Generatie van inheemse chromatine Immunoprecipitation Sequencing bibliotheken nucleosoom dichtheid p.a.

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van native chromatin immunoprecipitation sequencing-libraries voor de analyse van de nuclesoomdichtheid. Deze methode kan vragen in de epigenetica beantwoorden, zoals het onthullen van epigenomische kenmerken in een celpopulatie op het niveau van een enkel nuclesoom en het ontleden van heterogene chromatinesignaturen in hun continue elementen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het benutten van de eigenschap van MNase om bij voorkeur toegang te krijgen tot open chromatinegebieden, om zo een meting te genereren die MNase-toegankelijkheid combineert met histonmodificatie.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode problemen ondervinden omdat zij geen optimale MNase-digestie kunnen verkrijgen. Begin dit protocol met de celpreparatie zoals beschreven in het tekstprotocol. Ontdooi op dag één elk celpellet gedurende 10 seconden in een waterbad van 37 °C.

Breng de cellen vervolgens over naar ijs. Voeg onmiddellijk aan elk celpellet een ijskoude een-X lysisbuffer plus een-X PIC toe tot een eindconcentratie van 10 000 cellen per 20 µL. Meng 10 keer door met de pipet op en neer te zuigen zonder bellen te vormen.

Breng, terwijl u op ijs werkt, aliquoten van 20 µL van de resulterende lysaten per put aan in een 96-well plaat. Dek de plaat af met de plastic zegel voordat u deze 20 minuten op ijs incubeert. Label de plaat als MNase en noteer de putten in een sjabloonlegenda.

Vlak voordat de lysis van 20 minuten is voltooid, wordt het MNase one-enzym verdund met MNase one-verdunningsbuffer tot een eindconcentratie van 20 units per microliter en op ijs bewaard. Bereid, terwijl u op ijs werkt, de MNase one-digestie mastermix voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Verdeel vervolgens 20 microliters van de mastermix per rij monsters, plus vijf microliters extra volume, in een 96-well reservoirplaat.

Nadat de lysaten klaar zijn met incuberen, haalt u de plaat voor MNase-digestie van het ijs. Voeg met een meerkanaalspipet 20 µL MNnase one digestie-mastermix toe aan elke rij monsters en meng door 10 keer op en neer te pipetteren. Vervang de tips tussen de rijen.

Incubeer de plaat vervolgens gedurende precies vijf minuten bij kamertemperatuur. Om de reactie na vijf minuten te stoppen, voegt u met een multichannelpipet 6 µL 250 µM EDTA toe aan elke rij monsters en mengt u dit een paar keer door op en neer te pipetteren. Zorg ervoor dat u de tips tussen de rijen wisselt.

Nadat EDTA is toegevoegd, stelt u de pipet in op 20 microliters en mengt u 10 keer zoals voorheen om volledige stopzetting van de digestiereactie te waarborgen. Voeg ten slotte zes microliters 10X lysisbuffer toe aan elke rij van de met MNase gedigesteerde monsters en meng goed door 10 keer op en neer te pipetteren. Dek de plaat af met een plastic folie en laat deze 15 minuten op ijs incuberen.

Bereid de plaat met het antilichaam-kraalcomplex en de pre-clearingplaat voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Centrifugeer beide platen kort gedurende 10 seconden bij 200 ×g. Plaats vervolgens de plaat met het antilichaam-kraalcomplex op een plaatmagneet en wacht 15 seconden tot de oplossing helder is. Verwijder en gooi het supernatant voorzichtig weg met een pipet zonder de kralen te verstoren.

Verwijder vervolgens de plaat van de plaatmagneet en bewaar deze op ijs. Plaats de plaat met de pre-clearingreactie op een plaatmagneet en wacht 15 seconden tot de beads zijn gescheiden en de oplossing helder is geworden. Gebruik een pipet om, zonder de beads te verstoren, het supernatant voorzichtig over te brengen naar de overeenkomstige wells van de plaat met het antilichaam-beadcomplex die op ijs bewaard wordt.

Meng elke put voorzichtig door 15 keer op en neer te pipetteren. Sluit de plaat goed af met een aluminium plaatdeksel en incubeer deze overnacht bij four degrees Celsius op een roterend platform. Label de plaat na incubatie opnieuw als IP Reaction.

Stel op dag twee de verwarmende mengmachine in op 65 °C en bereid vervolgens een wasbuffer met een laag zoutgehalte en een wasbuffer met een hoog zoutgehalte op ijs. Centrifugeer de IP-reactieplaat kort gedurende 10 seconden bij 200 ×g. Plaats de IP-reactieplaat op een plaatmagneet en wacht 15 seconden tot de oplossing helder is. Verwijder en gooi de supernatant voorzichtig weg met een meerkanaals pipet, zonder de kraaltjes te verstoren.

Haal de plaat van de plaatmagneet en plaats deze op ijs. Voeg aan elke rij monsters in de IP-reactieplaat 150 µL ijskoud low-salt wasbuffer toe en meng dit langzaam 10 keer op en neer om de beads volledig te resuspenderen. Plaats de IP-reactieplaat terug op de plaatmagneet en verwijder het supernatant zoals voorheen.

Plaats de plaat vervolgens terug op ijs en herhaal de wasstappen voor een totaal van twee wasbeurten. Voeg, terwijl u op ijs werkt, 150 microliters van de high-salt wash buffer toe aan elke rij monsters in de IP-reactieplaat. Meng de monsters langzaam door 10 keer te pipetteren om de beads volledig te resuspenderen.

Nadat het supernatant zoals voorheen is verwijderd, wordt de IP-reactieplaat op ijs geplaatst en wordt er een nieuwe 96-wells plaat ernaast voorgekoeld. Voeg aan elke rij monsters in de IP-reactieplaat 150 µL van de high-salt wasbuffer toe en meng dit langzaam 10 keer door op en neer te pipetteren om de beads volledig te resuspenderen. Na resuspensie wordt elke rij monsters overgebracht naar de overeenkomstige rij van de nieuwe, voorgekoelde 96-wells plaat.

Gooi de oude plaat weg. Plaats de nieuwe IP-reactieplaat op de plaatmagneet en verwijder het supernatant zoals voorheen. Bewaar de plaat bij kamertemperatuur.

Voeg aan elke rij monsters in de IP-reactieplaat 30 microliters van de ChIP-elutiebuffer toe en meng langzaam door 10 keer op en neer te pipetteren. Zorg ervoor dat er geen bellen worden gevormd. Sluit de plaat af met een PCR-deksel en incubeer in een mengwarmteblok bij 65 degrees Celsius gedurende 1 1/2 uur met een mengsnelheid van 1, 350 RPM.

Na een incubatie van 1 1/2 uur wordt de IP-reactieplaat gecentrifugeerd bij 200 ×g gedurende één minuut bij vier graden Celsius. Plaats de IP-reactieplaat vervolgens op een plaatmagneet en wacht tot de oplossing helder is. Breng met een meerkanaalspipet, zonder de beads te verstoren, voorzichtig 20 µL van het supernatant over naar een nieuwe 96-well plaat, waarbij voor elke rij nieuwe tips worden gebruikt.

Label de plaat als IP Reactie en bewaar deze bij kamertemperatuur. Ga verder met de proteïnedigestie gevolgd door de bibliotheekconstructie zoals beschreven in het tekstprotocol. Hier worden representatieve resultaten getoond van optimaal, onder-gedigesteerd en over-gedigesteerd MNase-gedigesteerd chromatine vóór de generatie van de bibliotheek.

Het optimaal verteerde profiel wordt gedomineerd door fragmentgroottes van enkelvoudige nucleosomen, zonder dat er sprake is van oververtering, zodat fragmenten van hogere-orde nucleosomen kunnen worden teruggewonnen. Suboptimale vertering van chromatine zal ook zichtbaar zijn in het profiel van de sequencing-bibliotheek die is gegenereerd uit het IP-materiaal. Om de bibliotheken via qPCR te valideren, werd de fold enrichment van de IP-bibliotheken ten opzichte van de input-bibliotheek beoordeeld voor positieve en negatieve targets.

Daarnaast zou inspectie van de uitgelijnde reads van bibliotheken met een hoge, via qPCR vastgestelde fold-enrichment op een genoombrowser visueel detecteerbare verrijkingen moeten onthullen in vergelijking met de input-bibliotheek. Succesvolle nucleosoomdichtheid ChIP-sequencing-bibliotheken zullen sterk gecorreleerde replicaten bevatten, waarbij een significant deel van de uitgelijnde reads zich bevindt binnen de door MACS2 geïdentificeerde verrijkte pieken. Zodra de techniek onder de knie is, kan deze in twee dagen worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u native chromatin immunoprecipitation sequencing-bibliotheken genereert voor nucleosoomdichtheidsanalyse. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om ervoor te zorgen dat het chromatine optimaal is gedigesteerd en alleen antilichamen te gebruiken die een hoge affiniteit vertonen met het epitope van belang en weinig of geen kruisreactiviteit vertonen met andere epitopen. Na deze procedure kan computationele modellering van MNase-toegankelijkheid worden uitgevoerd om vragen te beantwoorden over bijvoorbeeld epigenetische signaturen als gevolg van heterogeniteit binnen een celpopulatie.

Deze methode biedt inzicht in het combinatorische effect van de nucleosoompositie en de lokale dichtheid, evenals de posttranslationele modificatie van hun histone-subunits, en kan worden toegepast op diverse systemen, zoals mens of muis, primaire cellen en bevroren weefsels.