Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera met een Sialoglycan Microarray Assay
13 juli 2017
Een sialoglycan microarray test kan gebruikt worden om anti-Neu5Gc antilichamen in humane sera te evalueren, waardoor het een potentiële diagnostische test voor kanker en andere chronische ontstekingsgemedieerde menselijke ziekten is.
Het algemene doel van de sialoglycan-microarray-test is om Anti-Neu5Gc IgG in menselijk serum op hoog rendement te evalueren tegen een diverse verzameling van sialoglycanen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het gebied van glyco-immunologie te beantwoorden, zoals hoe Anti-Neu5Gc antilichamen betrokken zijn bij verschillende menselijke ziekten, waaronder kanker, hartziekten en xenotransplantatie. Het grote voordeel van deze techniek is dat het hoog rendement profilering van Anti-Neu5Gc antilichamen mogelijk maakt tegen een groot aantal sialoglycan-antigenen.
De procedure zal worden gedemonstreerd door Sharon Yehuda, een masterstudent uit mijn laboratorium. Zorgvuldige en gedetailleerde planning van het fabricageproces en de lay-out van het array is belangrijk om succes te garanderen. Dit proces wordt beschreven in het tekstprotocol en de aanvullende informatie.
Verdun elk glycan tot 100 micromolar in een totaal volume van 100 microliter glycan-printbuffer in microcentrifugebuizen. Bereid vervolgens een primaire amine bevattende fluorescerende kleurstof tot een milligram per millimeter met markerbuffer. Verdun vervolgens tot één microgram per milliliter in een totaal volume van één milliliter.
Bereid menselijke IgG-standaardcurveverdunningen voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Plaats de 384-well plate op ijs. Gebruik een elektronische multi-pipet om zeven microliters van elk glycaan, marker en standaardcurve IgG te verdelen volgens de plate lay-out die in het tekstprotocol staat.
Dek de plaat af met parafilm en centrifugeer gedurende twee minuten bij 250 keer g en 12 graden Celsius. Het printen moet worden uitgevoerd in een stofvrije ruimte met een luchtvochtigheid van 60 tot 70%. Hier worden alle stappen uitgevoerd in een schone ruimte met geschikte handschoenen en kleding ter bescherming. Zet de nanoprinter machine en bevochtiger aan.
Nadat de printmachine is geprogrammeerd zoals beschreven in het tekstprotocol, plaats de 384-well plate met verdeelde monsters op de juiste locatie op het arrayer dek en verwijder de parafilm deksel. Op dit punt begint u met printen. Nummer de slides met een alcoholbestendige markeerstift en bewaar ze in een vacuümverzegelde doos in het donker.
Om de arrays te verwerken, haalt u eerst een slide uit de vacuümverzegelde doos en plaatst deze gedurende vijf minuten in een chemische kap, met de array naar boven, om het overtollige vocht te laten verdampen. Hydrateer vervolgens de slide door deze in een kleuringsbuis gevuld met gedeïoniseerd water te plaatsen. Bedek de buis met folie en incubeer gedurende vijf minuten met langzaam en zacht schudden bij kamertemperatuur.
Om de reactieve epoxygroepen op de slide te blokkeren, dompelt u de slide in de 50 milliliter kleuringsbuis gevuld met voorverwarmde ethanolamine blokkeringsoplossing. Bedek de buis met folie en incubeer gedurende 30 minuten met langzaam en zacht schudden bij kamertemperatuur. Gooi de ethanolamine blokkeringsoplossing in de juiste biogevaarlijke prullenbak.
Plaats vervolgens de slide in een nieuwe, schone kleuringsbuis gevuld met 50 graden Celsius gedeïoniseerd water. Bedek de buis met folie en incubeer gedurende tien minuten met langzaam en zacht schudden bij kamertemperatuur. Goot het water weg en breng de slides over naar een glazen kleuringshouder.
Plaats het apparaat in een slingerende platenhouder en centrifugeer de slide droog. Plaats vervolgens de slide op een 16-well verdeler. Nadat de wells zijn voorgeweekt, gebruik een multi-pipet om 200 microliter PBST in de slide wells te verdelen.
Plaats ze vervolgens in een afgedekte, vochtige kamer en schud gedurende vijf minuten. Verwijder de PBST door voorzichtig te slaan en te tikken op een schone papieren handdoek. Verdeel vervolgens 200 microliter PBS-Ovalbumine blokkeringsbuffer in elk well.
Plaats de slides in een vochtige kamer en incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur met zacht schudden. Bereid vervolgens de primaire detectie, verdund in PBS-OVA blokkeringsbuffer zoals beschreven in het tekstprotocol. Sla PBS-OVA blokkeringsbuffer van de slide en voeg 200 microliter primaire antilichaam per well toe.
Incubeer de slides in een vochtige kamer gedurende twee uur. Sla vervolgens de primaire detectie van de slide en was drie keer met PBST. Incubeer de slide in PBST gedurende vijf minuten in een vochtige kamer voordat u een laatste keer met PBST wast.
Was vervolgens eenmaal met PBS. Bereid vervolgens de secundaire antilichamen in PBS zoals beschreven in het tekstprotocol. Sla de PBS van de slide en voeg 200 microliter secundair antilichaam toe.
Sla de secundaire antilichamen van de slide en was vier keer met PBST zoals eerder. Verwijder voorzichtig de lijst en plaats de slides vervolgens in een 50 milliliter slide kleuringsbuis gevuld met PBS en schud gedurende vijf minuten. Vul vervolgens twee slide kleuringsbaden met gedeïoniseerd water.
Plaats de slide in de slide houder en dompel de slide in het eerste bad. Duik snel tien keer in het bad. Breng vervolgens de slide over naar het tweede bad en dompel tien keer meer in.
Na het dompelen, incubeer de slide gedurende tien minuten bij kamertemperatuur met schudden. Goot na de incubatie het water weg en breng de slide over naar een glazen kleuringshouder. Plaats de glazen kleuringshouder in een slingerende platenhouder en centrifugeer de slide droog.
Open de scannerdeur en plaats de slide erin, met de array naar beneden. Op dit punt begint u met scannen. Sla de gescande slides op als een TIFF-bestand.
Om een slide voor analyse voor te bereiden, selecteert u 'Array List laden' en upload het juiste GAL-bestand dat de arrays in elke blok op de slide toont. Slides werden ontwikkeld met 16 verschillende primaire detectie-moieties, één in elke blok. De plant Lectin SNA bindt a2-6 gekoppelde sialinezuur.
Terwijl de plant Lectin MALII bindt a2-3 gekoppelde sialinezuur. Polyclonal Anti-Neu5Gc IgY bindt Neu5Gc-bevattende sialoglycanen, maar bindt niet Neu5Ac-bevattende sialoglycanen. Om Anti-Neu5Gc IgG te profileren,
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
De sialoglycaan-microarray-assay evalueert Anti-Neu5Gc IgG in menselijke sera, wat high-throughput-analyse tegen diverse sialoglycanen mogelijk maakt. Deze methode is van groot belang voor het begrijpen van de rol van Anti-Neu5Gc-antilichamen bij ziekten zoals kanker en chronische ontsteking.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Glyco-immunologie
- Chronische ontsteking
- Cancerdiagnostiek
Achtergrond
- Anti-Neu5Gc-antilichamen zijn betrokken bij verschillende menselijke ziekten.
- Inzicht in hun rol kan helpen bij de ontwikkeling van diagnostische instrumenten.
- De assay maakt profilering mogelijk tegen een diverse collectie sialoglycanen.
- High-throughput-methoden zijn essentieel voor grootschalige studies.
Doel van het onderzoek
- Om Anti-Neu5Gc-antilichamen in menselijk serum te evalueren.
- Om hun betrokkenheid bij diverse ziekten te onderzoeken.
- Om een high-throughput diagnostische assay te ontwikkelen.
Gebruikte methoden
- Sialoglycaan-microarray-assay
- High-throughput profilering
- Fabricage van de array en planning van de lay-out
- Gedetailleerd protocol en aanvullende informatie verstrekt
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle evaluatie van Anti-Neu5Gc IgG in menselijke sera.
- Demonstratie van de effectiviteit van de assay bij het profileren van antilichamen.
- Inzichten in de relatie tussen antilichamen en ziekten.
- Potentieel voor gebruik in cancerdiagnostiek en studies naar chronische inflammatie.
Conclusies
- De sialoglycaan-microarray-assay is een veelbelovend diagnostisch instrument.
- Het vergroot het inzicht in de glyco-immunologie binnen ziektecontexten.
- Toekomstige toepassingen kunnen de diagnostiek en behandelstrategieën voor patiënten verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Het profileren van anti-Neu5Gc IgG in menselijke sera maakt mechanische risicoreductie mogelijk van glyco-immunologische targets bij kanker en chronische ontsteking. De high-throughput sialoglycaan-microarray-assay levert kwantitatieve, reproduceerbare gegevens ter ondersteuning van target-validatie en assay-ontwikkelingspipelines. Deze aanpak vergroot het voorspellend vertrouwen bij het koppelen van blootstelling aan antigenen via het dieet aan ziekterelateerde immuunresponsen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen over de rol van anti-Neu5Gc-antilichamen bij kanker en ontsteking.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk door de antilichaamspecificiteit tegen Neu5Gc-bevattende glycanen te meten.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt voorspellend vertrouwen door middel van diverse serumprofilering bij gezonde donoren.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream-workflows met behulp van covalent gebonden sialoglycanen op epoxy-gecoate objectglazen.
- Operationele waarde: Pakt standaardisatie en reproduceerbaarheid van assays aan via gecontroleerde printen van 56 objectglazen in 16-well formaat.
- Wetenschappelijke waarde: Maakt betrouwbare evaluatie van verbindingen mogelijk door 16 verschillende menselijke sera per objectglas te screenen op antilichaamintensiteit en -diversiteit.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Bespreekt de relevantie voor ziekten door anti-Neu5Gc-antilichamen te koppelen aan carcinomen en ziekten die door chronische inflammatie worden veroorzaakt.
- Operationele waarde: Beschrijft de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie met behulp van menselijke serummonsters.
- Wetenschappelijke waarde: Richt zich op de voorspellende waarde voor risicoreductie door het identificeren van diverse herkenningspatronen tussen sera.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De methode ondersteunt ontdekkingsbiologie door middel van hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden in de glyco-immunologie.
- Discovery Biology: Legt uit hoe de methode bijdraagt aan hypothesetoetsing, pathway-verduidelijking of biologische risicoreductie.
- Screening: Beschrijft de assay-gereedheid, reproduceerbaarheid of kwantitatieve resultaten wanneer dit door het artikel wordt ondersteund.
- Analytics: Benadrukt metingen, read-outs of statistische resultaten die teams helpen om condities te vergelijken.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt de methode met preklinische continuïteit of biomarker-afstemming, uitsluitend wanneer de bron dit ondersteunt.
- Enterprise Reuse: Presenteert de methode als een herbruikbare capaciteit in plaats van een eenmalige techniek.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen, targetvalidatie, vermindering van mechanistische ambiguïteit.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Betere go/no-go beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling.
Overwegingen voor implementatie
- Vereiste wetenschappelijke expertise in glyco-immunologie en de omgang met microarrays.
- Behoeften op het gebied van instrumentatie en analytische infrastructuur, waaronder een nanoprinter en scanner.
- Eisen voor standaardisatie tussen teams voor de fabricage en indeling van de array.
- Overwegingen bij aanpassing aan verschillende modelsystemen, zoals variërende menselijke serummonsters.
- Praktische beperkingen op basis van het bronmateriaal, waaronder de noodzaak van een stofvrije omgeving met gecontroleerde luchtvochtigheid.
