Name: Beoordeling van Dopaminerge homeostase in muizen door gebruik van High-performance Liquid Chromatography analyse en Synaptosomal Dopamine opname (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Leer twee technieken om dopaminehomeostase in muizen te beoordelen: synaptosomale dopamine-opname en HPLC-analyse. Deze methoden meten dopaminegehalte en transporterfunctie na in-vivo manipulaties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de UCPH 2016 programma van Excellence (U.G., A.R., K.J.), de Stichting van Lundbeck (M.R.) de Lundbeck Stichting Centrum voor biomembranen in nanogeneeskunde (U.G.), het Nationaal Instituut van gezondheid subsidies P01 DA 12408 (U.G.), de Deense Raad voor onafhankelijk onderzoek - medische wetenschappen (U.G.).

<ol><li>Tritsch, N. X., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+modulation+of+synaptic+transmission+in+cortex+and+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic modulation of synaptic transmission in cortex and striatum.</a> Neuron. 76, 33-50 (2012).</li>
<li>Cartier, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biochemical+and+functional+protein+complex+involving+dopamine+synthesis+and+transport+into+synaptic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles.</a> J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).</li>
<li>Kristensen, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLC6+neurotransmitter+transporters%3A+structure%2C+function%2C+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation.</a> Pharmacol Rev. 63, 585-640 (2011).</li>
<li>Gainetdinov, R. R., Caron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoamine+transporters%3A+from+genes+to+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Monoamine transporters: from genes to behavior.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 261-284 (2003).</li>
<li>Runegaard, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+dopaminergic+homeostasis+and+dopamine-related+behaviour+in+hemizygous+TH-Cre+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Preserved dopaminergic homeostasis and dopamine-related behaviour in hemizygous TH-Cre mice.</a> Eur J Neurosci. 45, 121-128 (2017).</li>
<li>Whittaker, V. P., Michaelson, I. A., Kirkland, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+separation+of+synaptic+vesicles+from+nerve-ending+particles+%28%27synaptosomes%27%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">The separation of synaptic vesicles from nerve-ending particles ('synaptosomes').</a> Biochem J. 90, 293-303 (1964).</li>
<li>Hornykiewicz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+%283-hydroxytyramine%29+and+brain+function%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Dopamine (3-hydroxytyramine) and brain function.</a> Pharmacol Rev. 18, 925-964 (1966).</li>
<li>Schultz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+dopamine+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Behavioral dopamine signals.</a> Trends Neurosci. 30, 203-210 (2007).</li>
<li>Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiology%2C+signaling%2C+and+pharmacology+of+dopamine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors.</a> Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).</li>
<li>Giros, B., Jaber, M., Jones, S. R., Wightman, R. M., Caron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperlocomotion+and+indifference+to+cocaine+and+amphetamine+in+mice+lacking+the+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hyperlocomotion and indifference to cocaine and amphetamine in mice lacking the dopamine transporter.</a> Nature. 379, 606-612 (1996).</li>
<li>Torres, G. E., Amara, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+and+monoamine+transporters%3A+new+visions+of+form+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Glutamate and monoamine transporters: new visions of form and function.</a> Curr Opin Neurobiol. 17, 304-312 (2007).</li>
<li>Jones, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profound+neuronal+plasticity+in+response+to+inactivation+of+the+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 4029-4034 (1998).</li>
<li>Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+slice+biotinylation%3A+an+ex+vivo+approach+to+measure+region-specific+plasma+membrane+protein+trafficking+in+adult+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons.</a> J Vis Exp. , (2014).</li>
<li>Rickhag, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C-terminal+PDZ+domain-binding+sequence+is+required+for+striatal+distribution+of+the+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A C-terminal PDZ domain-binding sequence is required for striatal distribution of the dopamine transporter.</a> Nat Commun. 4, 1580(2013).</li>
<li>Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+Percoll+gradient+procedure+for+preparation+of+synaptosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes.</a> Nat Protoc. 3, 1718-1728 (2008).</li>
<li>Whittaker, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thirty+years+of+synaptosome+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Thirty years of synaptosome research.</a> J Neurocytol. 22, 735-742 (1993).</li>
<li>Schmitz, Y., Benoit-Marand, M., Gonon, F., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+regulation+of+dopaminergic+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Presynaptic regulation of dopaminergic neurotransmission.</a> J Neurochem. 87, 273-289 (2003).</li>
<li>Yang, L., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+neurotransmitter+levels+in+models+of+Parkinson%27s+disease+by+HPLC-ECD%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Determination of neurotransmitter levels in models of Parkinson's disease by HPLC-ECD.</a> Methods Mol Biol. 793, 401-415 (2011).</li>
<li>Earles, C., Schenk, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotating+disk+electrode+voltammetric+measurements+of+dopamine+transporter+activity%3A+an+analytical+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rotating disk electrode voltammetric measurements of dopamine transporter activity: an analytical evaluation.</a> Anal Biochem. 264, 191-198 (1998).</li>
<li>Wu, Q., Reith, M. E., Kuhar, M. J., Carroll, F. I., Garris, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+increases+in+nucleus+accumbens+dopamine+after+systemic+cocaine+administration+are+caused+by+unique+characteristics+of+dopamine+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Preferential increases in nucleus accumbens dopamine after systemic cocaine administration are caused by unique characteristics of dopamine neurotransmission.</a> J Neurosci. 21, 6338-6347 (2001).</li>
<li>Schonfuss, D., Reum, T., Olshausen, P., Fischer, T., Morgenstern, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+constant+potential+amperometry+for+investigations+of+dopaminergic+neurotransmission+kinetics+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Modelling constant potential amperometry for investigations of dopaminergic neurotransmission kinetics in vivo.</a> J Neurosci Methods. 112, 163-172 (2001).</li>
<li>Hoover, B. R., Everett, C. V., Sorkin, A., Zahniser, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+regulation+of+dopamine+transporters+by+tyrosine+kinases+in+rat+neuronal+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Rapid regulation of dopamine transporters by tyrosine kinases in rat neuronal preparations.</a> J Neurochem. 101, 1258-1271 (2007).</li>
<li>Hansen, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Missense+dopamine+transporter+mutations+associate+with+adult+parkinsonism+and+ADHD%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Missense dopamine transporter mutations associate with adult parkinsonism and ADHD.</a> J Clin Invest. 124, 3107-3120 (2014).</li>
<li>Damier, P., Hirsch, E. C., Agid, Y., Graybiel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+substantia+nigra+of+the+human+brain.+II.+Patterns+of+loss+of+dopamine-containing+neurons+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The substantia nigra of the human brain. II. Patterns of loss of dopamine-containing neurons in Parkinson's disease.</a> Brain. 122 (Pt 8), 1437-1448 (1999).</li>
<li>Atack, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+determination+of+dopamine+by+a+modification+of+the+dihydroxyindole+fluorimetric+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The determination of dopamine by a modification of the dihydroxyindole fluorimetric assay.</a> Br J Pharmacol. 48, 699-714 (1973).</li>
<li>Yoshitake, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitive+liquid+chromatographic+method+for+determination+of+neuronal+release+of+serotonin%2C+noradrenaline+and+dopamine+monitored+by+microdialysis+in+the+rat+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">High-sensitive liquid chromatographic method for determination of neuronal release of serotonin, noradrenaline and dopamine monitored by microdialysis in the rat prefrontal cortex.</a> J Neurosci Methods. 140, 163-168 (2004).</li>
<li>Decressac, M., Mattsson, B., Lundblad, M., Weikop, P., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+neurodegenerative+and+behavioural+changes+induced+by+AAV-mediated+overexpression+of+alpha-synuclein+in+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Progressive neurodegenerative and behavioural changes induced by AAV-mediated overexpression of alpha-synuclein in midbrain dopamine neurons.</a> Neurobiol Dis. 45, 939-953 (2012).</li>
<li>Huot, P., Johnston, T. H., Koprich, J. B., Fox, S. H., Brotchie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-DOPA+pharmacokinetics+in+the+MPTP-lesioned+macaque+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">L-DOPA pharmacokinetics in the MPTP-lesioned macaque model of Parkinson's disease.</a> Neuropharmacology. 63, 829-836 (2012).</li>
<li>Mikkelsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MPTP-induced+Parkinsonism+in+minipigs%3A+A+behavioral%2C+biochemical%2C+and+histological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol+Teratol%22%5BJournal%5D)">MPTP-induced Parkinsonism in minipigs: A behavioral, biochemical, and histological study.</a> Neurotoxicol Teratol. 21, 169-175 (1999).</li>
<li>Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Dempsey, C., Fields, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+profiling+of+dopamine+regulation+in+substantia+nigra+and+ventral+tegmental+area%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Comprehensive profiling of dopamine regulation in substantia nigra and ventral tegmental area.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Van Dam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+distribution+of+biogenic+amines%2C+amino+acids+and+cholinergic+markers+in+the+CNS+of+the+C57BL%2F6+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Regional distribution of biogenic amines, amino acids and cholinergic markers in the CNS of the C57BL/6 strain.</a> Amino Acids. 28, 377-387 (2005).</li>
<li>Barth, C., Villringer, A., Sacher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+hormones+affect+neurotransmitters+and+shape+the+adult+female+brain+during+hormonal+transition+periods%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sex hormones affect neurotransmitters and shape the adult female brain during hormonal transition periods.</a> Front Neurosci. 9 (37), (2015).</li>
<li>Corthell, J. T., Stathopoulos, A. M., Watson, C. C., Bertram, R., Trombley, P. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+bulb+monoamine+concentrations+vary+with+time+of+day%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Olfactory bulb monoamine concentrations vary with time of day.</a> Neuroscience. 247, 234-241 (2013).</li>
<li>Zhuang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactivity+and+impaired+response+habituation+in+hyperdopaminergic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hyperactivity and impaired response habituation in hyperdopaminergic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 1982-1987 (2001).</li>
<li>Ungerstedt, U., Pycock, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4371656">Functional correlates of dopamine neurotransmission.</a> Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30, 44-55 (1974).</li>
<li>Wickham, R. J., Park, J., Nunes, E. J., Addy, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+Rapid+Dopamine+Dynamics+with+Fast+Scan+Cyclic+Voltammetry+During+Intra-oral+Tastant+Administration+in+Awake+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats.</a> J Vis Exp. , e52468(2015).</li>
<li>Phillips, P. E., Robinson, D. L., Stuber, G. D., Carelli, R. M., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurements+of+phasic+changes+in+extracellular+dopamine+concentration+in+freely+moving+rats+by+fast-scan+cyclic+voltammetry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry.</a> Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).</li>
<li>Callaghan, P. D., Irvine, R. J., Daws, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+in+vivo+dynamics+of+neurotransmitter+release+and+serotonin+uptake+after+acute+para-methoxyamphetamine+and+3%2C4-methylenedioxymethamphetamine+revealed+by+chronoamperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Differences in the in vivo dynamics of neurotransmitter release and serotonin uptake after acute para-methoxyamphetamine and 3,4-methylenedioxymethamphetamine revealed by chronoamperometry.</a> Neurochem Int. 47, 350-361 (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit manuscript beschrijft nuttige experimentele protocollen te bakenen DA homeostase in een muismodel van keuze. We bieden gedetailleerde protocollen voor meten niveaus van DA in hersenweefsel van muizen met behulp van HPLC en synaptosomal DA opname te beoordelen van functionele DA vervoer door middel van DAT. De procedures, de protocollen en de grenzen voor de HPLC-experiment en synaptosomal DA opname bepaling zal hieronder worden uitgewerkt.
Het protocol synaptosomal opname kan nuttig inzich...

Dopamine (DA) is een cruciaal voor motor gedrag, de beloning en de cognitieve functie1,,7,,8,9f neurotransmitter. Onevenwichtigheden in de homeostase van de DA zijn betrokken bij verschillende neuropsychiatrische ziekten zoals de wanorde van de Hyperactiviteit van de aandacht-tekort, drugsverslaving, depressie en de ziekte van Parkinson1. DA is vrijgelaten uit het presynaptische neuron in de synaptische spleet, waar het aan bindt en activeert de receptoren op de pre- en postsynaptisch membraan, waardoor verdere overbrengen van het signaal. Het niveau van DA in de synaps na release is ruimtelijk en stoffelijk gecontroleerd door DAT3,10. De vervoerder sequesters DA van de extracellulaire ruimte, en dus voedt fysiologische DA niveaus-3,11. Genetische verwijdering van DAT bij muizen veroorzaakt een hyperdopaminergic fenotype gekenmerkt door verhoogde synaptic DA niveaus, uitputting van intracellulaire DA zwembaden en ingrijpende veranderingen in postsynaptisch DAergic signalering van10,12.
Hier twee afzonderlijke protocollen worden gepresenteerd, een methode maatregel DA weefsel inhoud en een andere om te beoordelen van de functionaliteit van DAT. gecombineerd met de bepaling van de oppervlakte biotinylation beschreven door Gabriel et al.13 deze twee methoden bevatten informatie over DA inhoud en functionele niveaus van DAT voor een grondige beoordeling van DA homeostase. Met deze methoden kunt DA homeostase van verschillende transgene muizen of modellen van de ziekte worden gekenmerkt en beschreven. Deze hulpprogramma's zijn uitgevoerd en geoptimaliseerd en zijn standaard gebruik in onze laboratoria. Huidige testen hebben gediend om te onderzoeken van de gevolgen voor de DA-homeostase van het veranderen van de C-terminal van DAT14 of uiting van Cre recombinase onder de tyrosine hydroxylase (TH) promotor 5.

<table><tbody><tr><td>COMT-remmer</td><td>Sigma Aldrich, Duitsland</td><td>RO-41-0960</td><td>Voor synaptosomale DA-opnameprotocol</td></tr><tr><td>[3H]-Dopamine</td><td>Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, VS</td><td>NET67-3001MC</td><td>Voor synaptosomale DA-opnameprotocol</td></tr><tr><td>Glas microvezel filters</td><td>GF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire</td><td>1822-024</td><td>Voor synaptosomale DA-opnameprotocol</td></tr><tr><td>HiSafe Scintillatievloeistof</td><td>Perkin Elmer</td><td>1200-437</td><td>Voor synaptosomale DA-opnameprotocol</td></tr><tr><td>MicroBeta2</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Voor synaptosomale DA-opnameprotocol</td></tr><tr><td>BCA Protein Assay kit</td><td>Thermo Scientific Pierce</td><td>23225</td><td>Voor synaptosomale DA-opnameprotocol</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Life Science</td><td>H3375</td><td>Voor synaptosomale DA-opnameprotocol</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Life Science</td><td>S7903</td><td>Voor synaptosomale DA-opnameprotocol</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Life Science</td><td>S3014</td><td>Voor synaptosomale DA-opnameprotocol</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Life Science</td><td>P9541</td><td>Voor synaptosomale DA-opnameprotocol</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck KGaA</td><td>10043-52-4</td><td>Voor synaptosomale DA-opnameprotocol</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma Life Science</td><td>63065</td><td>Voor synaptosomale DA-opnameprotocol</td></tr><tr><td>Ascorbic Acid</td><td>Sigma Life Science</td><td>A0278</td><td>Voor synaptosomale DA-opnameprotocol</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma Life Science</td><td>G7021</td><td>Voor synaptosomale DA-opnameprotocol</td></tr><tr><td>Pargyline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-8013</td><td>Voor synaptosomale DA-opnameprotocol</td></tr><tr><td>Desipramine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D3900</td><td>Voor synaptosomale DA-opnameprotocol</td></tr><tr><td>Dopamine</td><td>Sigma Life Science</td><td>H8502</td><td>Voor synaptosomale DA-opnameprotocol</td></tr><tr><td>Cocaine</td><td>Sigma Life Science</td><td>C5776</td><td>Voor synaptosomale DA-opnameprotocol</td></tr><tr><td>Brain matrix</td><td>ASI instruments</td><td>RBM2000C</td><td>Voor synaptosomale DA-opnameprotocol</td></tr><tr><td>Cafano mechanische teflon verstuiver</td><td>Buch &amp; Holm</td><td>Discontinued</td><td>Voor synaptosomale DA-opnameprotocol (homogenisatie)</td></tr><tr><td>Antec Decade (Amperometrisch detector)</td><td>Antec, Leiden, Nederland</td><td>Discontinued: nieuw model DECADE Elite / Lite&trade; Elektrochemische Detector type 175 en 176</td><td>Voor HPLC-protocol</td></tr><tr><td>Avantec 0,22 µm glazen filter</td><td>Frisenette ApS, Denemarken</td><td>13CP020AS</td><td>Voor HPLC-protocol</td></tr><tr><td>Kolom: Prodigy 3 µ ODS-3 C18</td><td>Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Duitsland</td><td>Artikelnummer: 00A-3300-E0</td><td>Voor HPLC-protocol</td></tr><tr><td>LC-oplossing software</td><td>Shimadzu</td><td>LabSolutions Series Workstation</td><td>Voor HPLC-protocol</td></tr><tr><td>Perchlorzuur 0,1M</td><td>Fluka Analytical</td><td>35418-500ml</td><td>Voor HPLC-protocol (weefselvoorbereiding)</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134-50g</td><td>Voor HPLC-protocol</td></tr><tr><td>Natriumdiwaterstoffosfaat</td><td>Bie&amp;Berntsen</td><td>1.06346 1000g</td><td>Voor HPLC-protocol</td></tr><tr><td>Natrium 1-octaansulfonaat monohydraat</td><td>Aldrich</td><td>74885 -10g</td><td>Voor HPLC-protocol</td></tr><tr><td>Acetonitril, isocratisch HPLC-kwaliteit</td><td>Scharlau</td><td>AC03402500</td><td>Voor HPLC-protocol</td></tr><tr><td>Filtre 0,22um</td><td>Frisenette ApS, Denemarken</td><td>Avantec 13CP020AS</td><td>Voor HPLC-protocol (weefselvoorbereiding)</td></tr><tr><td>ortho-Fosforzuur 85%</td><td>Merck</td><td>1.00563. 1000ml</td><td>Voor HPLC-protocol</td></tr><tr><td>Elektrode</td><td>Antec, Leiden, Nederland</td><td>AN1161300</td><td>Voor HPLC-protocol (zie handleiding online)</td></tr><tr><td>Detectorprogramma op DECADE II elektrochemische detector</td><td>Antec, Leiden, Nederland</td><td>Lite&trade; Elektrochemische Detector type 175 en 176</td><td>Voor HPLC-protocol</td></tr></tbody></table>

beoordeling van dopaminerge homeostase in muizen door gebruik van high-performance liquid chromatography analyse en synaptosomal dopamine opname

Assessment of Dopaminergic Homeostasis in Mice by Use of High-performance Liquid Chromatography Analysis and Synaptosomal Dopamine Uptake

Dopamine (DA) is een f neurotransmitter beheersing van motorische activiteit, beloning processen en cognitieve functie. Bijzondere waardevermindering van de Dopaminerge (DAergic) transmissie is sterk geassocieerd met diverse centrale zenuwstelsel-geassocieerde ziekten zoals de ziekte van Parkinson, aandacht-deficit-hyperactivity disorder en drug verslaving1,2 ,3,4. Uitgezet ziekte mechanismen waarbij DA onbalans is kritisch afhankelijk van diermodellen om na te bootsen van aspecten van de ziekten, en dus protocollen die specifieke delen van de DA-homeostase te beoordelen zijn belangrijk om te bieden van nieuwe inzichten en mogelijke therapeutische doelstellingen voor deze ziekten.
Hier presenteren we twee nuttige experimentele protocollen die combinatie bieden een functionele uitlezing van het systeem van de DAergic in muizen. Biochemische en functionele parameters op DA homeostase zijn verkregen door middel van de beoordeling van de niveaus van de DA en dopamine transporter (DAT) functionaliteit5. Bij het onderzoeken van de DA-systeem, is de mogelijkheid voor het betrouwbaar meten endogene voor DA van volwassen hersenen essentieel. Daarom presenteren we het uitvoeren van krachtige vloeibare chromatografie (HPLC) op hersenweefsel van muizen om niveaus van DA. Wij voeren het experiment op weefsel van de dorsale striatum (dStr) en nucleus accumbens (NAc), maar de methode is ook geschikt voor andere DA-geïnnerveerd hersengebieden.
DAT is essentieel voor reuptake voor DA in de presynaptische terminal, waardoor beheersing van de temporele en ruimtelijke activiteit van vrijgegeven DA. Het kennen van de niveaus en de functionaliteit van DAT in het striatum is van groot belang bij de beoordeling van DA homeostase. Hier, bieden wij een protocol waarmee gelijktijdig om informatie te deduceren op oppervlakte niveaus en functie met behulp van een synaptosomal6 DA opname assay.
Huidige methoden gecombineerd met standaard immunoblotting protocollen bieden de onderzoeker met relevante tools karakteriseren van het DAergic-systeem.

Huidige DA opname protocol (Figuur 1) omvat alle noodzakelijke stappen voor het beoordelen van de functionaliteit van DAT in synaptosomes van muizen. Onze representatieve gegevens van de DA opname methode (Figuur 2) toont een verzadiging kromme met niet-gecorrigeerde gegevens (figuur 2B) en gezuiverde gegevens (figuur 2A). De verzadiging curve toont opname van wild type ...

Synaptosomal dopamine opname en krachtige vloeibare chromatografie vertegenwoordigen experimentele analysetools te onderzoeken van dopamine homeostase in muizen door beoordeling van de functie van de dopamine transporter en niveaus van dopamine in striatale weefsel, respectievelijk. Hier presenteren we protocollen voor dopamine weefsel inhoud meten en beoordelen van de functionaliteit van de dopamine transporter.

Beoordeling van Dopaminerge homeostase in muizen door gebruik van High-performance Liquid Chromatography analyse en Synaptosomal Dopamine opname

Dopamine (DA) is a modulatory neurotransmitter controlling motor activity, reward processes and cognitive function. Impairment of dopaminergic (DAergic) ...

In dit protocol introduceren we twee technieken. Het doel van de eerste is om de functie van de dopaminetransporteur te beoordelen door de dopamine-opname uit synaptosomale preparaten te meten. De tweede techniek dient voor het bepalen van de dopamineniveaus in weefsel via HPLC-analyse.Deze methoden leveren belangrijke parameters van de dopamine-homeostase door aan te tonen hoe het dopaminegehalte in weefsel kan worden gemeten en hoe de functionaliteit van de dopaminetransporteur bij muizen kan worden beoordeeld. Het belangrijkste voordeel van deze technieken is dat ze kunnen worden uitgevoerd na in-vivo manipulaties, zoals chemogenetische manipulaties, in-vivo drugbehandelingen of gedragstraining van de dieren. De HPLC-procedure zal worden gedemonstreerd door Pia Weikop, Associate Professor aan het Laboratory of Neuropsychiatry.Om deze procedure te starten, wordt de schedel vrijgelegd door de huid door te snijden en eventueel overtollig weefsel te verwijderen. Snijd vervolgens de schedel langs de sutura sagittalis, helemaal tot aan de anteriorzijde. Plaats de schaarsuppen in de ogen en verwijder de resterende schedel door hier doorheen te knippen.Verwijder de hersenen snel en plaats deze in ijskoude PBS. Dissecteer vervolgens met behulp van een brain matrix een coronale plak van drie millimeter van het striatum. Dit wordt gevolgd door een fijnere dissectie met een punctienaald.Breng de weefsels vervolgens over naar een microcentrifugebuis van 1,5 millimeter om ze te wegen. Herhaal daarna de procedures voor de tweede hersenen. Zodra het gewicht van beide hersenen is bepaald, worden de weefsels overgebracht naar een homogenisatieglas met één milliliter ijskoude homogenisatiebuffer.Homogeniseer daarna het weefsel met een elektrisch aangedreven stamper. Breng vervolgens het homogenaat over naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en verzamel het resterende homogenaat uit het homogenisatieglas door dit te spoelen met 0,5 milliliter extra homogenisatiebuffer. Pelleteer daarna de kernen en het celdebris door middel van centrifugatie.Breng vervolgens het supernatant dat de celmembranen en het cytoplasma bevat over naar nieuwe microcentrifugebuisjes van 1,5 milliliter en centrifugeer gedurende 20 minuten bij vier degree celsius. Verwijder daarna het supernatant dat het cytoplasma bevat en resuspendeer de pellet met ruwe synaptosomen in 40 microliters per milligram weefsel homogenisatiebuffer. Voeg in deze stap 440 microliters opnamebuffer, ligand en cocaïne toe aan 12 aangewezen microcentrifugebuisjes van 1,5 milliliter, en 440 microliters opnamebuffer en ligand aan de resterende 36 microcentrifugebuisjes van 1,5 milliliter.Label zes microcentrifugebuisjes van twee milliliter als 10, 5, 2,5, 1,25, 0,62 en 0,31. Voeg vervolgens 750 µL opnamebuffer en ligand toe aan de vijf microcentrifugebuisjes met de laagste nummers. Voeg daarna 1.455,4 µL opnamebuffer en ligand, 14,6 µL ongemarkeerde dopamine en 30 µL getritieerde dopamine toe aan het buisje met het label 10.Breng vervolgens 750 microliters van het mengsel over van de buis met label 10 naar de buis met label 5. Meng goed en breng 750 microliters van het mengsel uit deze buis over naar de buis met label 2,5. Herhaal deze verdunning met de overige buizen.Spoel daarna de glazen microvezelfilters voor met vier milliliter opnamebuffer nadat deze in een filterbak met 12 putjes zijn geplaatst. Voeg vervolgens 10 microliters van de synaptosomale membraansuspensie toe aan de eerste 24 microcentrifugebuisjes van 1,5 milliliter die 440 microliters buffer bevatten. Vortex voorzichtig en centrifugeer kort om ervoor te zorgen dat de synaptosomen volledig in de buffer zijn ondergedompeld.Laat ze vervolgens 10 minuten bij 37 °C staan. Voeg na 10 minuten 50 µL dopamine van 10 µM en 5 µM toe aan de eerste twee kolommen en laat ze vijf minuten bij 37 °C staan onder schudding. Stop na vijf minuten de reactie door 1 mL ijskoud opnamebuffer toe te voegen; herhaal dit met 2,5 µM en 1,25 µM, en vervolgens met 0,62 µM en 0,31 µM.Voeg de monsters toe aan de vooraf gespoelde microvezelfilters en was deze met vijf keer 4 mL ijskoud opnamebuffer. Nadat de eerste 12 monsters aan de filters zijn toegevoegd, worden de filters overgebracht naar scintillatiebuisjes. Herhaal dit met de volgende 12 monsters.Bereid drie buisjes voor voor maximale telling door een microvezelfilter in de bodem van scintillatiebuisjes 49 tot en met 51 te plaatsen en hierop 25 microliters van de maximale dopamine van 10 micromolar toe te voegen. Laat vervolgens alle 51 scintillatiebuisjes gedurende één uur in een zuurkast staan. Voeg daarna drie milliliters scintillatievloeistof toe aan elk scintillatiebuisje en schud deze gedurende één uur krachtig op een schudmachine.Om getriteerde dopamine gedurende één minuut in een betateller te tellen, opent u het programma en kiest u de geschikte instellingen. Voor de eiwitbepaling gebruikt u een standaard BCA-eiwitassaykit om de eiwitconcentraties van de synaptosomen te bepalen voor aanpassingen en voor een correcte vergelijking van de opname tussen monsters. Voor de weefselpreparatie voegt u 500 µL homogenisatieoplossing toe aan elk monster en homogeniseert u alle monsters met een ultra-homogenisator op volledige snelheid gedurende ongeveer 30 seconden.Houd de monsters in ijswater tijdens de homogenisatie. Centrifugeer de monsters vervolgens gedurende 30 minuten bij 4 °C en 14.000 ×g. Breng daarna ongeveer 200 µL van elk monster over op een glazen 0,22 µm filter voordat de monsters worden geanalyseerd via de EC-HPLC-methode. Stel de detector in door de output op 700 mV en de temperatuur van de detectoroven op 32 °C te zetten.Plaats de vials in de autosampler. Maak een range-programma met behulp van de online handleiding en voeg het tijdschema toe volgens tabel twee. Configureer het systeem door het programma te openen.Voer vervolgens de gebruikers-ID en het wachtwoord in en klik op ok. Wacht daarna tot het programma verbinding maakt met de instrumenten. Ga vervolgens naar de batchtabel en vul de gegevensinformatie in.Sla het bestand op door naar bestand te gaan, klik vervolgens op 'batchbestand opslaan als' en daarna op opslaan. Injecteer vervolgens het eerste monster door op 'batch starten' te drukken. Ga daarna naar gegevensverwerving om het chromatogram te volgen zodra de monsters zijn verwerkt.Ga vervolgens naar LC post run analysis en selecteer de bestandsnaam. Klik daarna op view. Voeg in de balk voor handmatige integratie alle te integreren pieken toe, ga vervolgens naar data report en print de uitslag.Nadat het programma aan de detector is toegevoegd, wordt een kalibratiecurve met drie punten gemaakt door de bereide standaard in hoeveelheden van 5, 10 en 15 µL te injecteren. In deze figuur tonen de representatieve gegevens de verzadigingscurve van de dopamine-opname via de dopaminetransporteur uit synaptosomale preparaten van wild-type muizen. De zwarte stippen zijn de waarden van de vier muizen, afzonderlijk weergegeven.De groene curve laat zien hoe gegevens normaal gesproken zouden worden weergegeven door gegevens van vier tot zes muizen per groep te combineren. Hier is de verzadigingsgrafiek van de ruwe gegevens voordat er is gecorrigeerd voor de werkelijke proteïneconcentratie van de monsters. Deze grafiek toont de counts van de monsters die cocaïne bevatten, welke worden gebruikt om de achtergrond van de opnamegegevens af te trekken.Deze controle is essentieel om de betrouwbaarheid van de opnamedata te bepalen. Dit histogram toont de opnamecapaciteit van de dopaminetransporteur en dit histogram laat zien dat de Km voor de dopaminetransporteur 0,1 plus of minus 0,03 µM is, wat goed overeenkomt met de methode van roterende schijf-voltammetrie, waarbij Km-waarden van de dopaminetransporteur tussen 0,6 en 1,2 µM worden weergegeven. Bij het uitvoeren van de synaptosomale procedure is het belangrijk om het weefsel tijdens de bereiding van de synaptosomen te allen tijde op ijs te houden.Na de synaptosoom-assay voor dopamine-opname kunnen aanvullende procedures, zoals de oppervlakte-biotinyleringsassay, worden uitgevoerd om vast te stellen of een verstoorde dopamine-opname kan worden verklaard door een gewijzigde oppervlakte-expressie van de dopaminetransporteur. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe de dopamine-homeostase bij muizen kan worden onderzocht door de functionaliteit van de dopaminetransporteur en de dopaminegehaltes in striatale weefselpreparaten te analyseren.

assessment-dopaminergic-homeostasis-mice-use-high-performance-liquid

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een protocol voor het uitvoeren van unilaterale 6-OHDA letsels van de mediale voorhersenen bundel bij muizen wordt beschreven. Deze methode heeft een laag sterftecijfer (13,3%) met 89% van de overlevende dieren die&gt; 95% verlies van striatale dopamine en 90,63 ± -4,02% ipsiversive rotatie voorkeur voor de kant van de laesie.

Ontwikkeling van een eenzijdig-gelaedeerde 6-OHDA muismodel van de ziekte van Parkinson

De amperometrische techniek meet dopamine afgifte van een enkele cel door het detecteren van de stroom die door oxidatieve spontane dopamine oxidatie. Gelijktijdig spanning klem en amperometrie methodologie onthullen de mechanistische relatie tussen de totale "activiteit" van dopamine transporter en de regulerende rol van deze activiteit op de achterzijde transport van dopamine.

Single Cell Meting van dopamine-afgifte met gelijktijdige Voltage-klem en amperometrie

Dopamine is duidelijk geregeld in de middenhersenen kernen, die de cellichamen en dendrieten van de dopamine neuronen bevatten. Hier beschrijven we een dissectie en sample-handling aanpak om de resultaten te maximaliseren, en dus conclusies en inzichten, op dopamine regelgeving in de middenhersenen kernen van de substantia nigra (SN) en ventrale tegmentale gebied (VTA) bij knaagdieren.

Uitgebreide Profilering van Dopamine verordening in de substantia nigra en het ventrale tegmentale gebied

This video demonstrates the assessment of dopamine uptake in synaptosomes harvested from mouse brains. It outlines steps for preparing synaptosomes for dopamine uptake via dopamine transporters, treating them with varying concentrations of radiolabeled dopamine, isolating the synaptosomes, and measuring radioactivity to quantify dopamine uptake.

Measuring Dopamine Uptake in Mouse Brain Synaptosomes Using Radiolabeled Dopamine

De ziekte van Parkinson en bewegingsstoornissen in het algemeen, gevoelig en betrouwbaar gedrag assays zijn essentieel voor het testen van nieuwe potentiële geneesmiddelen. We beschrijven hier een beheersbare batterij sensorimotorische tests voor muizen die gevoelig zijn voor verschillende mate van schade aan het nigrostriatale systeem en nuttig voor preklinische studies.

Beoordeling van Sensorimotor Functie in muismodellen van de ziekte van Parkinson

Hier beschrijven we twee testen die zijn opgericht om leeftijdsafhankelijke neurodegeneratie van de dopaminerge (DA) neuronen studeren...

Het beoordelen Neurodegenerative Fenotypes in<em&gt; Drosophila</em&gt; Dopaminerge neuronen reduceert door Klimmen Testen en Whole Brain Immunokleuring

Lipoxygenase (LOX) isozymen kunnen producten genereren die neuro-inflammatie en neurodegeneratie kunnen verhogen of verminderen. Een gen-omgeving interactiestudie kan LOX isozym-specifieke effecten identificeren. Met behulp van het 1-methyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) model van nigrostriatale schade in twee LOX isozym-deficiënte transgene lijnen maakt het mogelijk om de bijdrage van LOX-isozymen aan dopaminerge integriteit en ontsteking te vergelijken.

Gen-omgeving Interactiemodellen om gevoeligheidsmechanismen bij de ziekte van Parkinson te ontmaskeren

Deze paper gegevens het gebruik van vaste-potentieel amperometrische opnamen met behulp van koolstofvezel elektroden en de enzymatische biosensor technologie voor het meten van de vrijlating van dopamine en glutamaat met hoge temporele resolutie tijdens natuurlijke lonende gedrag in de vrouwelijke hamster.

Meten van In Vivo veranderingen in extracellulaire Neurotransmitters tijdens natuurlijk belonen van gedrag in vrouwelijke Syrische Hamsters

We presenteren een handige solid-phase extraction gekoppeld aan hogedruk-vloeistofchromatografie (HPLC) met elektrochemische detectie (ECD) voor gelijktijdige bepaling van drie monoamino neurotransmitters en twee van hun metabolieten in de urine van zuigelingen. Wij identificeren ook de metaboliet MHPG als een potentiële biomarker voor de vroege diagnose van hersenschade voor zuigelingen.

Een handige methode voor de extractie en analyse met hogedruk-vloeistofchromatografie Catecholamine Neurotransmitters en hun metabolieten

Identificatie van dopamine D1-alpha receptor in de nucleus accumbens is van cruciaal belang voor de verduidelijking van de D1-receptor dysfunctie tijdens een ziekte van het centrale zenuwstelsel. Wij uitgevoerd een roman RNA in situ hybridisatie assay om te visualiseren single molecules van RNA in een specifieke hersenen gebied.

Identificatie van Dopamine D1-Alpha Receptor binnen knaagdier Nucleus Accumbens door een innovatieve RNA In Situ de technologie van de opsporing

Deze methode introduceert een eenvoudige techniek voor de detectie van endogene monoamineafgifte met behulp van acute hersenplakken. De opstelling maakt gebruik van een 48-well plaat met daarin een weefselhouder voor monoamineafgifte. Vrijgegeven monoamine wordt geanalyseerd door HPLC in combinatie met elektrochemische detectie. Bovendien biedt deze techniek een screeningsmethode voor het ontdekken van geneesmiddelen.

Een op platen gebaseerde test voor de meting van endogene monoamineafgifte in acute hersenplakken

Leer twee technieken om dopaminehomeostase in muizen te beoordelen: synaptosomale dopamine-opname en HPLC-analyse. Deze methoden meten dopaminegehalte en transporterfunctie na in-vivo manipulaties.

Beoordeling van Dopaminerge homeostase in muizen door gebruik van High-performance Liquid Chromatography analyse en Synaptosomal Dopamine opname (Video) | JoVE Journal

Beoordeling van Dopaminerge homeostase in muizen door gebruik van High-performance Liquid Chromatography analyse en Synaptosomal Dopamine opname

Meer video's verkennen