Gebruik van capsules voor negatief vlekken van virale monsters in biocontainment
July 19th, 2017
Dit protocol bevat instructies voor negatieve kleuring virusmonsters die gemakkelijk in BSL-2, -3 of -4 laboratoria kunnen worden gebruikt. Het omvat het gebruik van een innovatieve verwerkingscapule die het transmissie-elektronenmicroscopie rooster beschermt en de gebruiker makkelijker in de meer turbulente omgevingen in biocontainer vergemakkelijkt.
Het algemene doel van deze methode is om een eenvoudige en effectieve TEM-negatieve kleuringsprocedure te bieden voor virale monsters binnen biocontainment. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de virologie over de morfologie en structuren van onderzochte virussen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige en effectieve handling van elektronenmicroscooprasters binnen biocontainment-omgevingen mogelijk maakt.
Deze techniek wordt gebruikt als onderdeel van TEM-diagnose van een onbekend virus omdat het gemakkelijk kan worden toegepast op virale monsters in alle omgevingen. Hoewel we deze methode voornamelijk hebben gebruikt om virus-TEM-onderzoeken te ondersteunen, heeft deze een veel bredere toepassing en kan worden gebruikt bij EM-onderzoek van de meeste nanodeeltjes. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat het enige oefening vereist om ervoor te zorgen dat TEM-rasters niet worden beschadigd bij het laden en lossen van de capsules.
We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we problemen hadden met het hanteren van kleine EM-rasters in biocontainment. Om deze procedure te beginnen, bereid of koop vorm virale en koolstof gecoate TEM koperrasters voor. Plaats de gecoate TEM-rasters in capsules.
Breng vervolgens de geladen capsules samen met andere benodigdheden en reagentia over naar biocontainment. Om te beginnen, bevestig de capsule aan een pipet. Aanzuig 40 microliters virusuitbreiding in de capsule.
Plaats de pipet op zijn kant, met de rasters horizontaal gedurende 10 minuten. Neem vervolgens de pipet op en giet de virusoplossing in een afvalcontainer. Aanzuig 40 microliters van 2% glutaaraldehyde fixatief in de capsules.
Plaats de pipet op zijn kant gedurende 20 minuten. Expel vervolgens het fixatief en aanzuig 40 microliters gedeïoniseerd water in de capsule om het fixatief weg te spoelen. Herhaal deze wassing drie keer.
Aanzuig vervolgens 40 microliters van 1% uranylacetaat of 1% kaliumfosfowolfraamzuur in de capsule. Laat de capsule 30 seconden staan. Vervolgens verwijdert u de capsule van de pipet.
Raak een stuk filterpapier aan de rand van de rasters om droog te deppen. Plaats het filterpapier in een 15 milliliter centrifugeerbuisje. Week vervolgens het filterpapier in 1% osmium tetroxide oplossing.
Plaats de capsule met de deksel open in de buis. Verzegel de buis gedurende één uur om volledige penetratie van de osmium tetroxide damp toe te staan. Ontsmet vervolgens de buis en breng deze uit de biocontainment naar de BSL-2 EM faciliteit.
Verwijder de capsule uit het centrifugeerbuisje, plaats deze vervolgens op een pipet. Aanzuig 40 microliters gedeïoniseerd water in de capsule en giet vervolgens het water in een afvalcontainer. Herhaal deze waterwas drie keer.
Verwijder vervolgens de capsule van de pipet. Dep de rasters droog met filterpapier. Laat de rasters drogen en bewaar ze vervolgens in een rasterbox totdat ze klaar zijn om TEM-beeldvorming uit te voeren.
Om te beginnen, meng de virussuspensie met een gelijk volume van 4% glutaaraldehyde, om een eindconcentratie van 2% glutaaraldehyde te bereiken. Gebruik fixatief om het virus gedurende ten minste 24 uur te inactiveren. Ontsmet de buis en breng deze over naar de BLS-2 EM faciliteit.
Hecht vervolgens een rasterlading aan een pipet. Aanzuig het mengsel in de capsule. Plaats de pipet op zijn kant met de rasters horizontaal gedurende 10 minuten.
Neem vervolgens de pipet op en giet het virusmengsel in een afvalcontainer. Aanzuig 40 microliters gedeïoniseerd water in de capsule en giet vervolgens het water in een afvalcontainer. Herhaal deze wassing drie keer.
Aanzuig vervolgens 40 microliters van 1% QA of 1% PTA gedurende 30 seconden in de capsule. Verwijder de capsule van de pipet. Dep de rasters droog met filterpapier.
Laat vervolgens de rasters drogen. In deze studie ondergaan Zaire Ebola virus monsters negatieve kleuring, met behulp van zowel de handmatige druppelmethode als de capsulemethode. De TEM-beelden die uit deze methoden zijn gegenereerd, tonen beide duidelijk gedefinieerde details, met nucleocapsid structuren in het midden van de varion en zichtbare glycoproteïnen op het oppervlak.
Dus de capsulemethode kan TEM-beelden van vergelijkbare kwaliteit produceren als die geproduceerd door de handmatige druppelmethode. Vervolgens worden verschillende methoden van monsterinactivatie vergeleken met behulp van het Chikungunya-virus. Monsterinactivatie wordt bereikt, hetzij snel door 2% glutaaraldehyde gedurende 20 minuten te gebruiken met daaropvolgende blootstelling aan 1% osmium tetroxide gedurende één uur, of 's nachts, door 2% glutaaraldehyde gedurende 24 uur te gebruiken.
Zoals te zien is, laat het langere inactivatieproces zonder osmium tetroxide toe dat meer ultrastructurele details worden gezien. Vervolgens, met behulp van de capsulemethode, werden twee kleurstoffen vergeleken met behulp van aldehyde-gefixeerde virus-achtige deeltjes. Zowel uranylacetaat als fosfowolfraamzuur tonen hoogwaardige resultaten, met duidelijk gedefinieerde randen en zichtbare glycoproteïnen.
Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in ongeveer anderhalf uur worden uitgevoerd, afhankelijk van het aantal monsters. Terwijl u deze procedure probeert, is het belangrijk om te onthouden om het juiste fixatief en kleurreagentia te selecteren voor uw experimentele doelen. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals deeltjestelling worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden door het berekenen van virusconcentraties.
Deze techniek verbetert de manier waarop virologen virusmorfologie en structuurinformatie gemakkelijker kunnen onderzoeken, vooral bij BLS-3 en 4 niveau virussen. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u TEM-rasters voor negatieve kleuring binnen biocontainment gemakkelijk kunt hanteren. Vergeet niet dat werken met aldehyde, osmium tetroxide en uranylacetaat uiterst gevaarlijk kan zijn en voorzorgsmaatregelen zoals geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen en een chemische afzuigkap moeten
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol biedt een eenvoudige en effectieve negatieve kleuringsprocedure voor virale monsters binnen biocontainment. Het omvat een innovatieve verwerkingscapsule die de behandeling van elektronenmicroscoop rasters in BSL-2, -3 of -4 laboratoria verbetert.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Virologie
- Elektronenmicroscopie
- Biocontainment Technieken
Achtergrond
- Negatieve kleuring is cruciaal voor het bestuderen van virusmorfologie.
- Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) is een belangrijk hulpmiddel in de virologie.
- Het behandelen van monsters in biocontainment stelt unieke uitdagingen.
- Deze methode beoogt deze uitdagingen te vereenvoudigen.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare TEM negatieve kleuringsmethode voor virale monsters te bieden.
- Om het onderzoek van virusstructuren te vergemakkelijken.
- Om de behandeling van monsters in hoog-beveiligde omgevingen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Negatieve kleuring van virale monsters.
- Gebruik van een verwerkingscapsule voor rasterbehandeling.
- Toepassing in BSL-2, -3 of -4 laboratoria.
- Training voor nieuwe gebruikers om rasterbeschadiging te minimaliseren.
Belangrijkste resultaten
- Effectieve behandeling van TEM rasters in biocontainment.
- Succesvolle toepassing op verschillende virale monsters.
- Mogelijkheid voor breder gebruik in nanodeeltje-onderzoeken.
- Verbeterde gebruikerservaring met de verwerkingscapsule.
Conclusies
- Deze methode verbetert de studie van virussen in veilige omgevingen.
- Het biedt een praktische oplossing voor onderzoekers in de virologie.
- Verdere training kan nodig zijn voor optimaal gebruik.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Handling electron microscopy grids in high-containment laboratories presents significant operational challenges due to environmental turbulence and restricted dexterity from personal protective equipment. This capsule-based method improves sample preparation reliability and throughput for virology discovery workflows in BSL-3 and BSL-4 settings. By minimizing manual grid manipulation, the technique supports consistent ultrastructural characterization of viral targets, enabling more confident go/no-go decisions in early-stage antiviral target validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables morphological interrogation of viral targets to confirm structural integrity and support hypothesis-driven target selection.
- Operational Value: Reduces grid handling errors in biocontainment, improving data quality for downstream target de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, high-contrast TEM specimens suitable for quantitative morphology assessment in screening cascades.
- Operational Value: Streamlines sample preparation for nanoparticle and macromolecule analysis, increasing assay readiness and reproducibility.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports translational continuity by providing reliable ultrastructural data from discovery through preclinical evaluation of viral candidates.
- Operational Value: Facilitates cross-functional collaboration between virology, microscopy, and toxicology teams through standardized, transferable sample preparation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling reliable negative staining of viral samples after inactivation and prior to imaging, supporting hypothesis testing and lead confirmation stages.
- Discovery Biology: Supports viral target validation by providing clear ultrastructural readouts that help clarify morphology and inform mechanistic understanding.
- Screening: Enhances assay standardization by producing consistent, artifact-minimized TEM grids for comparative analysis across conditions.
- Analytics: Generates quantitative morphometric outputs (e.g., particle size, shape, surface features) that enable objective comparison of viral variants or treatment effects.
- Translational Research: Ensures sample preparation continuity from BSL-3/4 discovery to BSL-2 imaging, maintaining data integrity across containment levels.
- Enterprise Reuse: Functions as a platform capability applicable to diverse specimens including viruses, nanoparticles, and macromolecules, maximizing infrastructure utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in target validation by reducing variability in ultrastructural data acquisition.
- Operational Value: Increases reproducibility and scalability of TEM workflows in high-containment environments through encapsulated grid handling.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by minimizing false negatives from grid damage or staining inconsistency.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of viral targets based on reliable structural data, reducing late-stage attrition due to unexpected morphology.
Implementation Considerations
- Requires training in aseptic grid loading and unloading to prevent capsule or grid damage.
- Dependent on access to TEM-compatible capsules, pipettes, and biocontainment-approved reagents (glutaraldehyde, stains, osmium tetroxide).
- Necessitates standardized timing and orientation protocols across users to ensure uniform staining and washing.
- Requires adaptation of wash and staining times based on specimen density and contaminant load.
- Limited by the need for post-staining decontamination and transfer protocols to move samples from BSL-3/4 to BSL-2 imaging facilities.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:08
Experiment Preparation in a BSL-2 Environment Prior to Working with the Virus Samples (Biocontainment Procedures were Filmed in BSL-4 Training Lab)
1:45
The Capsule Method for Negative Staining in Biocontainment Using Aqueous Glutaraldehyde and 1% Osmium Tetroxide Vapor Inactivation
4:24
The Capsule Method for Inactivation in Biocontainment 2% Glutaraldehyde Followed by Negative Staining in BSL-2 Laboratory
5:50
Results: Analyzing the Capsule Method of Negative Staining Viral Samples
7:14
Conclusion
