Generatie van inheemse chromatine Immunoprecipitation Sequencing bibliotheken nucleosoom dichtheid p.a.
12 december 2017
We presenteren een gemodificeerde inheemse chromatine immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodologie voor de generatie van reeks datasets geschikt voor een nucleosoom dichtheid ChIP-seq analytisch kader integreren toegankelijkheid micrococcal nuclease (MNase) met Histon wijziging metingen.
Het algemene doel van deze procedure is om native chromatin immunoprecipitation sequencing-bibliotheken te genereren voor nucleosomendichtheidsanalyse. Deze methode kan vragen beantwoorden in de epigenetica, zoals het onthullen van epigenetische kenmerken in een celpopulatie op een enkel nucleosomeniveau en het oplossen van heterogene chromatine-signaturen in hun continue elementen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het gebruik van de MNase-eigenschap van preferentiële toegang tot open chromatine-regio om een meting te genereren die MNase-toegankelijkheid combineert met histonmodificatie.
Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat ze niet in staat zijn om optimale MNase-vertering te verkrijgen. Begin dit protocol met celvoorbereiding zoals beschreven in het tekstprotocol. Op dag één, ontdooi elke celpellet in een 37-graden-Celsius waterbad gedurende 10 seconden.
Breng vervolgens de cellen over naar ijs. Voeg onmiddellijk aan elke celpellet een ijskoude een-X lysebuffer plus een-X PIC toe tot een eindconcentratie van 10.000 cellen per 20 microliter. Meng 10 keer door op en neer te pipetten zonder bubbels te maken.
Werkend op ijs, verdeel 20 microliter van de resulterende lysates per putje in een 96-wellsplaat. Bedek de plaat met de plastic afdichting voordat u deze 20 minuten op ijs incubeert. Label de plaat als MNase en noteer de putjes op een sjabloon.
Net voordat de 20-minuten lyse voltooid is, verdun de MNase een enzym met MNase een verdunningsbuffer tot een eindconcentratie van 20 eenheden per microliter en bewaar het op ijs. Werkend op ijs, bereid de MNase een verteringsmastermix voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Verdeel vervolgens 20 microliter van de mastermix per rij monsters, plus vijf microliter extra volume in een 96-wells reservoirplaat.
Nadat de lysates klaar zijn met incuberen, verwijder de MNase-verteringsplaat van het ijs. Voeg met een multi-kanaals pipet 20 microliter MNase een verteringsmastermix toe aan elke rij monsters en meng door 10 keer op en neer te pipetten. Verwissel de tips tussen rijen.
Vervolgens incubeer de plaat gedurende exact vijf minuten op kamertemperatuur. Om de reactie na vijf minuten te stoppen, gebruik een multi-kanaals pipet om zes microliter 250-micromolaire EDTA toe te voegen aan elke rij monsters en meng een paar keer op en neer. Zorg ervoor dat u de tips tussen rijen verwisselt.
Na toevoeging van EDTA, stel de instelling van de pipet in op 20 microliter en meng 10 keer zoals eerder om volledige stopzetting van de verteringsreactie te garanderen. Voeg vervolgens zes microliter 10X lysebuffer toe aan elke rij van de MNase-verteerde monsters en meng goed door 10 keer op en neer te pipetten. Bedek de plaat met een plastic afdichting en incubeer 15 minuten op ijs.
Bereid de antilichaam-kraalcomplexplaat en de pre-clearingplaat voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Spin snel beide platen door 10 seconden te centrifugeren bij 200 keer G. Plaats vervolgens de antilichaam-kraalcomplexplaat op een plaatmagneet en wacht 15 seconden tot de oplossing helder wordt. Verwijder voorzichtig en gooi het supernatant weg met behulp van een pipet zonder de kralen te verstoren.
Verwijder vervolgens de plaat van de plaatmagneet en houd deze op ijs. Plaats de pre-clearingreactieplaat op een plaatmagneet en wacht 15 seconden tot de kralen zich scheiden en de oplossing helder wordt. Zonder de kralen te verstoren, gebruik een pipet om voorzichtig het supernatant over te brengen naar de overeenkomstige putjes van de antilichaam-kraalcomplexplaat die op ijs wordt bewaard.
Meng elke put zachtjes door 15 keer op en neer te pipetten. Verzegel de plaatput met een aluminium plaatdeksel en incubeer een nacht bij vier graden Celsius op een roterend platform. Na incubatie, herlabel de plaat IP-reactie.
Op dag twee, stel de verwarmingsmixer in op 65 graden Celsius, bereid vervolgens een laag-zout wasbuffer en een hoog-zout wasbuffer op ijs. Spin de IP-reactieplaat snel gedurende 10 seconden bij 200 keer G. Plaats de IP-reactieplaat op een plaatmagneet en wacht 15 seconden tot de oplossing helder wordt. Verwijder en gooi voorzichtig het supernatant weg met behulp van een multi-kanaals pipet zonder de kralen te verstoren.
Haal de plaat van de plaatmagneet en plaats deze op ijs. Voeg aan elke rij monsters in de IP-reactieplaat 150 microliter ijskoude laag-zout wasbuffer toe en meng langzaam 10 keer op en neer om de kralen volledig op te schorsen. Plaats de IP-reactieplaat terug op de plaatmagneet en verwijder het supernatant zoals eerder.
Plaats vervolgens de plaat weer op ijs en herhaal de wasstappen voor een totaal van twee wasbeurten. Werkend op ijs, voeg 150 microliter van de hoog-zout wasbuffer toe aan elke rij monsters in de IP-reactieplaat. Meng de monsters langzaam door 10 keer op en neer te pipetten om de kralen volledig op te schorsen.
Na het verwijderen van het supernatant zoals eerder, plaats de IP-reactieplaat op ijs en koel een nieuwe 96-wellsplaat naast deze voor. Voeg aan elke rij monsters in de IP-reactieplaat 150 microliter van de hoog-zout wasbuffer toe en meng langzaam 10 keer op en neer door op en neer te pipetten om de kralen volledig op te schorsen. Na resuspendering, breng elke rij monsters over naar de overeenkomstige rij van de nieuwe, voorgekoelde 96-wellsplaat.
Gooi de oude plaat weg. Plaats de nieuwe IP-reactieplaat op de plaatmagneet en gooi het supernatant weg zoals eerder. Bewaar de plaat op kamertemperatuur.
Voeg aan elke rij monsters in de IP-reactieplaat 30 microliter van de ChIP-elutiebuffer toe en meng langzaam door 10 keer op en neer te pipetten. Zorg ervoor dat er geen bubbels ontstaan. Verzegel de plaat met een PCR-deksel en incubeer in een verwarmingsmixer bij 65 graden Celsius gedurende 1 1/2 uur met een mengsnelheid
Overzicht
Dit artikel presenteert een gemodificeerde native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodologie gericht op het genereren van sequentiegegevens voor nucleosome dichtheidsanalyse. De methode integreert micrococcal nuclease (MNase) toegankelijkheid met histon modificatiemetingen, waardoor inzichten worden geboden in epigenetische kenmerken op het niveau van een enkel nucleosoom.
Belangrijke Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Epigenetica
- Chromatin biologie
- Genoomsequencing
Achtergrond
- Native ChIP-seq is cruciaal voor het bestuderen van chromatine structuur en functie.
- Het begrijpen van nucleosome dichtheid is belangrijk voor epigenoomanalyse.
- MNase verteert bij voorkeur open chromatine, wat helpt bij de studie van histon modificaties.
- Er bestaan uitdagingen om optimale MNase vertering te bereiken voor nauwkeurige resultaten.
Doel van Studie
- Om een verfijnd ChIP-seq protocol te ontwikkelen voor nucleosome dichtheidsanalyse.
- Om MNase toegankelijkheid te combineren met histon modificatiemetingen.
- Om de resolutie van heterogene chromatine signaturen te vergemakkelijken.
Gebruikte Methoden
- Celvoorbereiding en lysen met ijskoude buffers.
- MNase vertering om chromatine toegankelijkheid te beoordelen.
- Immunoprecipitatie van chromatine met behulp van antilichaam bead complexen.
- Bibliotheekconstructie voor sequencinganalyse.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle generatie van ChIP-seq bibliotheken voor nucleosome dichtheidsanalyse.
- Integratie van MNase toegankelijkheidsgegevens met histon modificatieprofielen.
- Verbeterde resolutie van chromatine signaturen op het niveau van het nucleosoom.
- Protocol optimalisatie voor verbeterde MNase verteringsresultaten.
Conclusies
- De gemodificeerde ChIP-seq methodologie biedt waardevolle inzichten in chromatinedynamiek.
- Deze aanpak kan de begrip van epigenetische regulatie aanzienlijk bevorderen.
- Toekomstige toepassingen kunnen bredere studies van chromatine-gerelateerde fenomenen omvatten.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Native chromatin immunoprecipitation sequencing (ndChIP-seq) enables high-resolution mapping of nucleosome density and histone modifications in rare or primary cell populations. This combinatorial measurement advances predictive confidence in epigenetic target validation and mechanistic de-risking at early discovery inflection points. The approach supports portfolio decisions by clarifying chromatin-driven regulatory mechanisms relevant to transcriptional control.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of chromatin state and histone modification at single nucleosome resolution.
- Supports mechanistic de-risking by resolving heterogeneous chromatin signatures into continuous elements.
- Facilitates functional target validation in rare or primary cell systems inaccessible to cross-linking ChIP-seq.
- Improves predictive confidence for transcriptional regulation hypotheses.
Screening & Assay Development
- Prepares validated chromatin profiles for downstream epigenetic screening workflows.
- Standardizes MNase digestion and immunoprecipitation for reproducible, quantitative outputs.
- Enables robust assay development for histone modification and nucleosome accessibility.
- Supports reliable compound evaluation targeting chromatin modifiers.
Translational & Preclinical Research
- Aligns chromatin state measurements with disease-relevant transcriptional biomarkers.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation in primary or frozen tissue samples.
- De-risks advancement decisions by clarifying epigenetic mechanisms in translational models.
Pipeline & Workflow Integration
ndChIP-seq integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling high-resolution chromatin analysis in systems where traditional cross-linking ChIP-seq is impractical.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on chromatin regulation and transcriptional control.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative nucleosome and histone modification data for assay readiness.
- Analytics: Provides genome-wide measurements and statistical enrichment outputs for comparative analysis.
- Translational Research: Extends applicability to primary cells and frozen tissues for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow for diverse cell types and sample sources.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in epigenetic target validation.
- Operational Value: Standardizes chromatin profiling for reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by clarifying chromatin-driven regulatory mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in chromatin biology and immunoprecipitation techniques.
- Needs access to MNase digestion, high-throughput sequencing, and computational analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization of digestion and antibody validation protocols.
- Adaptable to various model systems, including human, mouse, and frozen tissues.
- Optimal MNase digestion and antibody specificity are critical for reliable outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:51
Cell Lysis and Chromatin Digestion for Nucleosome Density ChIP-se
3:21
Immunprecipitation Reaction for Nucleosome Density ChIP-seq
4:33
Washes and Elution for Nucleosome Density ChIP-seq
7:31
Results: Evaluation of Nucleosome Density ChIP-seq Libraries
8:50
Conclusion
