Isolatie en karakterisatie van primaire Rat klep interstitiële cellen: een nieuw Model voor het bestuderen van verkalking van de aortaklep
20 november 2017
Dit protocol beschrijft de isolatie, cultuur en verkalking van de rat-afgeleide ventiel interstitiële cellen, een zeer fysiologische in vitro model van calcific aortaklep ziekte (CAVD). Exploitatie van dit model rat vergemakkelijkt CAVD onderzoek in het verkennen van de cel- en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan dit complexe pathologisch proces.
Het algemene doel van dit protocol is om interstitiële rattenklepcellen of VIC's te isoleren om de mechanismen van calcificerende aortaklepziekte te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van klepcalcificatie, zoals waarom VIC's calcificeren en wat we kunnen doen om deze cellen te beschermen tegen calcificatie. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn de toegankelijkheid en het potentieel om zich te transformeren in cellijnen voor verder onderzoek.
Voer alle dissecties uit in een geventileerde kap die eerder is gedesinfecteerd met 70%ethanol om de steriliteit van monsters en reagentia te waarborgen. Steriliseer dissectiegereedschap door ze te autoclaveren, gevolgd door het onderdompelen van de punten van de gereedschappen in een beker met 70%ethanol voor gebruik. Week de dissectiewerktuigen in bekers met spoelbuffer voordat ze in contact komen met het dier of weefsels.
Na het doden van de ratten zoals beschreven in het tekstprotocol, plaats het dier op zijn rug op een glazen dissectiebord en desinfecteer de huid door met 70%ethanol te spuiten. Om het hart te dissecteren, maak een snede van vier centimeter in de middenlijn van de rat met behulp van dissectiescharen om de buikholte bloot te leggen en verwijder voorzichtig het borstbeen en de longen om het hart bloot te leggen. Verwijder het hart met een stel scherpe schaar.
Bewaar het gedissekteerde hart in ijskoud spoelbuffer totdat alle grove dissecties van de ratten voltooid zijn. Om elk hart te microdissecteden, breng het gedissekteerde hart over in een petrischaal bedekt met spoelbuffer. Trim het hartspierweefsel met een stel rechte scharen om een klein gebied rond de opgaande aorta en de aortawortel over te laten.
Gebruik dezelfde rechte schaar om voorzichtig de opgaande aorta naar de linker ventrikel open te snijden en de aortaklepblaadjes bloot te leggen. Breng vervolgens de geopende aorta over in een verse steriele petrischaal gevuld met Hank's Balanced Salt Solution. Dissecteer de aortaklepblaadjes, gemarkeerd door hun unieke U-vorm aan de basis van de aorta, met behulp van een paar Vannas schaar.
Bewaar alle blaadjes in één milliliter ijskoud spoelbuffer in een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter totdat alle dissecties zijn voltooid. Zodra alle blaadjes zijn geoogst, centrifugeer ze gedurende één minuut bij 100g bij vier graden Celsius om de spoelbuffer te verwijderen. Om de klependotheelcellen of VEC's te verwijderen, verteer de blaadjes in 100 microliter van 425 eenheden per milliliter Collagenase II gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius.
Onderbreek de vertering door voorzichtig op en neer te pipetteren met behulp van een 200 microliter pipettepunt. Centrifugeer gedurende 30 seconden bij 100g om de blaadjes te pelletten. Na voorzichtig weggooien van het supernatant, spoel de blaadjes met 500 microliter spoelbuffer en pellet de cellen opnieuw door centrifugatie bij 100g gedurende 30 seconden.
Om de VIC's van de blaadjes te oogsten, verteer ze met 100 microliter van de Collagenase II gedurende 1,5 tot twee uur bij 37 graden Celsius. Laat vervolgens de VIC's vrij door voorzichtig op en neer te pipetteren met behulp van een 200 microliter pipettepunt. Verdun de Collagenase II in 19 milliliter kweekmedium en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 670g om de VIC's en resterende klepblaadjesdebris te pelletten.
Na het weggegooien van het supernatant, breng de blaadjes en de VIC's over naar kweekplaten of kweekflessen. Kweek de VIC's gedurende vijf tot zeven dagen in kweekmedium totdat confluency wordt bereikt bij 37 graden Celsius in de aanwezigheid van 5%CO2, waarbij het medium na 72 uur wordt ververst. Om primaire rat VIC's voor in vitro calcificatie-experimenten voor te bereiden, zaai de cellen met een dichtheid van 150.000 cellen per putje in zes-putjes platen.
Blijf de cellen in kweekmedium houden totdat ze meer dan 90% confluency bereiken. Behandel de VIC's met calcificatie versus controlemedium en incubeer bij 37 graden Celsius in de aanwezigheid van 5%CO2 gedurende nog eens 72 uur. Om de gecalcificeerde primaire rat VIC's voor verdere downstream-analyses te bestuderen, verwijder het calcificatie- of controlemedium.
Was de monolagen met spoelbuffer om niet-gebonden calcium- en fosfaationen te verwijderen voordat u rat VIC-karakterisering uitvoert zoals beschreven in het tekstprotocol. Voor rat VIC-calcificatiestudies, kleurt u de celmonolagen met 5%Alizarine Rood S oplossing, voorzichtig schudden op een shaker gedurende 20 minuten. Was vervolgens drie keer met gedistilleerd water gedurende vijf minuten per keer.
Om calciumafzetting te kwantificeren, gebruikt u een biochemische calcium assay kit. Leeg calciumionen uit met 0,6 molair zoutzuur gedurende 24 uur bij vier graden Celsius met zachte agitatie. Verzamel het supernatant en meet de calciumconcentratie met behulp van een calcium assay kit volgens de richtlijnen van de fabrikant.
Bereken tenslotte de calciumconcentratie als een fractie van het totale cellulaire eiwit zoals beschreven in het tekstprotocol. Het VIC fenotype van geïsoleerde cellen werd bevestigd door middel van immunofluorescentie, waarbij VIC markers, vimentin en alpha gladde spieractine werden onderzocht. Daarnaast werd de expressie van de VIC groeiregulator, weefselgroeifactor beta-1 en 2, bevestigd met behulp van PCR analyse.
Western blot analyse werd ook uitgevoerd om te verifiëren dat rat VIC's negatief waren voor de endotheelcelmarker CD 31, waarbij canine mitralis VEC's als positieve controle werden gebruikt. Rat VIC's werden blootgesteld aan verhoogde niveaus van calcium en fosfaat, die pathologische hypercalcemie en hyperfosfatemie omstandigheden nabootsen. Behandeling van VIC's met calcium en fosfaat induceerde calcificatie, zoals bepaald door Alizarine Rood kleuring voor calciumafzetting en colorimetrische bepaling van calciumniveaus na zoutzuur lekkage.
Behandeling van VIC's met calcium en fosfaat induceerde een significante toename in de mRNA expressie van de osteogene markers MSX2, ALPL en PHOSPHO1. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in één tot twee uur worden uitgevoerd, exclusief de vertering voor 18 klep
Overzicht
Dit protocol beschrijft de isolatie, kweek en calcificatie van interstitiële klepcellen (VIC's) afkomstig van ratten, wat een fysiologisch in vitro model biedt voor het bestuderen van calcifiserende aortaklepaandoeningen (CAVD). Deze methode stelt onderzoekers in staat om de cellulaire en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de calcificatie van VIC's te onderzoeken.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Cardiovasculair onderzoek
Achtergrond
- Calcific aortaklepproblematiek (CAVD) is een complex pathologisch proces.
- VIC's spelen een cruciale rol bij de calcificatie van aortakleppen.
- Inzicht in het gedrag van VIC's kan leiden tot potentiële therapeutische strategieën.
- Isolatie van VIC's uit ratmodellen biedt een relevant experimenteel systeem.
Doel van de studie
- Om ratte VIC's te isoleren voor het bestuderen van calcificatiemechanismen.
- Om te onderzoeken waarom VIC's calcificeren en hoe dit proces kan worden voorkomen.
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor toekomstig onderzoek naar CAVD.
Gebruikte methoden
- Dissectie van rattenharten om aortaklepbladen te verkrijgen.
- Vertering van de klepbladen om VIC's te isoleren met behulp van Collagenase II.
- Het kweken van VIC's onder gecontroleerde omstandigheden voor calcificatiestudies.
- Kleuring en biochemische assays om de calciumafzetting te kwantificeren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie en kweek van raten-VIC's.
- Inductie van calcificatie in VIC's door middel van specifieke behandelingen.
- Verificatie van het VIC-fenotype en calcificatiemarkers.
- Inzichten in de moleculaire mechanismen van VIC-calcificatie.
Conclusies
- Dit protocol biedt een waardevol instrument voor het bestuderen van CAVD.
- Inzicht in de calcificatie van VIC kan therapeutische benaderingen informeren.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze methodologie om verdere mechanismen te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Dit protocol stelt een fysiologisch relevant in vitro model vast met behulp van primaire interstitiële klepcellen van ratten om mechanismen van calcificerende aortaklepaandoeningen te bestuderen. Het maakt doelwitvalidatie en fenotypische screening mogelijk door hypercalcemische en hyperfosfatemische condities te reproduceren die worden waargenomen bij patiënten met nierfalen in het eindstadium. Het model ondersteunt mechanische risicoanalyse en voorspellend vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door cellulaire responsen te koppelen aan de expressie van osteogene markers en calciumafzetting.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen over calcificatiepaden van VIC's mogelijk onder serumcondities die relevant zijn voor de ziekte.
- Operationele waarde: Levert een zuivere, expandeerbare VIC-populatie, bevestigd door expressie van α-SMA, vimentine, TGF-β1/2 en CD31-negativiteit, voor betrouwbare studies naar target-engagement.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de triage van portfolio's door calciumdepositie en de inductie van osteogene markers (MSX2, ALPL, PHOSPHO1) te kwantificeren als functionele read-outs van de werkzaamheid van verbindingen.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert gestandaardiseerde VIC-monolagen die geschikt zijn voor high-throughput calcificatie-screening met behulp van Alizarin Red S-kleuring en biochemische calciumassays.
- Kwantitatieve output: Maakt normalisatie van calciumgehaltes ten opzichte van het totale cellulaire eiwit mogelijk, wat dosis-responsanalyses en vergelijkbaarheid tussen experimenten faciliteert.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt de expansie van primaire VIC's voor multi-well plate formaten, wat bijdraagt aan de standaardisatie van assays en reproduceerbaarheid over verschillende ontdekkingscampagnes heen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelevantie: Modelleert de pathofysiologie van humane CAVD door rat-VIC's bloot te stellen aan verhoogde calcium- en fosfaatniveaus die het serum van ESRD-patiënten nabootsen.
- Translationele Continuïteit: Slaat een brug van ontdekking naar preklinische validatie door het VIC-fenotype en de calcificatierespons te bevestigen voordat men overgaat naar in vivo-modellen.
- Mechanische Risicoreductie: Identificeert belangrijke mediatoren van calcificatie via genetische, biochemische en beeldvormende studies na isolatie.
Integratie van pijplijn en workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadidentificatie en biedt een ziekterelevant systeem voor mechanistische screening en biomarkerafstemming voorafgaand aan de preklinische fase.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing van VIC-calcificatiemechanismen en pathway-verduidelijking met behulp van geïsoleerde primaire cellen onder gecontroleerde omstandigheden.
- Screening: Levert assay-klare, reproduceerbare VIC-culturen met kwantitatieve calciummetingen voor het evalueren van de effecten van verbindingen op osteogene differentiatie.
- Analytiek: Genereert meetbare output, waaronder Alizarine Rood-kleuring, kwantificering van calciumassays en mRNA-expressie van osteogene markers voor datagestuurde besluitvorming.
- Translationeel onderzoek: Garandeert fenotypische getrouwheid en validatie van de functionele respons voordat er wordt overgegaan tot preklinische effectiviteitsstudies.
- Bedrijfsmatige herbruikbaarheid: Vestigt een schaalbaar, gestandaardiseerd primair celplatform dat toepasbaar is op meerdere projecten die mechanismen van vasculaire calcificatie onderzoeken.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de validatie van targets door VIC-calcificatie te koppelen aan meetbare biochemische en genetische eindpunten.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde protocollen voor isolatie, cultuur en inductie van calcificatie.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege mechanistische inzichten te verschaffen in de effecten van verbindingen op het VIC-fenotype en de calcificatie.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk op basis van dosisafhankelijke modulatie van osteogene markers en calciumafzetting in een mensrelevant model.
Overwegingen bij implementatie
- Vereist expertise in de isolatie van primaire cellen, steriele dissectie van weefsel en enzymatische digestietechnieken.
- Afhankelijk van toegang tot collagenase II, kweekfaciliteiten met 5% CO2-incubatie en instrumentatie voor calciumassays.
- Maakt standaardisatie tussen teams noodzakelijk voor een consistente VIC-zaaidichtheid (150.000 cellen/well) en timing van de calcificatie-inductie (72 uur).
- Houdt rekening met aanpassingen bij de vertaling van rat-VIC-responsen naar therapeutische contexten die relevant zijn voor mensen.
- Beperkt door de eindige uitbreidbaarheid van primaire VICs, wat een zorgvuldige planning van passages vereist voor experimentele reproduceerbaarheid.
Veelgestelde vragen over Biopharma
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Extraction of Primary Rat Valve Interstitial Cells (VICs)
4:49
Induction of Calcification of VICs and VIC Calcification Studies
6:37
Results: Analysis of RAT VICs Localization, Calcification, and Associated Gene Expression Changes
7:57
Conclusion
