Name: Gebruik van capsules voor negatief vlekken van virale monsters in biocontainment (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Leer een eenvoudige negatieve kleuringstechniek voor virale monsters in biocontainment met behulp van een verwerkingscapsule voor TEM-roosters. Deze methode verbetert de veiligheid en efficiëntie bij virologisch onderzoek in BSL-2, -3 of -4 laboratoria.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. John Carra en Rowena Schokman willen ons danken en bedanken voor het leveren van gezuiverde Ebola nano-VLP&#39;s, Dr. Rajini Mudhasani voor het leveren van Chikungunya-virus en Dr Charles (Jason) Shoemaker voor het leveren van Murine Leukemia VLP&#39;s die Ebolavirus glycoproteïnen uitdrukken. Wij danken ook MAJ Carl Soffler voor het faciliteren van het Summer Internship Program (SIP) en het Science and Engineering Apprenticeship Program (SEAP) en Dr. Catherine Wilhelmsen voor de lab safety training.

1. Experimentvoorbereiding in een BSL-2 omgeving voorafgaand aan het werken met de virusmonsters <ol><li> Bereid of koop Formvar- en koolstofcoated TEM-koperroosters, meestal 200-400 mesh. </li><li> Plaats de gecoate TEM-roosters in capsules. <ol><li> Gebruik een vergrootglas om dit proces makkelijk te maken. Een of twee roosters kunnen in elke capsule worden ingebracht. Voorgeladen capsules kunnen worden gekocht om deze stap te elimineren, indien gewenst. </li></ol></li><li> Vervang de capsules met ingebouwde TEM-bekledingsroosters, samen met andere benodigdheden en reagentia, naar biocontainers waar de virussen negatief worden gekleurd. </li></ol> 2. De Capsule Methode voor Negatief Staining in Biocontainment Met Waterig Glutaraldehyde En 1% Osmium Tetroxide Damp Inactivering <ol><li> In het biocontainer BSC aspireren 40 μl virus suspensie in de capsule die aan een pipet is bevestigd. OPMERKING: De pipet blijft vast aan de aansluitingE capsule tot het proces is voltooid. Viruspreparatie is volgens onze vorige publicatie 14 . </li><li> Plaats de pipet aan de zijkant gedurende 10 minuten met horizontale grids. Dit is een even verspreiding van virusdeeltjes op de gecoate grids te bevorderen. </li><li> Inactiveer het virus binnen de capsule binnen het biocontainer BSC. <ol><li> Pak de pipet op en druk de plunjer om de virusoplossing in een afvalcontainer af te geven. </li><li> Aspireren 40 μL 2% glutaraldehyde fixatief in de capsules. Let op: Glutaraldehyde is een gevaarlijke chemische stof en vereist een passende bescherming. Glutaraldehyde kan voor korte perioden in een normaal BSC worden gebruikt, maar uitgebreid open reagens vereist werk in een BSC of chemische dampkap. </li><li> Plaats de pipet voor 20 minuten aan de zijkant. Dit zorgt ervoor dat monsters goed vast zijn. </li><li> Verwijder de fixatie en haal 40 μL dl water in de capsules naar wVerwijder de fixatie weg. Herhaal deze wasstap voor in totaal 3 spoelcycli. </li></ol></li><li> Aspireren 40 μL van 1% uranylacetaat (UA) of 1% kaliumfosphotungsticzuur (PTA) in de capsules en laat 30 s zitten. OPMERKING: De staining time kan variëren van 10 s tot 1 min op basis van het virusmonster. Let op: UA is een alfa-emitter, en een cumulatief toxine. Hanteer het met passende bescherming. </li><li> Verwijder de capsule uit de pipet en maak de netjes droog door een stuk filterpapier aan de rand van de roosters te raken, terwijl de roosters binnen de capsule blijven. </li><li> Osmium Tetroxide Damp Inactivatie Procedure. <ol><li> Plaats de capsule met het deksel open in een 50 ml centrifugebuis met filterpapier die in een 1% osmiumtetroxideoplossing is gedrenkt. Let op: Osmiumtetroxide is extreem giftig met lage dampdruk. Het moet gebruikt worden in een BSC of chemische dampkap. Hanteer het met passende bescherming. Bericht waarschuwingInformatie in het werkgebied. </li><li> Verzegel de 50 ml centrifugebuis gedurende 1 uur om volledige permeatie van de osmiumtetroxide-damp toe te laten. Vervolgens ontdoen en verplaats de buis vervolgens de biocontainer naar de BSL-2 EM-faciliteit. </li></ol></li><li> Verwijder EM roosters uit de capsule. <ol><li> Verwijder de capsule van de centrifugebuis in de BSL-2 EM-installatie en plaats deze op een pipet. </li><li> Aspireer 40 μl dl water in de capsule en doseer het water drie maal in een afvalcontainer. </li><li> Verwijder de capsule uit de pipet en doe de roosters uit met behulp van filterpapier om de rand van de roosters aan te raken. </li><li> Na het drogen van de lucht, sla de roosters op voor de volgende TEM-beeldvorming. </li></ol></li></ol> 3. De Capsule Methode voor Inactivering in Biocontainment Met 2% Glutaraldehyde, gevolgd door Negatief Staining in een BSL-2 Laboratorium <ol><li> Virus inactivatie procedure. <ol><lI&gt; In de biocontainer BSC meng de virus suspensieput met hetzelfde volume 4% glutaraldehyde om een ​​uiteindelijke concentratie van 2% glutaraldehyde te bereiken. Let op: Glutaraldehyde is een gevaarlijke chemische stof en vereist een passende bescherming. Glutaraldehyde kan voor korte perioden in een normaal BSC worden gebruikt, maar uitgebreid open reagens vereist werk in een BSC of chemische dampkap. </li><li> Inactiveer virussen met fixatief gedurende minimaal 24 uur voor verpakking, ontsmetting en overdracht naar de BSL-2 EM faciliteit. </li></ol></li><li> In de BSL-2 EM-faciliteit, aspireren het virus en het fixatieve mengsel in de capsule, die twee TEM-roosters bevat die aan een pipet zijn bevestigd. </li><li> Plaats de pipet horizontaal gedurende 10 minuten met de grids horizontaal georiënteerd. OPMERKING: dit bevordert een gelijkmatige verdeling van virusdeeltjes op de TEM-rasteren. </li><li> Pak de pipet op en druk de plunjer in om het virus naar een afvalcontainer te laten verdrijven. Aspireren 40 μl dlWater in de capsules en verdrijf het in de afvalcontainer voor 3 spoelcycli. </li><li> Aspireren 40 μL van 1% UA of 1% PTA in de capsules gedurende 30 s. OPMERKING: De kleurtijd varieerde van 10 s tot 1 min op basis van het virusmonster. Let op: UA is een alfa-emitter, en een cumulatief toxine. Hanteer het met passende bescherming. </li><li> Verwijder de capsule uit de pipet en maak de netjes droog door de rand van de roosters aan een stuk filterpapier te raken. Lucht de roosters op en droog ze voor de volgende TEM-beeldvorming. </li></ol>

<ol><li>Gentile, M., Gelderblom, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+in+rapid+viral+diagnosis%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22New+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update.</a> New Microbiol. 37 (4), 403-422 (2014).</li>
<li>Kruger, D. H., Schneck, P., Gelderblom, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helmut+Ruska+and+the+visualisation+of+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Helmut Ruska and the visualisation of viruses.</a> Lancet. 355 (9216), 1713-1717 (2000).</li>
<li>Curry, A., Appleton, H., Dowsett, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+transmission+electron+microscopy+to+the+clinical+study+of+viral+and+bacterial+infections%3A+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Application of transmission electron microscopy to the clinical study of viral and bacterial infections: present and future.</a> Micron. 37 (2), 91-106 (2006).</li>
<li>Goldsmith, C. S., Miller, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+uses+of+electron+microscopy+for+detection+of+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Modern uses of electron microscopy for detection of viruses.</a> Clin Microbiol Rev. 22 (4), 552-563 (2009).</li>
<li>Kiselev, N. A., Sherman, M. B., Tsuprun, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+staining+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Electron+Microsc+Rev%22%5BJournal%5D)">Negative staining of proteins.</a> Electron Microsc Rev. 3 (1), 43-72 (1990).</li>
<li>Brenner, S., Horne, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+negative+staining+method+for+high+resolution+electron+microscopy+of+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses.</a> Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).</li>
<li>Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+staining+of+thinly+spread+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Negative staining of thinly spread biological samples.</a> Methods Mol Biol. 369, 107-142 (2007).</li>
<li>Bradley, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+bacteriophage+and+bacteriocins%5BTitle%5D)+AND+%22Bacteriol+Rev%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of bacteriophage and bacteriocins.</a> Bacteriol Rev. 31 (4), 230-314 (1967).</li>
<li>Suzuki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+two+negative+staining+methods+on+the+Chinese+atypical+rotavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">Effects of two negative staining methods on the Chinese atypical rotavirus.</a> Arch Virol. 94 (3-4), 305-308 (1987).</li>
<li>Benmeradi, N., Payre, B., Goodman, S. L. <a target="_blank" href="https://www.cambridge.org/core/services/aop-cambridge-core/content/view/S1431927615004407">Easier and Safter Biological Staining: High Contrast Uranyless Staining of TEM Grids using mPrep/g Capsules.</a> Microsc Microanal. 21, Suppl 3. 721(2015).</li>
<li>Goodman, S. L., Wendt, K. D., Kostrna, M. S., Radi, C. <a target="_blank" href="https://www.cambridge.org/core/journals/microscopy-today/article/capsulebased-processing-and-handling-of-electron-microscopy-specimens-and-grids/43059411AA8B965E6EA870B9ED9DFAC5">Capsule-Based Processing and Handling of Electron Microscopy Specimens and Grids.</a> Microscopy Today. 23 (5), 30-37 (2015).</li>
<li>Goodman, S. L., Kostrna, M. S. <a target="_blank" href="https://www.cambridge.org/core/journals/microscopy-and-microanalysis/article/reducing-reagent-consumption-and-improving-efficiency-of-specimen-fixation-and-embedding-grid-staining-and-archiving-using-mprep-capsule-processing/BD909A4213DA1D65217A9CDDE93AB2C0">Reducing Reagent Consumption and Improving Efficiency of Specimen Fixation and Embedding, Grid Staining and Archiving using mPrep Capsule Processing.</a> Microsc Microanal. 17, Suppl 2. 174-175 (2011).</li>
<li>Monninger, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+viral+samples+within+biocontainment+for+ultrastructural+analysis%3A+Utilization+of+an+innovative+processing+capsule+for+negative+staining%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation of viral samples within biocontainment for ultrastructural analysis: Utilization of an innovative processing capsule for negative staining.</a> J Virol Methods. 238, 70-76 (2016).</li>
<li>Rossi, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+ViroCyt%28R%29+Virus+Counter+for+rapid+filovirus+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Evaluation of ViroCyt(R) Virus Counter for rapid filovirus quantitation.</a> Viruses. 7 (3), 857-872 (2015).</li>
<li>Carra, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thermostable%2C+chromatographically+purified+Ebola+nano-VLP+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">A thermostable, chromatographically purified Ebola nano-VLP vaccine.</a> J Transl Med. 13, 228(2015).</li>
<li>Rein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+leukemia+viruses%3A+objects+and+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Virol%22%5BJournal%5D)">Murine leukemia viruses: objects and organisms.</a> Adv Virol. , 403419(2011).</li>
<li>Barland,, Rojkind, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+staining+with+osmium+tetroxide+vapour%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Negative staining with osmium tetroxide vapour.</a> Nature. 212 (5057), 84-85 (1966).</li>
</ol>

Meningen, interpretaties, conclusies en aanbevelingen die in het artikel worden genoemd, zijn die van de auteurs en worden niet per se onderschreven door het Amerikaanse leger of het ministerie van defensie.

Negatieve kleuring is een waardevolle TEM-techniek voor het evalueren en sorteren van virussen, eiwitcomplexen en nanodeeltjes. Druppelbereiding van deze monsters door het handmatig verplaatsen van grids van reagens tot negatieve vlekken is het klassieke protocol voor meer dan een halve eeuw. Het is een simpel proces, maar vereist expertise opgedaan door opleiding voor succesvolle afronding. Uitstekende negatieve kleuring wordt nog steeds beschouwd als een state-of-the-art vaardigheidsset en zeer gewenst in veel TEM lab...

Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) is een effectief instrument om de morfologie en ultrastructuur van biologische monsters te zien die te klein zijn om te zien in een traditionele lichtmicroscoop 1 , 2 , 3 , 4 . TEMs schiet elektronen door een zeer dun specimen dat een hogere resolutie beeld produceert, omdat elektronen een veel kortere golflengte hebben dan licht. Regio&#39;s van de steekproef die elektronen buigen of blokkeren, verschijnen donker, terwijl gebieden die elektronenlucent zijn, wit verschijnen. Gebrek aan elektronen dichte materie maakt virussen moeilijk om te zien onder een TEM omdat ze elektronen niet kunnen verstrooien. Negatieve kleuring is de meest voorkomende methode voor het maken van contrast en het bekijken van virussen met een TEM. De eerste negatieve kleurprocedure werd in 1959 door Brenner en Horne voorgesteld, gebaseerd op een experiment waar Hall (1955) en Huxley (1957) observerenBij het verschijnen van biologische structuren in omgekeerd contrast wanneer ze gedompeld worden in een elektrondichte stof 5 . Het proces van negatieve kleuring is in de afgelopen halve eeuw vrijwel ongewijzigd. Negatieve kleuring houdt kort in het toepassen van een zware metalen zoutoplossing op een monster op een TEM-raster in een poging om het virus te omringen met dicht materiaal zonder het virus te infiltreren 6 . Dit creëert een donkere grens en onthult de vorm 5 van het deeltje. In deze studie worden twee reagentia gebruikt voor negatieve kleuring, uranylacetaat (UA) en kaliumfosphotungsticzuur (PTA). Beide deze vlekken worden vaak gebruikt om kleine biologische monsters te negeren, zoals virussen, eiwitcomplexen en nanodeeltjes 7 , 8 , 9 . De conventionele negatieve kleuringstechniek is de handmatige druppel negatieve kleuringstechniekNique 7 . Deze methode vereist nauwkeurige behandeling van kleine, breekbare TEM-rasteren met pincet om kleine hoeveelheden virusmonster, vlek en spoelwater toe te passen. Het typische voorbereidingsprotocol omvat het aanbrengen van een druppel monsterophanging op het oppervlak van een filmomhulde TEM-rooster ( Figuur 1A ). Na het aanbrengen van het monster op het filmoppervlak wordt het rooster afgespoeld om niet-bijhanden virus te verwijderen en gedurende enkele seconden tot een minuut met ofwel UA of PTA gekleurd, afhankelijk van het type monster. Overmatige vloeistof is slecht weg van het raster door een stuk filterpapier aan de rand van het raster aan te raken. De handmatige druppelmethode vereist dat elk raster individueel gemaakt wordt. Als het niet zorgvuldig wordt behandeld, kunnen de gecoate TEM-roosters gemakkelijk worden gebogen, gebogen of besmet. Het verwerken van meerdere monsters kan leiden tot problemen bij het bijhouden van de roosters en het verzekeren van consistente kleuring voor elk monster. Deze handleiding kleuring procedure is veel meer dEfficiënt wanneer uitgevoerd in biosafety-niveau (BSL) -3 en -4 biocontainerlaboratoria, vanwege de benodigde persoonlijke beschermingsmiddelen (PPE) die nodig zijn voor deze omgevingen. PPE is omslachtig en de biocontainermilieu is veel turbulent in vergelijking met een regulier laboratorium. Personeel in BSL-3 biocontainerlaboratoria moet 2 paren handschoenen dragen en in een biosafety-kast (BSC) werken. Deze dubbele laag handschoenen vermindert de gevoelige gevoeligheid en beperkt de fijne motorbeweging. De luchtstroom van het BSC dat de gebruiker beschermt en de verontreiniging van het monster voorkomt, kan ervoor zorgen dat de monsters en vlekken te snel drogen, waardoor de vlekkwaliteit wordt beïnvloed. De sterke turbulente luchtstroom in het BSC kan ook snel een raster dat niet goed beveiligd is, wegblazen. In BSL-4 biocontainende laboratoria zijn er extra veiligheidseisen. Personeel moet een positief drukpak dragen, waardoor de fysieke beweging verder wordt beperkt en het vermogen om duidelijk te zien en te manipulerenUlate grids. De technicus die in BSL-4 werkt, draagt ​​ook minimaal 2 paar handschoenen, waarbij het buitenste paar een dikke handschoen is die de handvaardigheid en tactiele sensatie aanzienlijk vermindert. Tenslotte zijn de pinnen die gebruikt worden om TEM-rasters aan te pakken scherp, waardoor de technicus een risico oplevert vanwege hun vermogen om handschoenen te punken. Met capsules die roosters bevatten, zijn er geen tanggen nodig, waardoor een veilig, pincetvrij alternatief voor het manipuleren van roosters in biocontainering is. Tenslotte bieden de capsules ook een effectieve manier om rasters op te slaan tijdens de verwerking, de ontsmetting van osmiumdampen en tijdens de opslag; Waardoor de roosters georganiseerd en veilig zijn tegen schade. In dit rapport introduceren we een nieuwe methode voor negatieve kleuring TEM-rasteren in biocontainerlaboratoria die mPrep / g capsules, een capsule-based apparaat voor roosterbehandeling en kleuring 10 , 11 , 12 gebruiken . De capsule komt erbijModelleert twee TEM-rasters, minimaliseert directe handhaving en vermindert het potentieel voor roosterschade. De capsule hecht direct op een enkel- of multikanaalspipet op dezelfde manier als een pipettip, waardoor de toepassing van verschillende vloeistoffen op rasters in de binnenkant mogelijk is. Dit maakt het gelijktijdig mogelijk om meerdere monsters met dubbele rasters te maken ( figuur 1B ). Naar negatieve vlekken met capsules wordt het virusmonster in de capsule gesuspendeerd en 10 minuten gehouden om de virussen op de gridoppervlakken te adsorberen. De roosters met geadsorbeerd virus worden vervolgens gewassen met gedeïoniseerd (dl) water en gedurende enkele seconden tot 1 minuten met enten UA of PTA gekleurd. Dit proces maakt gebruik van dezelfde protocol stappen en reagentia als de handmatige druppel methode; Het verschil is dat alle werkzaamheden binnen de capsule optreden zonder fysieke hantering van de roosters. ( Figuren 1C , 1D ). Het doel van deze studie was om capsules te evalueren alsEen nieuwe methode voor negatieve kleuring van virusmonsters in biocontaineromgevingen. In deze studie werd ook gekeken naar de kwaliteit van TEM-beelden die zijn geproduceerd uit twee verschillende virusinactivatieprocedures: 1) snelle inactivering, 1% osmiumtetroxide-damp en 2) een 24 uur inactivatie met 2% glutaraldehyde. Beide deze werden uitgevoerd met behulp van de capsules. Tenslotte hebben we twee vaak gebruikte negatieve vlekken, UA en PTA geëvalueerd voor gebruik in de capsule. 13

<table><tbody><tr><td>Formvar/carbon coated TEM grids</td><td>SPI</td><td>3420C-MB</td><td>200 mesh Cu Pk/100</td></tr><tr><td>mPrep/g capsules</td><td>EMS</td><td>85010-01</td><td>box</td></tr><tr><td>mPrep/f couplers</td><td>EMS</td><td>85010-11</td><td>standard 16/Pk</td></tr><tr><td>glutaraldehyde</td><td>EMS</td><td>16320</td><td>50% solution, EM grade</td></tr><tr><td>Osmium Tetroxide</td><td>EMS</td><td>19190</td><td>4% aqueous solution</td></tr><tr><td>Uranyl Acetate</td><td>EMS</td><td>22400</td><td>powder</td></tr><tr><td>Potassium phosphotungstic acid</td><td>EMS</td><td>19500</td><td>powder</td></tr><tr><td>filter paper</td><td>Whatman</td><td>1450-090</td><td>size 50</td></tr><tr><td>Transmission Electron Microscope</td><td>JEOL</td><td>JEM-1011</td><td>TEM</td></tr></tbody></table>

gebruik van capsules voor negatief vlekken van virale monsters in biocontainment

Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) wordt gebruikt om de ultrastructuur van virussen en andere microbiële pathogenen met nanometeroplossing in acht te nemen. De meeste biologische materialen bevatten geen dichte elementen die elektronen kunnen verstrooien om een ​​beeld te creëren; Daarom is een negatieve vlek die dikke zware metalen zouten rond het monster plaatst nodig. Om virussen in suspensie onder de TEM te visualiseren, moeten ze toegepast worden op kleine roosters die bedekt zijn met een doorzichtig oppervlak dat alleen nanometer dik is. Vanwege hun kleine grootte en breekbaarheid zijn deze roosters moeilijk te hanteren en gemakkelijk verplaatst door luchtstromen. Het dunne oppervlak is gemakkelijk beschadigd, waardoor het monster moeilijk of onmogelijk is om de afbeelding te maken. Infectieuze virussen moeten in een biosafety-kabinet (BSC) worden behandeld, en sommige hebben een biocontainende laboratoriumomgeving nodig. Staining virussen in biosafety niveaus (BSL) -3 en -4 is bijzonder uitdagend omdat deze omgevingen meer turbulent zijn en technici nodig zijn tO Persoonlijke beschermende uitrusting dragen (PPE), wat de handigheid vermindert. In deze studie hebben we een nieuw apparaat geëvalueerd om te helpen bij negatieve kleuringvirussen in biocontainment. Het apparaat is een capsule die werkt als een gespecialiseerde pipettip. Zodra grids in de capsule zijn geladen, aspireert de gebruiker simpelweg reagentia in de capsule om het virus en vlekken aan het ingekapselde rooster af te leveren, waardoor gebruikersbehandeling van roosters wordt verwijderd. Hoewel deze techniek speciaal is ontworpen voor gebruik in BSL-3 of -4 biocontainment, kan het monsterbereiding in elke laboratoriumomgeving vergemakkelijken door makkelijk negatief kleuring van het virus mogelijk te maken. Dezezelfde methode kan ook toegepast worden om negatieve gekleurde TEM-monsters van nanodeeltjes, macromoleculen en dergelijke exemplaren op te stellen.

De capsule methode produceert goede kwaliteit negatieve kleuring voor TEM beeldvorming: Ten eerste evalueren we de kwaliteit van beelden die gegenereerd worden door gebruik te maken van zowel de handmatige druppelmethode als de capsulemethoden voor negatief kleuring van Zaire ebolavirus. Ebolavirussen zijn lid van de familie Filoviridae , samen met Marburg-virus. Ebolavirus is typisch 80 tot 100 nm in diameter en kan mee...

Dit protocol bevat instructies voor negatieve kleuring virusmonsters die gemakkelijk in BSL-2, -3 of -4 laboratoria kunnen worden gebruikt. Het omvat het gebruik van een innovatieve verwerkingscapule die het transmissie-elektronenmicroscopie rooster beschermt en de gebruiker makkelijker in de meer turbulente omgevingen in biocontainer vergemakkelijkt.

Gebruik van capsules voor negatief vlekken van virale monsters in biocontainment

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...

Het algemene doel van deze methode is om een eenvoudige en effectieve TEM-negatieve kleuringsprocedure te bieden voor virale monsters binnen biocontainment. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de virologie over de morfologie en structuren van de onderzochte virussen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige en effectieve hantering van elektronenmicroscopie-roosters binnen biocontainment-omgevingen mogelijk maakt. Deze techniek is nuttig als onderdeel van de TEM-diagnostiek van een onbekend virus, omdat deze gemakkelijk kan worden toegepast op virale monsters in alle omgevingen. Hoewel we deze methode voornamelijk hebben gebruikt om TEM-studies van virussen te ondersteunen, heeft het een veel bredere toepassing en kan het worden gebruikt bij EM-onderzoek van de meeste nanodeeltjes. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode enige moeite hebben, omdat het enige oefening vergt om ervoor te zorgen dat de TEM-roosters niet beschadigd raken bij het laden en lossen uit de capsules.We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we problemen ondervonden bij het hanteren van kleine EM-grids in biocontainment.Om deze procedure te starten, bereid of koop Formvar- en koolstofgecoate TEM-koperroosters. Plaats de gecoate TEM-roosters in capsules. Verplaats vervolgens de gevulde capsules samen met overige benodigdheden en reagentia naar de biologische inperkingsruimte. Begin door de capsule aan een pipet te bevestigen. Aspireer 40 µL virusсусpensie in de capsule. Plaats de pipet op zijn zijkant, waarbij de roosters 10 minuten horizontaal georiënteerd zijn. Neem vervolgens de pipet op en breng de virusoplossing over in een afvalcontainer. Aspireer 40 µL 2% glutaraldehyde-fixeerder in de capsules. Plaats de pipet 20 minuten op zijn zijkant. Verwijder daarna de fixeerder en aspireer 40 µL gedeïoniseerd water in de capsule om de fixeerder weg te wassen. Herhaal deze wasstap drie keer.Aspire vervolgens 40 µL van zowel 1% uranylacetaat als 1% kaliumfosfotungstaat in het capsule. Laat het capsule 30 seconden rusten. Verwijder daarna het capsule uit de pipette.Dep de randen van de roosters droog door deze aan te raken met een stukje filterpapier. Breng het filterpapier over naar een centrifugebuis van 15 milliliters. Week het filterpapier vervolgens in een 1% osmiumtetroxide-oplossing.Plaats de capsule met de openstaande dop in de buis. Sluit de buis voor één uur om volledige permeatie van de osmiumtetroxide-damp mogelijk te maken. Decontamineer daarna de buis en breng deze vanuit de biologische inperking over naar de BSL-2 EM-faciliteit.Verwijder het capsule uit de centrifugebuis en plaats het vervolgens op een pipet. Zuig 40 µL gedeïoniseerd water op in het capsule en breng het water daarna over in een afvalcontainer. Herhaal deze waterwasbeurt drie keer.Verwijder vervolgens het capsule uit de pipet. Dep de grids droog met filterpapier. Laat de grids aan de lucht drogen en bewaar ze vervolgens in een griddoos tot ze klaar zijn voor TEM-beeldvorming.Om te beginnen mengt u de virussuspensie met een gelijk volume 4% glutaraldehyde, om een uiteindelijke concentratie van 2% glutaraldehyde te bereiken. Inactieveer het virus gedurende ten minste 24 uur met behulp van het fixatief. Decontamineer de buis en breng deze over naar de BLS-2 EM-faciliteit. Bevestig vervolgens een geladen grid-capture aan een pipet. Aspireer het mengsel in de capsule. Plaats de pipet op zijn zij met de grids horizontaal georiënteerd gedurende 10 minuten.Pak vervolgens de pipet en breng het virusmengsel over in een afvalcontainer. Aspireer 40 µL gedeïoniseerd water in de capsule en gooi het water daarna weg in een afvalcontainer. Herhaal deze wasstap drie keer.Zuig daarna 40 µL van zowel 1% UA als 1% PTA op in de capsule gedurende 30 seconden. Verwijder de capsule uit de pipet. Dep de roosters droog met filterpapier.Laat de roosters vervolgens aan de lucht drogen.In deze studie worden monsters van het Zaire-ebolavirus onderworpen aan negatieve kleuring, waarbij zowel de handmatige druppelmethode als de capsulemethode wordt gebruikt. De TEM-beelden die met deze methoden zijn gegenereerd, vertonen beide duidelijk gedefinieerde details, met nucleocapsidstructuren in het centrum van het virion en zichtbare glycoproteïnen op het oppervlak. De capsulemethode is derhalve in staat om TEM-beelden te produceren van een vergelijkbare kwaliteit als die van de handmatige druppelmethode. Vervolgens worden verschillende methoden voor monsterinactivatie vergeleken met behulp van het Chikungunya-virus. Monsterinactivatie wordt bereikt ofwel snel, door gebruik te maken van 2% glutaraldehyde gedurende 20 minuten met daaropvolgende blootstelling aan 1% osmiumtetroxide gedurende één uur, of overnacht, door gebruik te maken van 2% glutaraldehyde gedurende 24 uur. Zoals te zien is, maakt het langere inactivatieproces zonder osmiumtetroxide het mogelijk om meer ultrastructurele details waar te nemen.Vervolgens werden, met gebruik van de capsulemethode, twee kleurstoffen vergeleken met behulp van met aldehyde gefixeerde virusachtige partikels. Zowel uranylacetaat als fosfowolfraamzuur vertoonden resultaten van hoge kwaliteit, met duidelijk gedefinieerde randen en zichtbare glycoproteïnen.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in ongeveer anderhalf uur worden uitgevoerd, afhankelijk van het aantal monsters. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de juiste fixatie- en kleuringsreagentia moeten worden gekozen voor de experimentele doelstellingen. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals deeltjestelling, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden door virusconcentraties te berekenen.Deze techniek verbetert de manier waarop virologen met meer gemak de morfologie en structuurinformatie van virussen kunnen onderzoeken, in het bijzonder bij virussen op BLS-3 en 4 niveau. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe TEM-roosters voor negatieve kleuring binnen biologische inperking eenvoudig kunnen worden gehanteerd. Vergeet niet dat het werken met aldehyde, osmiumtetroxide en uranylacetaat extreem gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals passende persoonlijke beschermingsmiddelen en een chemische zuurkast, altijd moeten worden getroffen bij het uitvoeren van deze procedure.

utilization-capsules-for-negative-staining-viral-samples-within

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Single Virus Genomics (SVG) is een methode om te isoleren en versterken de genomen van enkele vironen. Virale suspensies van een gemengde assemblage worden naargelang het gebruik van flowcytometrie op een objectglaasje met discrete putjes die agarose, waardoor het vastleggen van het virion en het verminderen van het genoom afschuiving bij opwerking. Whole genome amplificatie wordt bereikt door verschillende verplaatsing amplificatie (MDA) resulterend in genomisch materiaal dat geschikt is voor...

Isolatie en Genoomanalyse van Single Virionen gebruik &#39;Single Virus Genomics&#39;

Source: Feltwell, T., et.al. Separating Bacteria by Capsule Amount Using a Discontinuous Density Gradient. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the preparation and characterization of bacterial strains with varying capsule production. Pathogenic strains carrying different mutations in capsule-related genes are cultured, grown in liquid media, and subjected to centrifugation to distinguish capsule phenotypes based on pellet density. Buffer treatment is used to wash and stabilize the cells...

Culturing and Isolating Capsule-Forming Pathogenic Bacterial Strains

In this video, we demonstrate the negative staining of enveloped virus samples using a processing capsule within the biocontainment environment. The negatively stained viruses can be visualized using transmission electron microscopy to investigate viral structure and morphology with nanometer resolution.

Capsule-Based Negative Staining of Virus Samples on TEM Grids: A Heavy Metal Staining Technique to Visualize the Ultrastructure of Enveloped Viruses

Routine detectiemethoden gebruik te maken van de versterking van het virale genoom worden beperkt door hun onvermogen om te discrimineren besmettelijke uit niet-infectieuze deeltjes. Het doel van dit artikel is om gedetailleerde protocollen voor alternatieve methoden om hulp in discriminatie van besmettelijke norovirus deeltjes met behulp van aptamer-bindende, Dynamische lichtverstrooiing en transmissie-elektronenmicroscopie.

Alternatieve In Vitro methoden voor de bepaling van de structurele integriteit van virale Eiwitmantel

Deze techniek wordt beschreven van een geautomatiseerde batch-beeldprocessor, bedoeld voor het meten van de polysacharide capsule en lichaam stralen. Hoewel oorspronkelijk ontworpen voor Cryptococcus neoformans capsule metingen die de geautomatiseerde image processor kan ook worden toegepast op andere gebaseerd contrastdetectie van cirkelvormige objecten.

Geautomatiseerde meting van Cryptococcal soorten Polysaccharide Capsule en cel lichaam

De polysaccharide capsule is de primaire virulentiefactor in Cryptococcus neoformans, en haar grootte correleert met de virulentie van de stam. De diameter van de capsule metingen worden gebruikt bij het testen van de fenotypische en te meten van de therapeutische werking. Hier een standaardmethode van capsule inductie wordt gepresenteerd, en twee methoden van kleuring en het meten van de diameter worden vergeleken.

Size Matters: Meting van de Diameter van de Capsule in Cryptococcus neoformans

Negatieve vlek EM is een krachtige techniek voor het visualiseren van macromoleculaire structuur, maar verschillende kleuring technieken wisselende resultaten kunnen produceren in een monster afhankelijke wijze. Hier zijn verschillende negatieve kleuring benaderingen in detail te bieden een eerste workflow voor het aanpakken van de visualisatie van uitdagende systemen beschreven.

Variaties op negatieve vlek elektronenmicroscopie methoden: Tools voor de aanpak van de uitdagende systemen

We tonen het gebruik van niet-aaneengesloten dichtheid verlopen te onderscheiden bacteriële populaties op basis van capsule productie. Deze methode wordt gebruikt capsule bedrag tussen culturen vergelijken, mutanten met een specifieke capsule fenotype te isoleren, of capsule regelgevers te identificeren. Hier beschreven is de optimalisatie en de werking van de bepaling.

Scheiden van bacteriën per Capsule bedrag met behulp van een discontinue dichtheid verloop

Hier beschrijven we een enkele cel micro-aspiratie methode voor de scheiding van geïnfecteerde amoebae. Om virale subpopulaties te scheiden in Vermamoeba vermiformis geïnfecteerd door Faustovirussen en onbekende reus virussen, ontwikkelden we het protocol hieronder beschreven en toonden zijn vermogen om twee laag-overvloed roman reus virussen scheiden.

Single cell micro-aspiratie als alternatieve strategie voor de fluorescentie-geactiveerde celsortering voor scheiding van gigantische virus mengsels

Voor een diepgaande mechanistische analyse van de RNA-synthese van het respiratoire syncytiële virus (RSV) rapporteren we een protocol voor het gebruik van de chaperonnefofoproteïne (P) voor coexpressie van het RNA-vrije nucleoproteïne (N0) voor de daaropvolgende in vitro assemblage van de virusspecifieke nucleocapsiden (NCs).

Generatie en assemblage van virusspecifieke nucleocapsiden van het respiratoire syncytiële virus

Leer een eenvoudige negatieve kleuringstechniek voor virale monsters in biocontainment met behulp van een verwerkingscapsule voor TEM-roosters. Deze methode verbetert de veiligheid en efficiëntie bij virologisch onderzoek in BSL-2, -3 of -4 laboratoria.

Gebruik van capsules voor negatief vlekken van virale monsters in biocontainment

Meer video's verkennen