Gebruik van capsules voor negatief vlekken van virale monsters in biocontainment

Het algemene doel van deze methode is om een eenvoudige en effectieve TEM-negatieve kleuringsprocedure te bieden voor virale monsters binnen biocontainment. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de virologie over de morfologie en structuren van de onderzochte virussen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige en effectieve hantering van elektronenmicroscopie-roosters binnen biocontainment-omgevingen mogelijk maakt. Deze techniek is nuttig als onderdeel van de TEM-diagnostiek van een onbekend virus, omdat deze gemakkelijk kan worden toegepast op virale monsters in alle omgevingen. Hoewel we deze methode voornamelijk hebben gebruikt om TEM-studies van virussen te ondersteunen, heeft het een veel bredere toepassing en kan het worden gebruikt bij EM-onderzoek van de meeste nanodeeltjes. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode enige moeite hebben, omdat het enige oefening vergt om ervoor te zorgen dat de TEM-roosters niet beschadigd raken bij het laden en lossen uit de capsules.

We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we problemen ondervonden bij het hanteren van kleine EM-grids in biocontainment.

Om deze procedure te starten, bereid of koop Formvar- en koolstofgecoate TEM-koperroosters. Plaats de gecoate TEM-roosters in capsules. Verplaats vervolgens de gevulde capsules samen met overige benodigdheden en reagentia naar de biologische inperkingsruimte. Begin door de capsule aan een pipet te bevestigen. Aspireer 40 µL virusсусpensie in de capsule. Plaats de pipet op zijn zijkant, waarbij de roosters 10 minuten horizontaal georiënteerd zijn. Neem vervolgens de pipet op en breng de virusoplossing over in een afvalcontainer. Aspireer 40 µL 2% glutaraldehyde-fixeerder in de capsules. Plaats de pipet 20 minuten op zijn zijkant. Verwijder daarna de fixeerder en aspireer 40 µL gedeïoniseerd water in de capsule om de fixeerder weg te wassen. Herhaal deze wasstap drie keer.

Aspire vervolgens 40 µL van zowel 1% uranylacetaat als 1% kaliumfosfotungstaat in het capsule. Laat het capsule 30 seconden rusten. Verwijder daarna het capsule uit de pipette.

Dep de randen van de roosters droog door deze aan te raken met een stukje filterpapier. Breng het filterpapier over naar een centrifugebuis van 15 milliliters. Week het filterpapier vervolgens in een 1% osmiumtetroxide-oplossing.

Plaats de capsule met de openstaande dop in de buis. Sluit de buis voor één uur om volledige permeatie van de osmiumtetroxide-damp mogelijk te maken. Decontamineer daarna de buis en breng deze vanuit de biologische inperking over naar de BSL-2 EM-faciliteit.

Verwijder het capsule uit de centrifugebuis en plaats het vervolgens op een pipet. Zuig 40 µL gedeïoniseerd water op in het capsule en breng het water daarna over in een afvalcontainer. Herhaal deze waterwasbeurt drie keer.

Verwijder vervolgens het capsule uit de pipet. Dep de grids droog met filterpapier. Laat de grids aan de lucht drogen en bewaar ze vervolgens in een griddoos tot ze klaar zijn voor TEM-beeldvorming.

Om te beginnen mengt u de virussuspensie met een gelijk volume 4% glutaraldehyde, om een uiteindelijke concentratie van 2% glutaraldehyde te bereiken. Inactieveer het virus gedurende ten minste 24 uur met behulp van het fixatief. Decontamineer de buis en breng deze over naar de BLS-2 EM-faciliteit. Bevestig vervolgens een geladen grid-capture aan een pipet. Aspireer het mengsel in de capsule. Plaats de pipet op zijn zij met de grids horizontaal georiënteerd gedurende 10 minuten.

Pak vervolgens de pipet en breng het virusmengsel over in een afvalcontainer. Aspireer 40 µL gedeïoniseerd water in de capsule en gooi het water daarna weg in een afvalcontainer. Herhaal deze wasstap drie keer.

Zuig daarna 40 µL van zowel 1% UA als 1% PTA op in de capsule gedurende 30 seconden. Verwijder de capsule uit de pipet. Dep de roosters droog met filterpapier.

Laat de roosters vervolgens aan de lucht drogen.

In deze studie worden monsters van het Zaire-ebolavirus onderworpen aan negatieve kleuring, waarbij zowel de handmatige druppelmethode als de capsulemethode wordt gebruikt. De TEM-beelden die met deze methoden zijn gegenereerd, vertonen beide duidelijk gedefinieerde details, met nucleocapsidstructuren in het centrum van het virion en zichtbare glycoproteïnen op het oppervlak. De capsulemethode is derhalve in staat om TEM-beelden te produceren van een vergelijkbare kwaliteit als die van de handmatige druppelmethode. Vervolgens worden verschillende methoden voor monsterinactivatie vergeleken met behulp van het Chikungunya-virus. Monsterinactivatie wordt bereikt ofwel snel, door gebruik te maken van 2% glutaraldehyde gedurende 20 minuten met daaropvolgende blootstelling aan 1% osmiumtetroxide gedurende één uur, of overnacht, door gebruik te maken van 2% glutaraldehyde gedurende 24 uur. Zoals te zien is, maakt het langere inactivatieproces zonder osmiumtetroxide het mogelijk om meer ultrastructurele details waar te nemen.

Vervolgens werden, met gebruik van de capsulemethode, twee kleurstoffen vergeleken met behulp van met aldehyde gefixeerde virusachtige partikels. Zowel uranylacetaat als fosfowolfraamzuur vertoonden resultaten van hoge kwaliteit, met duidelijk gedefinieerde randen en zichtbare glycoproteïnen.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in ongeveer anderhalf uur worden uitgevoerd, afhankelijk van het aantal monsters. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de juiste fixatie- en kleuringsreagentia moeten worden gekozen voor de experimentele doelstellingen. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals deeltjestelling, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden door virusconcentraties te berekenen.

Deze techniek verbetert de manier waarop virologen met meer gemak de morfologie en structuurinformatie van virussen kunnen onderzoeken, in het bijzonder bij virussen op BLS-3 en 4 niveau. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe TEM-roosters voor negatieve kleuring binnen biologische inperking eenvoudig kunnen worden gehanteerd. Vergeet niet dat het werken met aldehyde, osmiumtetroxide en uranylacetaat extreem gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals passende persoonlijke beschermingsmiddelen en een chemische zuurkast, altijd moeten worden getroffen bij het uitvoeren van deze procedure.