Name: Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera met een Sialoglycan Microarray Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Leer de sialoglycan-microarray-assay voor het evalueren van Anti-Neu5Gc IgG in menselijk serum. Deze high-throughput methode ondersteunt glyco-immunologieonderzoek naar kanker en chronische ontsteking.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een Research Career Development Award van het Israël Cancer Research Fund, een subsidie ​​van het Israëlische National Nanotechnology Initiative en het Helmsley Charitable Trust voor een focal technologiegebied op Nanomedicines for Personalized Theranostics (VP-K) en National Instituten van Gezondheidstoelaag R01GM076360 (naar XC).

<ol><li>Padler-Karavani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aiming+at+the+sweet+side+of+cancer%3A+Aberrant+glycosylation+as+possible+target+for+personalized-medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Aiming at the sweet side of cancer: Aberrant glycosylation as possible target for personalized-medicine.</a> Cancer Lett. 352 (1), 102-112 (2014).</li>
<li>Amon, R., Reuven, E. M., Leviatan Ben-Arye,, Padler-Karavani, S., V, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycans+in+immune+recognition+and+response%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Res%22%5BJournal%5D)">Glycans in immune recognition and response.</a> Carbohydr Res. 389, 115-122 (2014).</li>
<li>Häuselmann, I., Borsig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+tumor-cell+glycosylation+promotes+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Altered tumor-cell glycosylation promotes metastasis.</a> Front Oncol. 4, (2014).</li>
<li>Tangvoranuntakul, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+uptake+and+incorporation+of+an+immunogenic+nonhuman+dietary+sialic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (21), 12045-12050 (2003).</li>
<li>Bardor, M., Nguyen, D. H., Diaz, S., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+uptake+and+incorporation+of+the+non-human+sialic+acid+N-glycolylneuraminic+acid+into+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of uptake and incorporation of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid into human cells.</a> J Biol Chem. 280 (6), 4228-4237 (2005).</li>
<li>Padler-Karavani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+in+specificity%2C+abundance%2C+and+composition+of+anti-Neu5Gc+antibodies+in+normal+humans%3A+potential+implications+for+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Diversity in specificity, abundance, and composition of anti-Neu5Gc antibodies in normal humans: potential implications for disease.</a> Glycobiology. 18 (10), 818-830 (2008).</li>
<li>Padler-Karavani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+xeno-autoantibodies+against+a+non-human+sialic+acid+serve+as+novel+serum+biomarkers+and+immunotherapeutics+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Human xeno-autoantibodies against a non-human sialic acid serve as novel serum biomarkers and immunotherapeutics in cancer.</a> Cancer Res. 71 (9), 3352-3363 (2011).</li>
<li>Cao, H., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+consideration+on+sialic+acid+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">General consideration on sialic acid chemistry.</a> Methods Mol Biol. 808, 31-56 (2012).</li>
<li>Deng, L., Chen, X., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+sialic+Acid+diversity+and+biology+using+sialoglycan+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Exploration of sialic Acid diversity and biology using sialoglycan microarrays.</a> Biopolymers. 99 (10), 650-665 (2013).</li>
<li>Liang, C. H., Hsu, C. H., Wu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sialoside+Arrays%3A+New+Synthetic+Strategies+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Top+Curr+Chem%22%5BJournal%5D)">Sialoside Arrays: New Synthetic Strategies and Applications.</a> Top Curr Chem. 367, 125-149 (2015).</li>
<li>Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Smith, D. F., Cummings, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+microarrays+of+fluorescently-tagged+natural+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Glycan microarrays of fluorescently-tagged natural glycans.</a> Glycoconj J. 32 (7), 465-473 (2015).</li>
<li>Muthana, S. M., Gildersleeve, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+microarrays%3A+powerful+tools+for+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biomark%22%5BJournal%5D)">Glycan microarrays: powerful tools for biomarker discovery.</a> Cancer Biomark. 14 (1), 29-41 (2014).</li>
<li>Rillahan, C. D., Paulson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+microarrays+for+decoding+the+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Glycan microarrays for decoding the glycome.</a> Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).</li>
<li>Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F., Cummings, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+analysis+of+glycan+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Preparation and analysis of glycan microarrays.</a> Curr Protoc Protein Sci. 12 (10), (2011).</li>
<li>Park, S., Gildersleeve, J. C., Blixt, O., Shin, I. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2013/cs/c2cs35401b#!divAbstract">Carbohydrate microarrays.</a> Chem Soc Rev. 42 (10), 4310-4326 (2013).</li>
<li>Struwe, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+minimum+information+required+for+a+glycomics+experiment+%28MIRAGE%29+project%3A+sample+preparation+guidelines+for+reliable+reporting+of+glycomics+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: sample preparation guidelines for reliable reporting of glycomics datasets.</a> Glycobiology. 26 (9), 907-910 (2016).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+minimum+information+required+for+a+glycomics+experiment+%28MIRAGE%29+project%3A+improving+the+standards+for+reporting+glycan+microarray-based+data%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data.</a> Glycobiology. , (2016).</li>
<li>Hara, S., Yamaguchi, M., Takemori, Y., Furuhata, K., Ogura, H., Nakamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+mono-O-acetylated+N-acetylneuraminic+acids+in+human+and+rat+sera+by+fluorometric+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determination of mono-O-acetylated N-acetylneuraminic acids in human and rat sera by fluorometric high-performance liquid chromatography.</a> Anal Biochem. 179 (1), 162-166 (1989).</li>
<li>Padler-Karavani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-comparison+of+protein+recognition+of+sialic+acid+diversity+on+two+novel+sialoglycan+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cross-comparison of protein recognition of sialic acid diversity on two novel sialoglycan microarrays.</a> J Biol Chem. 287 (27), 22593-22608 (2012).</li>
<li>Padler-Karavani, V., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+impact+of+the+non-human+sialic+acid+N-glycolylneuraminic+acid+on+transplant+rejection+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">Potential impact of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid on transplant rejection risk.</a> Xenotransplantation. 18 (1), 1-5 (2011).</li>
<li>Samraj, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+red+meat-derived+glycan+promotes+inflammation+and+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A red meat-derived glycan promotes inflammation and cancer progression.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (2), 542-547 (2015).</li>
<li>Pearce, O. M., Läubli, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sialic+acids+in+cancer+biology+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Sialic acids in cancer biology and immunity.</a> Glycobiology. 26 (2), 111-128 (2016).</li>
<li>Alisson-Silva, F., Kawanishi, K., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+risk+of+diseases+associated+with+red+meat+intake%3A+Analysis+of+current+theories+and+proposed+role+for+metabolic+incorporation+of+a+non-human+sialic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">Human risk of diseases associated with red meat intake: Analysis of current theories and proposed role for metabolic incorporation of a non-human sialic acid.</a> Mol Aspects Med. 51, 16-30 (2016).</li>
<li>Pearce, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverse+hormesis+of+cancer+growth+mediated+by+narrow+ranges+of+tumor-directed+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Inverse hormesis of cancer growth mediated by narrow ranges of tumor-directed antibodies.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 111 (16), 5998-6003 (2014).</li>
<li>Pham, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+novel+human-specific+xeno-auto-antibody+response+against+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Evidence for a novel human-specific xeno-auto-antibody response against vascular endothelium.</a> Blood. 114 (25), 5225-5235 (2009).</li>
<li>Reuven, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+immunogenic+Neu5Gc+in+bioprosthetic+heart+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">Characterization of immunogenic Neu5Gc in bioprosthetic heart valves.</a> Xenotransplantation. 23 (5), 381-392 (2016).</li>
<li>Ghaderi, D., Taylor, R. E., Padler-Karavani, V., Diaz, S., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+the+presence+of+N-glycolylneuraminic+acid+in+recombinant+therapeutic+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Implications of the presence of N-glycolylneuraminic acid in recombinant therapeutic glycoproteins.</a> Nat Biotechnol. 28 (8), 863-867 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een succesvolle glycan microarray fabricage vereist een zorgvuldige planning en bevat diverse belangrijke stappen in het protocol. Deze omvatten: (1) het plannen van de blok- en plaatlayouts die alle volgende parameters bepalen ( bijv. Afstanden, afstand, hoeveelheid monsters en afdrukken); (2) het schoonmaken van de pennen en het waarborgen van de pin integriteit, die van cruciaal belang is voor het controleren van spot homogeniteit; (3) het handhaven van hoge vochtigheid tijdens het printen, kritisch om vermi...

Sias zijn zure suikers die glycan ketens op glycoproteïnen op glycoproteïnen en glycolipiden in vertebraten omvatten. Sia expressie is gemodificeerd in kankercellen 1 en correleert met progressie en / of metastase 2 , 3 . Twee van de belangrijkste Sia-vormen in zoogdieren zijn Neu5Ac en zijn gehydroxyleerde vorm, Neu5Gc 2 . Mensen kunnen Neu5Gc niet synthetiseren door een specifieke inactivatie van het gen dat codeert voor het CMAH-enzym. Deze niet-humane Sia bevat metabolisch in menselijke cellen als &#39;zelf&#39;, afkomstig van voedings Neu5Gc-rijke voedingsmiddelen ( bijv. Rood vlees) 4 , 5 . Neu5Gc is aanwezig op lage niveaus op de celoppervlakken van menselijke epithelia en endothelia, maar komt vooral bij carcinomen op. Neu5Gc wordt herkend als vreemd door het humane humoral immune system 2 , 6 .De antigeencomplexiteit van Neu5Gc-glycanen kan zich op meerdere niveaus voordoen, inclusief Neu5Gc-modificatie, koppeling, onderliggende glycanen en steigers, en hun dichtheid, die allemaal weerspiegeld worden door de complexiteit van anti-Neu5Gc antilichaamrespons bij mensen 6 . Sommige van deze antilichamen dienen als carcinombiomarkers en potentiële immunotherapeutica 7 . De komst van de chemo-zymatische synthese van verschillende sialoglycanen 8 heeft de weg geboden voor de diepgaande analyse van dergelijke antilichamen, gefaciliteerd door het gebruik van glycan microarray technologie 9 , 10 . Dus, met de gefaciliteerde voorbereiding en manipulatie van grote bibliotheken van natuurlijke en synthetische koolhydraten, zijn glycan microarrays een krachtige high-throughput technologie geworden voor het onderzoeken van de interacties van koolhydraten met een groot aantal biomoleculen 10 , 11 , </sup&gt; 12 , 13 . In een matrixformaat worden minimale hoeveelheden materialen gebruikt, en dit multivalente display van biologisch relevante glycanen zorgt voor het onderzoek naar duizenden bindende interacties in een enkel experiment. Belangrijk is dat deze technologie ook kan worden toegepast op biomarker ontdekking en het controleren van immuunresponsen in diverse monsters 7 , 12 . Succesvolle glycan microarray fabricage vereist het overwegen van drie belangrijke aspecten: het type printer robot, glycan conjugation chemistry en detectie optica. Met betrekking tot het afdrukinstrument zijn twee technieken beschikbaar: contact- en niet-contactprinters. In contactdruk worden 1-48 stalen pennen gedompeld in een multi-well bronplaat die glycanoplossing bevat en worden gespot op gefunctionaliseerde glijbanen door direct contact op te nemen met het glazen glijvlak. De oplossing bedraagt ​​deLevering aan de dia is een functie van de langdurige duur op het dia oppervlak. Meestal worden de monsters eerst voorgespoten op een glasblok (om homogene plekken te bereiken) voordat ze op het dia-oppervlak worden gedrukt. Bij niet-contactprinters ( bijv. De piezo-elektronische printer) worden de glycanen gedrukt vanuit een glazen capillaire met behulp van gecontroleerde elektrische signalen. Het elektrische signaal kan fijn gekalibreerd worden om nauwkeuriger afdrukken te verkrijgen ten opzichte van het afdrukken van contacten. De grootte en morfologie van de vlekken zijn ook relatief meer homogeen. Een extra voordeel is het recyclen van het monster terug naar de bronplaat na het afdrukken. Niettemin is het grote nadeel van piëzo-elektronische printers de drukknopbeperking (4 of 8), wat resulteert in een zeer lange drukduur, waarbij speciale aandacht moet worden besteed aan de stabiliteit, de temperatuur, de vochtigheid en de verdamping van het monster. De non-contact inkjetprinter vereist grotere voorbeeldvolumes 14 . <p clasS = &quot;jove_content&quot;&gt; In tegenstelling tot de beperkte beschikbare opties voor drukwerkmethoden, is de glycan conjugation chemistry een complexere overweging, met veel mogelijkheden om uit te kiezen. Geselecteerde immobilisatiechemie moet rekening houden met zowel de actieve groepen op de glycanen als de reactiviteit van de glijoppervlak. De glycanen die geïmmobiliseerd moeten worden op een specifiek microarray oppervlak, ofwel synthetisch gesynthetiseerd of natuurlijk geïsoleerd, hebben allemaal een identieke reactieve groep nodig. Bovendien moeten de glycanen zuiver en homogeen zijn. Aan de andere kant moet het immobilisatieoppervlak en de chemie reproduceerbaarheid en betrouwbare bevestigingsdichtheid verschaffen. Meerdere immobilisatiemethoden zijn ontwikkeld met ofwel covalente of niet-covalente (fysieke absorptie) bijlage 10 , 11 , 12 , 13 . Voor zeer gedetailleerde informatie over gedrukte glycan microarray technologie voor de oninitiateD-onderzoeker, verwijzen naar deze uitstekende beoordelingen 13 , 15 . Belangrijk is dat de recente Minimale Informatie Verplicht voor een Glycomics Experiment (MIRAGE) initiatief omschrijft richtlijnen voor steekproefbereiding 16 en voor het rapporteren van gegevens uit glycan microarray analyses 17 om de normen in dit groeiende veld te verbeteren. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de fabricage van sialoglycan microarrays met behulp van een specifieke contact nano-printer in een 16-vel formaat. Elk van de glycanen heeft een primaire amine die hun covalente verbinding met epoxy geactiveerde glazen glijbanen bemiddelt. We beschrijven ook de ontwikkeling en analyse van een dia met behulp van diverse menselijke sera-monsters, antilichamen en Sia-bindende plantentectines. Sialoglycan microarray analyses betreffen meerdere belangrijke stappen die matrix fabricage, verwerking, ontwikkeling en analyse omvatten. Array fabricage vereist de planning van de arRay-lay-out, bereiding van de glycanen en bronplaat, het programmeren van de nano-printer en het afdrukken van de dia&#39;s. Vervolgens worden de dia&#39;s verwerkt, ontwikkeld en geanalyseerd ( Figuur 1 ).

<table><tbody><tr><td>Primary-amine bevattende sialoglycanen</td><td>Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services)</td><td>Neem contact op met info@glycohubusa.com voor compound verzoeken</td><td>Gedrukte glycanen</td></tr><tr><td>Mononatriumfosfaat monohydraat</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>Print buffer component</td></tr><tr><td>Dinatriumfosfaat heptahydraat</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td>Print buffer component</td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing</td><td>Hy-Labs</td><td>BP-507/500D</td><td>Print buffer/ incubatie/was buffer</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Slide blokkeringsreagens</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G-7893</td><td>Print buffer component</td></tr><tr><td>Ethanolamine</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>0700/08</td><td>Slide blokkeringsreagens</td></tr><tr><td>Ovalbumine (Grade V)</td><td>Sigma</td><td>A5503</td><td>Slide blokkeringseiwit</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td>Slide wasmiddel</td></tr><tr><td>Alexa 555-Hydrazide</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A20501MP</td><td>Marker op array</td></tr><tr><td>ChromPure Human IgG, volledig molecuul</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>009-000-003</td><td>Print component</td></tr><tr><td>Biotinyleerde- SNA</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1305</td><td>Plant leukeen &ndash; binding Sia-alpha2&ndash;6-gekoppeld</td></tr><tr><td>Biotinyleerde-MALII</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1265</td><td>Plant leukeen &ndash; binding Sia-alpha2&ndash;3-gekoppeld</td></tr><tr><td>Chicken-anti Neu5Gc IgY</td><td>BioLegend</td><td>146903</td><td>Primaire detectie</td></tr><tr><td>Cy3-Streptavidin</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>016-160-0848</td><td>Biotine binding</td></tr><tr><td>Cy3-anti Human IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>109-165-088</td><td>Secundaire detectie tegen human IgG</td></tr><tr><td>Cy3-anti Chicken IgY</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>703-165-155</td><td>Secundaire detectie tegen chicken IgY</td></tr><tr><td>Humane serum monsters</td><td>Israëlische Bloedbank</td><td></td><td>Primaire detectie</td></tr><tr><td>Gecomprimeerde stikstof (Grade 5)</td><td></td><td></td><td>Algemeen stof-/drooginstrument</td></tr><tr><td>Epoxy-gecoate slides</td><td>Corning</td><td>40044</td><td>Slides</td></tr><tr><td>Epoxy-gecoate slides</td><td>PolyAn</td><td>2D 104-00-221</td><td>Slides. Bij dit type slides is het oppervlak meer hydrofoob (in vergelijking met Corning slides), daarom moet de glycanen Print Buffer worden aangevuld met 0,005% Tween-20 om 100 &micro;m grootte spots te verkrijgen.</td></tr><tr><td>384-well microtiterplaat</td><td>Genetix</td><td>2070</td><td>Printplaat</td></tr><tr><td>VWR lab marker</td><td>VWR</td><td>52877-310</td><td>Slide labelen</td></tr><tr><td>Vlekbad</td><td>ArrayIt</td><td>MST</td><td>Slide ontwikkeling tool</td></tr><tr><td>Vlekbad</td><td>VWR</td><td>25608-904</td><td>Slide ontwikkeling tool</td></tr><tr><td>Slides glazen houders</td><td>VWR</td><td>631-9321</td><td>Slide ontwikkeling tool</td></tr><tr><td>GenePix Scanner</td><td>Molecular devices</td><td>4000B</td><td>Slide scanner</td></tr><tr><td>LM-60 NanoPrinter</td><td>ArrayIt</td><td>LM-60</td><td>Array printer</td></tr><tr><td>Pins</td><td>ArrayIt</td><td>946MP3</td><td>Print pins</td></tr><tr><td>ProPlate Module</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>P37004</td><td>Slide ontwikkeling module</td></tr><tr><td>Gedistilleerde water</td><td>Bio-Lab</td><td>2321020500</td><td>Vereist voor arrayer en bevochtiger</td></tr><tr><td>Elektronische Multi Pipette, 8 Kanaal, volumebereik 2-125 &mu;L</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Matrix)</td><td>MA-2131 Impact2 Equalizer 384</td><td>Multi pipette voor monsters in de 384-well plaat te verdelen</td></tr></tbody></table>

profiling anti-neu5gc igg in human sera met een sialoglycan microarray assay

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay 

Cellen zijn bedekt met een mantel koolhydratenketens (glycanen) die gewoonlijk veranderd zijn in kanker en die variaties in siaalzuur (Sia) expressie omvatten. Dit zijn zure suikers die een 9-carbon ruggengraat hebben en die vertebraten glycanen op de celoppervlakken dichten. Twee van de belangrijkste Sia-vormen in zoogdieren zijn N- acetylneuraminezuur (Neu5Ac) en zijn gehydroxyleerde vorm, N- glycolylneuraminezuur (Neu5Gc). Mensen kunnen geen endogene Neu5Gc produceren door de inactivatie van het gen dat codeert voor cytidine 5&#39;monofosfaat-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) hydroxylase (CMAH). Buitenlandse Neu5Gc wordt verkregen door menselijke cellen door het dieetverbruik van rood vlees en zuivel en verschijnt vervolgens op diverse glycanen op het celoppervlak, die hoofdzakelijk op carcinomen accumuleren. Derhalve hebben mensen circulerende anti-Neu5Gc antilichamen die verschillende rollen spelen in kanker en andere chronische ontstekingsgemedieerde aandoeningen en die potentieel diagnostisch en therapeutisch worden.rgets. Hier beschrijven we een high-throughput sialoglycan microarray test om dergelijke anti-Neu5Gc antilichamen in de menselijke sera te beoordelen. Neu5Gc-bevattende glycanen en hun bijpassende paren controles (Neu5Ac-bevattende glycanen), elk met een kern primaire amine, zijn covalent gekoppeld aan epoxy-beklede glazen glijbanen. We illustreren het afdrukken van 56 glijbanen in een 16-bronsformaat met behulp van een specifieke nano-printer die maximaal 896 array&#39;s per print kan genereren. Elke dia kan worden gebruikt om 16 verschillende humane sera monsters te screenen voor de evaluatie van anti-Neu5Gc antilichaam specificiteit, intensiteit en diversiteit. Het protocol beschrijft de complexiteit van dit robuuste gereedschap en biedt een basis richtlijn voor degenen die het antwoord op Neu5Gc dieet koolhydraatantigen in diverse klinische monsters in een matrixformaat willen onderzoeken.

Array Printing, Development en Analysis: Het afdrukken van een sialoglycan microarray met meerdere glycanmonsters en menselijke IgG STD-curven in 16 verschillende blokken vereist een grondige kalibratie om ervoor te zorgen dat alle monsters zo uniform mogelijk in alle 16 blokken per dia en op alle dia&#39;s in dezelfde afdrukcyclus worden gedrukt. Daarom zijn meerdere kalibreringsexperimenten nodig voordat de specifieke drukparam...

Een sialoglycan microarray test kan gebruikt worden om anti-Neu5Gc antilichamen in humane sera te evalueren, waardoor het een potentiële diagnostische test voor kanker en andere chronische ontstekingsgemedieerde menselijke ziekten is.

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera met een Sialoglycan Microarray Assay

Cells are covered with a cloak of carbohydrate chains (glycans) that is commonly altered in cancer and that includes variations in sialic acid (Sia) ...

Het algemene doel van de sialoglycan-microarray-test is om Anti-Neu5Gc IgG in menselijk serum op hoog rendement te evalueren tegen een diverse verzameling van sialoglycanen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het gebied van glyco-immunologie te beantwoorden, zoals hoe Anti-Neu5Gc antilichamen betrokken zijn bij verschillende menselijke ziekten, waaronder kanker, hartziekten en xenotransplantatie. Het grote voordeel van deze techniek is dat het hoog rendement profilering van Anti-Neu5Gc antilichamen mogelijk maakt tegen een groot aantal sialoglycan-antigenen.De procedure zal worden gedemonstreerd door Sharon Yehuda, een masterstudent uit mijn laboratorium. Zorgvuldige en gedetailleerde planning van het fabricageproces en de lay-out van het array is belangrijk om succes te garanderen. Dit proces wordt beschreven in het tekstprotocol en de aanvullende informatie.Verdun elk glycan tot 100 micromolar in een totaal volume van 100 microliter glycan-printbuffer in microcentrifugebuizen. Bereid vervolgens een primaire amine bevattende fluorescerende kleurstof tot een milligram per millimeter met markerbuffer. Verdun vervolgens tot één microgram per milliliter in een totaal volume van één milliliter.Bereid menselijke IgG-standaardcurveverdunningen voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Plaats de 384-well plate op ijs. Gebruik een elektronische multi-pipet om zeven microliters van elk glycaan, marker en standaardcurve IgG te verdelen volgens de plate lay-out die in het tekstprotocol staat. Dek de plaat af met parafilm en centrifugeer gedurende twee minuten bij 250 keer g en 12 graden Celsius. Het printen moet worden uitgevoerd in een stofvrije ruimte met een luchtvochtigheid van 60 tot 70%. Hier worden alle stappen uitgevoerd in een schone ruimte met geschikte handschoenen en kleding ter bescherming. Zet de nanoprinter machine en bevochtiger aan.Nadat de printmachine is geprogrammeerd zoals beschreven in het tekstprotocol, plaats de 384-well plate met verdeelde monsters op de juiste locatie op het arrayer dek en verwijder de parafilm deksel. Op dit punt begint u met printen. Nummer de slides met een alcoholbestendige markeerstift en bewaar ze in een vacuümverzegelde doos in het donker.Om de arrays te verwerken, haalt u eerst een slide uit de vacuümverzegelde doos en plaatst deze gedurende vijf minuten in een chemische kap, met de array naar boven, om het overtollige vocht te laten verdampen. Hydrateer vervolgens de slide door deze in een kleuringsbuis gevuld met gedeïoniseerd water te plaatsen. Bedek de buis met folie en incubeer gedurende vijf minuten met langzaam en zacht schudden bij kamertemperatuur.Om de reactieve epoxygroepen op de slide te blokkeren, dompelt u de slide in de 50 milliliter kleuringsbuis gevuld met voorverwarmde ethanolamine blokkeringsoplossing. Bedek de buis met folie en incubeer gedurende 30 minuten met langzaam en zacht schudden bij kamertemperatuur. Gooi de ethanolamine blokkeringsoplossing in de juiste biogevaarlijke prullenbak.Plaats vervolgens de slide in een nieuwe, schone kleuringsbuis gevuld met 50 graden Celsius gedeïoniseerd water. Bedek de buis met folie en incubeer gedurende tien minuten met langzaam en zacht schudden bij kamertemperatuur. Goot het water weg en breng de slides over naar een glazen kleuringshouder.Plaats het apparaat in een slingerende platenhouder en centrifugeer de slide droog. Plaats vervolgens de slide op een 16-well verdeler. Nadat de wells zijn voorgeweekt, gebruik een multi-pipet om 200 microliter PBST in de slide wells te verdelen.Plaats ze vervolgens in een afgedekte, vochtige kamer en schud gedurende vijf minuten. Verwijder de PBST door voorzichtig te slaan en te tikken op een schone papieren handdoek. Verdeel vervolgens 200 microliter PBS-Ovalbumine blokkeringsbuffer in elk well.Plaats de slides in een vochtige kamer en incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur met zacht schudden. Bereid vervolgens de primaire detectie, verdund in PBS-OVA blokkeringsbuffer zoals beschreven in het tekstprotocol. Sla PBS-OVA blokkeringsbuffer van de slide en voeg 200 microliter primaire antilichaam per well toe.Incubeer de slides in een vochtige kamer gedurende twee uur. Sla vervolgens de primaire detectie van de slide en was drie keer met PBST. Incubeer de slide in PBST gedurende vijf minuten in een vochtige kamer voordat u een laatste keer met PBST wast.Was vervolgens eenmaal met PBS. Bereid vervolgens de secundaire antilichamen in PBS zoals beschreven in het tekstprotocol. Sla de PBS van de slide en voeg 200 microliter secundair antilichaam toe.Sla de secundaire antilichamen van de slide en was vier keer met PBST zoals eerder. Verwijder voorzichtig de lijst en plaats de slides vervolgens in een 50 milliliter slide kleuringsbuis gevuld met PBS en schud gedurende vijf minuten. Vul vervolgens twee slide kleuringsbaden met gedeïoniseerd water.Plaats de slide in de slide houder en dompel de slide in het eerste bad. Duik snel tien keer in het bad. Breng vervolgens de slide over naar het tweede bad en dompel tien keer meer in.Na het dompelen, incubeer de slide gedurende tien minuten bij kamertemperatuur met schudden. Goot na de incubatie het water weg en breng de slide over naar een glazen kleuringshouder. Plaats de glazen kleuringshouder in een slingerende platenhouder en centrifugeer de slide droog.Open de scannerdeur en plaats de slide erin, met de array naar beneden. Op dit punt begint u met scannen. Sla de gescande slides op als een TIFF-bestand.Om een slide voor analyse voor te bereiden, selecteert u 'Array List laden' en upload het juiste GAL-bestand dat de arrays in elke blok op de slide toont. Slides werden ontwikkeld met 16 verschillende primaire detectie-moieties, één in elke blok. De plant Lectin SNA bindt a2-6 gekoppelde sialinezuur.Terwijl de plant Lectin MALII bindt a2-3 gekoppelde sialinezuur. Polyclonal Anti-Neu5Gc IgY bindt Neu5Gc-bevattende sialoglycanen, maar bindt niet Neu5Ac-bevattende sialoglycanen. Om Anti-Neu5Gc IgG te profileren,

profiling-anti-neu5gc-igg-human-sera-with-sialoglycan-microarray

Research

JoVE Journal

Behavior

Gedrag

In deze studie beschrijven we een verbeterde protocol een gemultiplexte high-throughput antilichaam microarray met lectine detectiemethode die gebruikt kan worden in de glycosylering profilering van specifieke eiwitten. Dit protocol is voorzien van nieuwe betrouwbare reagentia en vermindert de tijd, kosten en lab-apparatuur eisen ten opzichte van de vorige procedure.

Chemisch-geblokkeerde Antilichaam Microarray voor multiplexverzending High-throughput Profilering van specifiek eiwit glycosylering in Complex Samples

This video demonstrates printed glycan array technology for analyzing circulating anti-glycan antibodies in mouse serum. The antibodies in the serum interact with specific glycans on the chip, which is confirmed by immunostaining followed by fluorescence scanning.

Detecting Circulating Anti-Glycan Antibodies with a Printed Glycan Array

Met behulp van een gedrukte glycaan-microarray-strategie werd een conventionele 96-wells plaat assay geminiaturiseerd voor analyse van hemagglutinine aviditeit en specificiteit voor sialic acid bevattende receptoren van het influenza A-virus.

Geminiaturiseerde Glycan Microarray Assay voor het beoordelen van Avidity en specificiteit van influenza A-virus hemagglutinine

We beschrijven hier een methode om aanpasbare antigeen-microarrays te genereren die kunnen worden gebruikt voor de gelijktijdige detectie van serum IgG en IgM auto-antilichamen van mensen en muizen. Deze arrays maken een doorvoer en kwantitatieve detectie mogelijk van antilichamen tegen willekeurige antigenen of epitopen van belang.

Genereren van tweekleurige Antigen Microarrays voor de simultane detectie van IgG en IgM Autoantistoffen

Een modulaire benadering van de synthese van N- glycanen voor bevestiging aan een aluminium oxide-gecoate glazen schuif (ACG dia) als een microarray glycan heeft ontwikkeld en het gebruik ervan voor de profilering van een HIV in grote lijnen neutraliserende antilichamen aangetoond.

Chemo-enzymatische synthese van N- glycanen voor Array ontwikkeling en HIV antilichaam profilering

Dit werk toont het potentieel van gedrukte glycan matrix (PGA) technologie voor de analyse van de circulerende anti-koolhydraten antistoffen bij kleine dieren.

Gedrukte Glycan Array: Een gevoelige techniek voor de analyse van het Repertoire van circulerende anti-koolhydraten antilichamen in kleine dieren

We presenteren een protocol voor het gebruik van een proteïne-Microarray die is geconstrueerd door het afdrukken van influenza-antigenen op nitrocellulose gecoate dia's om gelijktijdig sonde serum te gebruiken voor meervoudige antilichaam isotypes tegen meer dan 250 antigenen van verschillende virusstammen, dus het meten van de breedte van serum antilichamen over virus subtypen mogelijk te maken.

Gebruik van een influenza antigeen Microarray voor het meten van de breedte van serum antilichamen over de virus subtypen

Immunoglobuline G (IgG) N-glycan wordt gekenmerkt met behulp van hydrofiele interactie CHROMATOGRAFIE UPLC. Daarnaast is de structuur van IgG N-glycan duidelijk gescheiden. Hier gepresenteerd is een inleiding tot deze experimentele methode, zodat het op grote schaal kan worden gebruikt in onderzoeksinstellingen.

Immunoglobuline G N-Glycan-analyse door Ultra-prestatie vloeistofchromatografie

Het glycosyleringspatroon van een antilichaam bepaalt de klinische prestaties, dus industriële en academische inspanningen om glycosylatie te beheersen blijven bestaan. Omdat typische glyco-engineeringcampagnes tijd- en arbeidsintensief zijn, zou het genereren van een snel protocol om de impact van glycosyleringsgenen te karakteriseren met behulp van transiënte uitschakeling nuttig zijn.

Snelle antilichaamglycosengineering in ovariumcellen van Chinese hamsters

Microarray polymer profiling (MAPP) is een high-throughput techniek voor samenstellingsanalyse van glycanen in biologische monsters.

Microarray Polymer Profiling (MAPP) voor high-throughput glycaananalyse

Leer de sialoglycan-microarray-assay voor het evalueren van Anti-Neu5Gc IgG in menselijk serum. Deze high-throughput methode ondersteunt glyco-immunologieonderzoek naar kanker en chronische ontsteking.

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera met een Sialoglycan Microarray Assay

Meer video's verkennen