Name: Geoptimaliseerde LC-MS/MS methode voor de analyse van de High-throughput van klinische monsters van Ivacaftor, de belangrijkste metabolieten daarvan en Lumacaftor in biologische vloeistoffen van Cystic Fibrosis patiënten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Leer een geoptimaliseerde HPLC-MS methode voor de analyse van ivacaftor, lumacaftor en hun metabolieten in plasma van cystic fibrosis patiënten. Deze techniek ondersteunt therapeutische geneesmiddelenmonitoring en farmacokinetisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J.L. en T.V. worden ondersteund door het nationale Instituut van allergie en besmettelijke ziekten (NIAID) van de National Institutes of Health (R01 AI111965). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de nationale Instituut van allergie en besmettelijke ziekten of de National Institutes of Health. MC is een Australische NHMRC Principal Research Fellow. J. L. is een Australische nationale gezondheids- en medische onderzoek Raad (NHMRC) Senior Research Fellow en T.V. is een Australische NHMRC industrie carrière ontwikkeling niveau 2 Research Fellow. E.K.S is een benoemde Ambassadeur van de jonge 2017 voor ASM (American Society for Microbiology) en wordt ondersteund door de Australische Postgraduaat Award. Delen van dit werk werd gepresenteerd op de 12th Australiasian conferentie over Cystic Fibrosis In Melbourne (5-8th van augustus 2017).

goedkeuring voor ethiek was verkregen van Monash University menselijke onderzoek ethische Commissie (MUHREC).
 1. toepassing van de bepaling: patiënt Sample collectie <ol><li>Neem de tijd wanneer de patiënt hun standaard dosis van 150 mg ivacaftor of ivacaftor 125 mg /lumacaftor neemt 200 mg.</li>
	<li>Opmerking onderaan de nauwkeurige tijd wanneer de patiënt bloedmonster wordt verzameld. 
	Opmerking: We raden 4-5 monsters verzamelen in een loop van de tijd 24 h. Als de collectie van slechts één steekproef mogelijk is, het aangegeven tijdstip is 2,5-4 h post ivacaftor of ivacaftor-lumacaftor combinatie dosering als C max concentraties bij steady-state zal haalbaar na &#62; 5 dagen van opeenvolgende behandeling.</li>
	<li>4-5 mL bloed in de handel verkrijgbare onbehandelde blauwe buizen verzamelen.</li>
	<li>Na het verzamelen van de volbloed, laat het bloed stollen door het verlaten van het ongestoord bij kamertemperatuur. 
	Let op: Dit duurt meestal 15-30 min.</li>
	<li>Verwijder de klonter door centrifugatie bij 1000 en 2000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C in een gekoelde centrifuge. Het resulterende supernatant aanwijzen als plasma.</li>
	<li>Na centrifugeren, onmiddellijk overdracht de bovendrijvende substantie (plasma) in een schoon polypropyleen buis met behulp van een precisiepipet Pasteur. Label het plasma tube met de patiënt ID (bijvoorbeeld patiënt 1), de door de overheid gereguleerde drug (b.v., ivacaftor-lumacaftor combinatie), en tijd van de patiënt steekproef werd verzameld (bijvoorbeeld 2,5 h na dosering).</li>
	<li>Monsters van behouden bij 2-8 ° C tijdens de behandeling. Zodra afhandeling is voltooid, slaan monsters op &#8211; 20 ° C.</li>
	<li>Indien nodig, monsters met een goedgekeurde courier aan het analyseren Instituut schip. 
	Opmerking: Monsters worden verzonden op droog ijs tot aankomst en dient te worden bewaard bij &#8211; 80° C tot analyse.</li>
</ol> 2. Voorbereiding en verwerking van gemaakte monsters en normen Opmerking: Plasma van gezonde donoren naïef op ivacaftor/lumacaftor therapie was verkregen van de Australische Rode Kruis. Om de integriteit te garanderen, moeten alle monsters/normen tijdens de inzameling en verwerking bij 2-8 ° C worden gehouden. Zodra afhandeling is voltooid, slaan monsters op &#8211; 20 ° C.
<ol><li>Weeg IVA, IVA-carboxylaat, hydroxymethyl-IVA en LUMA die als referentie voor de interne standaarden dienen zal.</li>
	<li>Bereiden twee onafhankelijke stamoplossingen van elke analyt (IVA, M1, M6 en LUMA) in LC-MS rang methanol op 100 µg/mL en 10 µg Fe/mL. 
	Opmerking: Verbindingen vervalt na 10 dagen op de benchtop.</li>
	<li>Vers bereiden LC-MS kalibratie standaarden vóór elke analytische run door verdunning van de kalibratie-normen voorraadoplossingen in menselijk plasma te bereiken na concentraties: 0.01, 0,025 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 en 10,0 µg/mL. Deze monsters worden aangeduid als normen.</li>
	<li>Te precipiteren eiwitten, bereiden van 0,1% mierenzuur (FA) in acetonitril (ACN, LC-MS rang) en laat in de koelkast totdat nodig.</li>
</ol> 3. Voorbehandeling van monsters van de gemaakte en normen <ol><li>toestaan beide monsters van de patiënt en lege plasma naar equilibreer tot kamertemperatuur.</li>
	<li>Vortex te mengen van elk monster plasma voor 15 s per monster.</li>
	<li>Pipetteer een hoeveelheid van 100 µL van beide leeg plasma voor normen of patiënt monsters voor analyse in een buis van polypropyleen microcentrifuge 1.5-mL.</li>
	<li>De interne standaard IVA in elk van de standaard buizen toevoegen (bijvoorbeeld 0,01, 0,025 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 en 10,0 µg/mL ter dekking van de potentiële concentratiebereik), sluit het deksel en vortex voor 2-3 s. notitie dat interne standaard is alleen toegevoegd aan het leeg plasma en geen interne standaard wordt toegevoegd aan de patiënt monsters.</li>
	<li>Herhaal stap 3.4. voor de andere interne standaarden M1 en M6 LUMA.</li>
	<li>Spin down elke buis kort om ervoor te zorgen dat er geen druppels op het deksel.</li>
	<li>Voeg toe 200 µL van het mengsel van 0,1% FA in ACN in elke buis te precipiteren plasma-eiwitten.</li>
	<li>Vortex het mengsel krachtig gedurende ongeveer 15 s.</li>
	<li>Buizen te staan gedurende 10 minuten in de koelkast laten.</li>
	<li>Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C, indien mogelijk.</li>
	<li>Filtreer een aliquot 200 µL van het supernatans dat door een 13 mm spuit filter in een flesje van de HPLC 1,5 mL.</li>
	<li>Breng 100 µL van de bovendrijvende substantie in de LC-MS flacon voor de HPLC-MS-analyse.</li>
</ol> 4. HPLC-MS analyse Opmerking: The HPLC-MS-analyse werd uitgevoerd op een systeem van de LC-MS in combinatie met de triple vierpolige massaspectrometer (tabel 1).
<ol><li>Draaien op het systeem van de LC-MS, plaatst u de lade, met de monsters in de auto-sampler.</li>
	<li>De kolom koppelen aan een voorkolom en sluit aan op het systeem van de LC-MS.</li>
	<li>Hechten beide flessen van mobiele fasen (fles van A: 100% ACN; fles B: 0,1% mierenzuur in water) en het systeem van de LC-MS equilibreer.</li>
	<li>De volgende parameters in het LC-MS protocol opnemen.
	<ol><li>De mobiele fase stroom verdeeld alvorens de massaspectrometer in een verhouding van 2:1 (afval: MS inlaat).</li>
		<li>Voeren een kleurovergang elutie op een debiet van 0,5 mL/min met behulp van een mobiele fase, bestaande uit 100% ACN en 0,1% mierenzuur in water (startpunt op 40:60, v/v). Merk op dat het percentage van het volume van de mobiele fase in de gehele analyse verandert.</li>
		<li>Werken de massaspectrometer in een positieve electrospray ionisatie modus.</li>
		<li>Zorg ervoor dat de LC-MS-instellingen als volgt: ion spray spanning 4.5 kV, botsing energie 295.9 V, nebulizing gas: stikstof op 3 L/min, botsing gas: argon; drogen gas flow 20 L/min, lens spanning Q3:-22 V, desolvation temperatuur 250 ° C met een warmte-blok temperatuur van 400 ° C.</li>
		<li>Injecteren 10 µL volume per monster.</li>
		<li>Analyse analyten met behulp van meerdere reactie controle (MRM). Controleren van de ion overgangen van m/z 392.49 &#8594; 393, m/z 408.49 &#8594; 409, m/z 422.47 &#8594; 423 en m/z 452.40 &#8594; 453 voor IVA, IVA-M1, IVA-M6 en LUMA, respectievelijk. 
		Nota: De nieuwe geoptimaliseerde methode moet nog volledig worden gevalideerd volgens FDA normen.</li>
	</ol></li></ol> 5. Kalibratiekrommen <ol><li>Construct de LC-MS kalibratiekrommen vóór elke analyse uitvoeren met behulp van de relatie tussen de ratio's van piek, gebied van elk van de vier analyten aan interne standaard en de kalibratie standaard nominale concentraties van ivacaftor (IVA-M1, IVA-M6 of LUMA) vanuit het instellingen programma van LC-MS. 
	Opmerking: De exacte stappen voor de bouw van de kalibratiekromme is afhankelijk van het model van LC-MS apparatuur wordt gebruikt. Deze informatie is mogelijk in de handleiding van de apparatuur beschikbaar.</li>
	<li>Lineaire kleinste kwadraten regressie-analyse uitvoeren door weging van 1/C 2 volgens de reciproke van concentraties.</li>
</ol>

<ol><li>Schneider, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-drug+plasma+protein+binding+interactions+of+ivacaftor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Recognit%22%5BJournal%5D)">Drug-drug plasma protein binding interactions of ivacaftor.</a> J Mol Recognit. 28 (6), 339-348 (2015).</li>
<li>Solomon, M., Leatte, P. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSolomon%2C+M+%22Treatments+for+Cystic+fibrosis%22">Treatments for Cystic fibrosis</a>. , (2009).</li>
<li>O'Sullivan, B. P., Flume, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+approach+to+lung+disease+in+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">The clinical approach to lung disease in patients with cystic fibrosis.</a> Semin Respir Crit Care Med. 30 (5), 505-513 (2009).</li>
<li>Ramsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CFTR+potentiator+in+patients+with+cystic+fibrosis+and+the+G551D+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation.</a> N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).</li>
<li>Wainwright, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumacaftor-Ivacaftor+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis+Homozygous+for+Phe508del+CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR.</a> N Engl J Med. 373 (3), 220-231 (2015).</li>
<li>Hadida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+N-%282%2C4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl%29-4-oxo-1%2C4-dihydroquinoline-3-carboxamide+%28VX-770%2C+ivacaftor%29%2C+a+potent+and+orally+bioavailable+CFTR+potentiator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Discovery of N-(2,4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl)-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxamide (VX-770, ivacaftor), a potent and orally bioavailable CFTR potentiator.</a> J Med Chem. 57 (23), 9776-9795 (2014).</li>
<li>FDA. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22FDA+Advisory+Commitee+Briefing+Material+VERTEX-FDA+Pulmonary-Allergy+drugs+advisory+commitee%22">FDA Advisory Commitee Briefing Material VERTEX-FDA Pulmonary-Allergy drugs advisory commitee</a>. 98 , VERTEX Pharmaceuticals Incorporated. (2015).</li>
<li>Holmes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((False+dawn+for+cystic+fibrosis+disease+modifiers%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">False dawn for cystic fibrosis disease modifiers?</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (10), 713-714 (2014).</li>
<li>Veit, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+gating+potentiators%2C+including+VX-770%2C+diminish+DeltaF508-CFTR+functional+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Some gating potentiators, including VX-770, diminish DeltaF508-CFTR functional expression.</a> Sci Transl Med. 6 (246), 246ra297(2014).</li>
<li>Cholon, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiator+ivacaftor+abrogates+pharmacological+correction+of+DeltaF508+CFTR+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Potentiator ivacaftor abrogates pharmacological correction of DeltaF508 CFTR in cystic fibrosis.</a> Sci Transl Med. 6 (246), 246ra297(2014).</li>
<li>EMA, <a target="_blank" href="http://www.ema.europa.eu/ema/index.jsp?curl=pages/medicines/human/medicines/003954/human_med_001935.jsp&mid=WC0b01ac058001d124">Assessment report ORKAMBI (ivacaftor/lumacaftor) European medicines agency</a>. , (2015).</li>
<li>VERTEX. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Vertex+prescribing+infomation%22">Vertex prescribing infomation</a>. , (2015).</li>
<li>Matthes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+free+drug+concentration+prevents+inhibition+of+F508del+CFTR+functional+expression+by+the+potentiator+VX-770+%28ivacaftor%29%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Low free drug concentration prevents inhibition of F508del CFTR functional expression by the potentiator VX-770 (ivacaftor).</a> Br J Pharmacol. 173 (3), 459-470 (2016).</li>
<li>Schneider, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+HPLC+and+LC-MS%2FMS+methods+for+the+analysis+of+ivacaftor%2C+its+major+metabolites+and+lumacaftor+in+plasma+and+sputum+of+cystic+fibrosis+patients+treated+with+ORKAMBI+or+KALYDECO%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chrom+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Development of HPLC and LC-MS/MS methods for the analysis of ivacaftor, its major metabolites and lumacaftor in plasma and sputum of cystic fibrosis patients treated with ORKAMBI or KALYDECO.</a> J Chrom B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1038, 57-62 (2016).</li>
<li>Su, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+LC-MS%2FMS+method+for+the+quantitation+of+cabozantinib+in+rat+plasma%3A+application+to+a+pharmacokinetic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">An LC-MS/MS method for the quantitation of cabozantinib in rat plasma: application to a pharmacokinetic study.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 985, 119-123 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Zoals eerder gemeld heeft onze fractie voor het eerst ontwikkeld en gevalideerd een HPLC en LC-MS methode voor snelle detectie en kwantificering van ivacaftor en de belangrijkste metabolieten daarvan hydroxymethyl-IVA M1 (actief) en IVA-carboxylaat M6 (inactief); en lumacaftor in het plasma en sputum van CF patiënten14. De bepaling eerder gerapporteerd door onze fractie werd met succes gebruikt voor het kwantificeren van de concentratie van LUMA, IVA, IVA-M1 en IVA-M6 in het plasma en sputum van C...

Cystic fibrosis (CF) is een gemeenschappelijke genetische ziekte waarbij de exocrine slijm klieren van de longen, lever, alvleesklier en darmen veroorzaken progressieve multi orgaanfalen, zoals een afname in longfunctie en alvleesklier insufficiëntie1, 2,3. Ivacaftor (IVA) is de eerste Food and Drug Administration (FDA-US) en het Europees geneesmiddelen Agentschap (EMA) goedgekeurd cystic fibrosis trans-membraan huidgeleiding regulator (CFTR) potentiator drug, met blijkt klinische werkzaamheid produceren een aanzienlijke verbetering van de longfunctie over placebo in een kleine ondergroep van CF patiënten rekening houdend met de G551D-CFTR [glycine (G) in positie 551 wordt vervangen door asparaginezuur (D)] missense Mutatie (~ 4-5% van de bevolking van CF)4,5. Dit oraal toegediend drug verhoogt het CFTR-kanaal openen, dus het chloride-ion stroom te verhogen en reageren op de primaire afwijking die tot de klinische uitingen van CF4,6 leidt. Helaas, IVA monotherapie is niet effectief bij patiënten met de gemeenschappelijkere homozygoot F508del mutatie [in frame schrapping van het CFTR-gen dat in het verlies van fenylalanine (F) op positie 508 resulteert] wat resulteert in misfolded CFTR, die wordt gezien bij ~ 50% van de CF bevolking7,8.
Onlangs, de FDA goedkeuring heeft verleend voor het combineren van IVA met het CFTR-corrector drug lumacaftor. De slimme strategie van het combineren van een CFTR-corrector (lumacaftor, LUMA) die redt F508del-CFTR aan het celoppervlak met een modulator (IVA) die potentiates CFTR kanaal activiteit, wordt het venster van de behandeling effectief vergroot tot allermeest naar de CF bevolking5 . Vragen blijven over of deze drugs zal voldoen aan hun belofte als een aantal tegenstrijdige verslagen die cast twijfel op hun klinische werkzaamheid9,10 opgedoken. Bovendien verbeteringen in de longfunctie slechts bescheiden (2.6-4% voor de combinatie van de ivacaftor-lumacaftor) waren in vergelijking met de successen die zijn behaald met IVA monotherapie bij patiënten met een G551D Mutatie (10.6-12,5%)8. Potentiële antagonistische drug-drug-interacties tussen IVA en LUMA die potentieel de klinische werkzaamheid van ivacaftor-lumacaftor combinatie beperken, is afkomstig van de farmacokinetische eigenschappen ervan minder dan ideale7,11. IVA uitgebreid menselijk organisme worden gemetaboliseerd door cytochroom P450 enzymen (CYP), voornamelijk voor een actieve metaboliet hydroxymethyl-IVA (IVA-M1, M1) en een inactieve vorm IVA-carboxylaat (IVA-M6, M6)7,12. De CYP3A4 inductor LUMA, aan de andere kant, niet uitgebreid menselijk organisme worden gemetaboliseerd en wordt grotendeels onveranderd in de ontlasting11uitgescheiden. Zoals CYP3A4 inductoren cytochroom metabolisme induceren, kunnen ivacaftor (CYP3A4 substraat) concentraties worden verminderd. Bovendien zowel IVA en LUMA zijn zeer hydrofobe moleculen en zijn ~ 99% gebonden aan plasma-eiwitten, die aanzienlijk beperkt de vrije (actieve) drug concentratie1,13.
Collectief, kunnen deze factoren komen samen om te beperken van de klinische werkzaamheid van ivacaftor-lumacaftor combinatie. Het is niet bekend of optimale plasmaconcentraties worden bereikt onder de huidige doseringsschema voor ivacaftor-lumacaftor combinatie of als de therapeutische drempel8wordt gehandhaafd. Momenteel, is er een schaarste aan informatie met betrekking tot de farmacokinetische parameters, zoals de piek en steady-state plasmaconcentraties van ivacaftor of ivacaftor-lumacaftor. Gezien het bekende metabolisme van ivacaftor en lumacaftor, is toezicht op blootstelling-respons relaties het vereiste om de optimale dosering regimes voor ivacaftor of ivacaftor-lumacaftor-therapie. Onze fractie heeft onlangs de eerste HPLC/LC-MS methode voor het toezicht op blootstelling-respons relaties van IVA en LUMA14. Tot nu toe geen alternatieve technieken voor het meten van de concentraties van ivacaftor, zijn metabolieten en lumacaftor gemeld. De analyse van de hoge-doorvoer van een grotere patiënt collectief toestaan en analyse tijd drastisch te verminderen, onze fractie de gerapporteerde methode door middel van een kleinere omgekeerde-phase chromatografie kolom van een porie-grootte en een kleurovergang oplosmiddel systeem is geoptimaliseerd dat vermindert kosten en lopende tijden.

<table><tbody><tr><td>IVA (Cat#S114)&nbsp;</td><td>SelleckChem (USA).&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LUMA (Cat#S1565)&nbsp;</td><td>SelleckChem (USA).&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVA-carboxylaat (Cat# 510242247CS)&nbsp;</td><td>Clearsynth (Canada).&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hydroxymethyl-IVA (Cat# 510240849CS)&nbsp;</td><td>Clearsynth (Canada).&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol (MeOH, LC-MS kwaliteit),&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>acetonitril (ACN, LC-MS kwaliteit)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mierenzuur (FA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>triple-quadruple Shimadzu 8030 LC-MS&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenomenex Kinetex (2,6 &micro;m C8 100 &Aring;; 50 &times; 2,1mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(KrudKatcher Ultrea HPLC In-Line Filter 0,5 m Dieptefilter x 0,004inID).&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL polypropyleen microcentrifugebuisje (VWR).&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5430</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>13-mm spuitfilter (0,45 &micro;m nylon, GRACE, USA)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[Phenomenex VEREX, 9 mm, PP, 300 &micro;L, PTFE/Silicone septa].&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

geoptimaliseerde lc-ms/ms methode voor de analyse van de high-throughput van klinische monsters van ivacaftor, de belangrijkste metabolieten daarvan en lumacaftor in biologische vloeistoffen van cystic fibrosis patiënten

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Gebreken in de cystic fibrosis trans-membraan huidgeleiding regulator (CFTR) zijn de oorzaak van cystic fibrosis (CF), een ziekte met levensbedreigende pulmonale manifestaties. Ivacaftor (IVA) en ivacaftor-lumacaftor (LUMA) combinatie zijn twee nieuwe doorbraak CF drugs die rechtstreeks het moduleren van de activiteit en de handel van het defecte CFTR-eiwit. Er is echter nog steeds een gebrek aan inzicht in de farmacodynamische/farmacokinetische parameters en de farmacologie van ivacaftor en lumacaftor. De HPLC-MS-techniek voor de gelijktijdige analyse van de concentraties van ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylaat en lumacaftor in biologische vloeistoffen in patiënten die standaard ivacaftor of ivacaftor-lumacaftor combinatie therapie eerder is ontwikkeld door onze fractie en gedeeltelijk gevalideerd aan de FDA-normen. Echter, zodat de analyse van de hoge-doorvoer van een groter aantal monsters van de patiënt, heeft onze fractie geoptimaliseerd de gerapporteerde methode door het gebruik van een kleinere omgekeerde-phase chromatografie kolom van een porie-grootte (2,6 µm, C8 100 Å; 50 x 2.1 mm) en een kleurovergang oplosmiddel systeem ( 0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: gehouden op 70% B; 2.7-2.8 min: 70-90% B; 2.8-4.0 min: 90% B spoelen; 4.0-4.1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: gehouden op 40% B) in plaats van een isocratic elutie. Het doel van deze studie was om sneller op de HPLC-MS analyses per monster dramatisch van ~ 15 min te slechts 6 minuten per monster, die essentieel is voor de analyse van een grote hoeveelheid patiënt monsters. Deze raadzaam methode zullen van groot nut voor studies in het blootstelling-respons relaties van deze doorbraak CF drugs.

We hebben onlangs gemeld een gedeeltelijk aan FDA-normen, op een triple-vierpolige LC-MS en een HPLC detector systeem, gevalideerde methode met behulp van een C8 kolom (5 µm, 3.9 x 50 mm ID) met de mobiele fase, bestaande uit 100% ACN en 0,1% mierenzuur in water (40:60 v/v) op een debiet van 1 mL/min. Een lineaire correlatie van de pieken werd waargenomen over een concentratiebereik van 0,01 tot 10 µg Fe/mL in menselijk plasma voor alle metabolieten, ivacaftor, Iva-M1, Iva-M6 en lumacaftor14. Hier...

Combinatie van Ivacaftor en ivacaftor-lumacaftor zijn twee nieuwe CF-drugs. Er is echter nog steeds een gebrek aan overeenstemming inzake hun PK/PD en farmacologie. We presenteren een geoptimaliseerde HPLC-MS-techniek voor de gelijktijdige analyse van ivacaftor en de belangrijkste metabolieten daarvan, en lumacaftor.

Geoptimaliseerde LC-MS/MS methode voor de analyse van de High-throughput van klinische monsters van Ivacaftor, de belangrijkste metabolieten daarvan en Lumacaftor in biologische vloeistoffen van Cystic Fibrosis patiënten

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Dit is het protocol voor de monstervoorbereiding voor de plasma-assay. Let op: om de integriteit te waarborgen, moeten alle monsters en standaarden tijdens de inname en verwerking op twee tot acht graden Celsius worden bewaard. Zodra de handelingen zijn voltooid, dienen alle monsters bij minus 20 graden te worden bewaard.Bereid voor de standaardpreparatie twee onafhankelijke voorraadoplossingen van elk anilide, ivacaftor, M1-metaboliet, M6-metaboliet en lumacaftor in methanol in concentraties van 100 µg/mL en 10 µg/mL. Let op: de verbindingen verlopen na 10 dagen bij kamertemperatuur. Breng voor de standaarden 100 µL menselijk plasma over in 1,5 mL polypropyleen microcentrifugebuisjes.Herhaal dit voor al uw overige monsters. Voeg vervolgens de interne standaard toe aan elke buis. In dit voorbeeld kiezen we 0,01 microgram per milliliter van de bereide standaard.Deze buis bevat nu plasma waaraan de interne standaard is toegevoegd. Ga op dezelfde wijze te werk met alle overige standaarden. Neem uw standaarden en centrifugeer deze enkele seconden om er zeker van te zijn dat alle vloeistof zich onderin de buis bevindt.Herhaal dit voor alle 40 standaarden. Breng voor de patiëntenmonsters

optimized-lc-msms-method-for-high-throughput-analysis-clinical

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Non-gerichte metabolietprofilering door ultra-prestatie vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (UPLC-MS) is een krachtige techniek om metabolisme te onderzoeken. Dit artikel schetst een typische werkstroom die wordt gebruikt voor non-gerichte metabolietprofilering van serum, inclusief monsterorganisatie en -voorbereiding, dataverwerving, data-analyse, kwaliteitscontrole en metabolietidentificatie.

Large Scale Niet-gerichte metaboloom profilering van Serum door Ultra Performance Liquid Chromatography-massaspectrometrie (UPLC-MS)

Hier beschrijven we een hoogwaardige vloeistofchromatografie-gekoppelde massaspectrometrie (HPLC-MS/MS) test om het immunosuppressivum tacrolimus in gedroogde bloedvlekken te kwantificeren met behulp van een eenvoudige handmatige eiwitprecipitatiestap en online kolomextractie.

Kwantificering van de Immunosuppressieve tacrolimus op opgedroogd bloed Spots Met behulp van LC-MS / MS

Dit protocol beschrijft een assay voor het meten van CFTR-functie en CFTR-modulatorreacties in gekweekt weefsel van personen met cystische fibrose (CF). Biopsie-afgeleide intestinale organoïden zwellen op een cAMP-gestuurde manier, een reactie die defect (of sterk verminderd) is in CF-organoïden en kan worden hersteld door blootstelling aan CFTR-modulatoren.

Forskoline-geïnduceerde zwelling in Intestinal Organoids: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay voor het beoordelen van de Drug Response in patiënten met cystische fibrose

Metabole competentie van in vitro systemen is een belangrijke voorwaarde voor de biotransformatie en dispositie van drugs en toxische stoffen. In dit protocol beschrijven we de toepassing van referentie- metabole probes fase I metabolisme in celkweken beoordelen.

Massaspectrometrie en luminogene gebaseerde benaderingen voor karakteriseren Fase I Metabolic competentie van<em&gt; In Vitro</em&gt; Cell Cultures

Hier beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer methode voor uitgebreide drug surveillance waarmee voor de betere resolutie en detectie van grote panelen van drugs van misbruik en hun metabolieten, met kwaliteitscontrole op basis van multisegment injectie-capillair elektroforese-massaspectrometrie.

High-throughput en uitgebreide Drug Surveillance met behulp van spectrometrie van de massa van het Multisegment injectie-capillaire elektroforese

Hier presenteren we een robuust protocol voor het kwantificeren van 40 verbindingen die betrokken zijn bij het centrale koolstof-en energiemetabolisme in celvrije eiwitsynthese reacties. Het celvrije synthese mengsel wordt met aniline gekwantificeerd voor effectieve scheiding met behulp van omgekeerde-fase vloeistofchromatografie en vervolgens door massaspectrometrie met behulp van isotopisch gelabelde interne normen.

Absolute kwantificering van de Celvrije eiwitsynthese metabolisme door omgekeerde fase vloeistofchromatografie-massaspectrometrie

De huidige methoden voor het analyseren van de therapietrouw van patiënten aan complexe resistente tuberculose (DR-TB) regimes kunnen onjuist en resource-intensief zijn. Onze methode analyseert haar, een gemakkelijk verzamelde en opgeslagen matrix, voor concentraties van 11 DR-TB medicijnen. Met behulp van LC-MS / MS, kunnen we bepalen sub-nanogram drug niveaus die kunnen worden gebruikt om beter te begrijpen drug therapietrouw.

Gevalideerd LC-MS/MS Panel voor het kwantificeren van 11 resistente tb-medicijnen in small hair samples

Hier beschreven is een protocol voor de bepaling van vier verschillende tryptofaanmetabolieten gegenereerd in de kynurenine route (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic zuur, 3-hydroxyanthranilic zuur) in het medium verzameld uit kankercelculturen geanalyseerd door vloeibare chromatografie in combinatie met een enkele viervoudige massaspectrometrie.

Gelijktijdige kwantificering van geselecteerde kynurenines geanalyseerd door vloeibare chromatografie-massaspectrometrie in medium verzameld uit kankercelculturen

De protocollen beschrijven hoogwaardige vloeistofchromatografiemethoden gekoppeld aan brekingsindex of massaspectrometrische detectie voor het bestuderen van metabole reacties in complexe op lysaat gebaseerde celvrije systemen.

Vloeistofchromatografie gekoppeld aan brekingsindex of massaspectrometrische detectie voor metabolietprofilering in op lysaat gebaseerde celvrije systemen

Dit protocol beschrijft een procedure om de evolutie van mesiale netwerkmaatregelen bij patiënten met temporale lobe epilepsie (TLE) te volgen. Het is gebaseerd op de combinatie van intracraniale opnamen met een nieuwe numerieke techniek voor gegevensanalyse. Specifiek presenteren we een protocol voor netwerkanalyses van foramen ovale opnamen.

Network Analysis van foramen Ovale elektrode Recordings in Resistente temporale lob epilepsiepatiënten

Leer een geoptimaliseerde HPLC-MS methode voor de analyse van ivacaftor, lumacaftor en hun metabolieten in plasma van cystic fibrosis patiënten. Deze techniek ondersteunt therapeutische geneesmiddelenmonitoring en farmacokinetisch onderzoek.

Geoptimaliseerde LC-MS/MS methode voor de analyse van de High-throughput van klinische monsters van Ivacaftor, de belangrijkste metabolieten daarvan en Lumacaftor in biologische vloeistoffen van Cystic Fibrosis patiënten (Video) | JoVE Journal

Geoptimaliseerde LC-MS/MS methode voor de analyse van de High-throughput van klinische monsters van Ivacaftor, de belangrijkste metabolieten daarvan en Lumacaftor in biologische vloeistoffen van Cystic Fibrosis patiënten

Meer video's verkennen