30 degrees Celsius totdat de optische dichtheid bij 600 nanometers een waarde van 0.4 tot 0.8 bereikt.

Centrifugeer bij 1000 ×g en 21 °C gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant. Voeg 10 milliliters steriel water toe en resuspendeer de pellet door middel van vortexen.

Centrifugeer bij 1000 ×g en 21 °C gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant, voeg 2 mL TE lithiumacetaat toe en resuspendeer het pellet door te vortexen. Centrifugeer bij 1000 ×g en 21 °C gedurende vijf minuten.

Verwijder het supernatant. Voeg 4 milliliters TE lithiumacetaat plus 400 microliters zalmsperm-DNA toe en resuspendeer het pellet door herhaaldelijk te pipetteren. De cellen zijn nu klaar voor transformatie, zoals gedemonstreerd in het volgende segment.

De co-transformatie van de cellen wordt uitgevoerd in een 96-well U-bodem mengplaat. Verdeel eerst 20 µL competente cellen per well in de 96-well plaat. Voeg vervolgens aan de wells telkens 150 ng van de twee plasmiden en de normalisatiecontrole toe.

Dit schema toont de algemene opstelling van het plaatje voor de co-transformatie van de gistcellen met het eiwit van belang. De opstelling van het plaatje kan worden aangepast aan de behoeften van het experiment en het aantal geteste DNA-regio's of fragmenten. Voeg 100 µL TE lithiumacetaat polyethyleenglycol per putje toe en meng drie keer door te pipetteren.

Bedek de plaat met een ademende afsluiting en incubeer bij 30 °C gedurende 20 tot 30 minuten. Voer een hitte-shock uit bij 42 °C gedurende precies 20 minuten. Centrifugeer na de hitte-shock bij 1000 ×g en 21 °C gedurende 5 minuten.

Gebruik een meerkanaals pipet om het supernatant te verwijderen. Voeg 110 µL TE toe en meng. Centrifugeer opnieuw gedurende 5 minuten.

Verwijder 100 µL van het supernatant uit elke put. Dompel een puncher in 100% ethanol, flambeer deze, wacht één minuut tot de pinnen van de puncher zijn afgekoeld en gebruik vervolgens de steriele puncher om het pellet opnieuw te suspenderen. Breng de cellen over op SD tryptofaan- en leucine-drop out augerplaten.

Incubeer de platen twee dagen bij 30 °C. Haal op de middag van dag vijf de auger-platen uit de incubator. Vul elke put van de steriele 96-well u-bottom mengplaat met 50 µL TE. Bevochtig een steriele puncher vooraf met TE, punch de kolonies van de SD tryptofaan- en leucine-drop-out plaat en resuspendeer deze in de met TE gevulde plaat.

Breng de kolonies over naar nieuwe SD tryptophan- en leucine-dropout agarplaten voor een optimale oppervlaktebedekking. Incubeer de platen 2 dagen lang bij 30 °C. Haal de agarplaten op de middag van dag 7 uit de incubator.

Vul elke put van een steriele 96-wells u-bodem mengplaat met 50 µL SD-medium zonder tryptofaan en leucine. Vul elke put van een steriel 96-wells deep-well blok met 180 µL SD-medium zonder tryptofaan en leucine. Steriliseer de puncher, bevochtig de puncher en het medium, en breng kolonies van de plaat over naar de putten die elk 50 µL medium bevatten.

Breng 20 µL gist over naar de 180 µL SD tryptophan en lucine drop out medium. Sluit het blok af met een ademend membraan en incubeer bij 30 °C onder schudomstandigheden gedurende 36 uur. Overbreng op de ochtend van dag negen 100 µL cultuur naar 500 µL YPDA-medium in een gesteriliseerd 96-deep well blok.

Dek af met een ademende afsluiting en incubeer bij 30 °C met agitatie op 200 rpm gedurende drie tot vijf uur. Resuspendeer na drie tot vijf uur de cultuur en breng 125 µL van elke put over naar een spectrofotometerplaat. Meet de optische dichtheid bij 600 nm om te controleren of deze tussen 0,3 en 0,6 ligt.

Centrifugeer de resterende cellen in het deep well block bij 3000 ×g en 21 °C gedurende 10 minuten. Verwijder het supernatant door om te keren. Voeg 200 µL Z-buffer toe aan elke well en vortex.

Centrifugeer bij 3000 G en 21 °C gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant door om te keren. Voeg 21 µL Z-buffer toe aan elke well en vortex.

Bedek de plaat met afdichtfolie die bestand is tegen vries-dooi-cycli. Voer in een zuurkast 4 vries-dooi-cycli uit met behulp van vloeibare stikstof en een waterbad van 42 °C. Voeg 200 µL vers bereide Z-buffer beta-mercaptoethanol ONPG-oplossing toe aan elke well.

Incubeer bij 30 °C gedurende 17 tot 24 uur of totdat er kleurontwikkeling optreedt. Controleer op de ochtend van dag 10 of de kleur is ontwikkeld. Voeg 110 µL van één molar natriumcarbonaat toe aan elke well om de reactie te stoppen.

Noteer de tijd en vortex de plaat. Centrifugeer bij 3000 ×g en 21 °C gedurende tien minuten. Gebruik een multichannelpipet om 125 µL supernatant van elke well over te brengen naar een spectrophotometerplaat.

Meet de optische dichtheid bij 420 nanometer. Bereken de bèta-galactosidase-activiteit in een spreadsheet zoals beschreven in het tekstprotocol. In deze studie werd de promoterregio van 2600 basenparen stroomopwaarts van het begin van de transcriptiestartplaats onderverdeeld in zes regio's of fragmenten.

Deze foto is een voorbeeld van een goed gegroeide en positieve plaat na dag vijf van het protocol. In dit representatieve resultaat vertonen DNA-fragmenten één en vier een positieve interactie met het eiwit A en B complex. Bij de meting van de bèta-galactosidase-activiteit vertoont fragment één een viervoudige inductie van de reportergenactiviteit.

Het is belangrijk om te onthouden dat deze procedure wordt aanbevolen voor het verkrijgen van informatie over DNA-regio's pas nadat de voorgestelde eiwit-eiwitinteractie is bevestigd, en niet is ontworpen om informatie over target sites te verschaffen. Na het volgen van deze procedures kunnen andere methoden, zoals chip assay en Msar, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden. Bijvoorbeeld het identificeren van de target sites in vivo.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de rol van multimere eiwitcomplexen die binden aan een gemeenschappelijk DNA-doel kunt testen en valideren.