Eenvoudige verwijdering van achtergrond fluorescentie in formaline-vaste menselijk hersenweefsel voor immunofluorescentie microscopie

Een veelvoorkomend probleem bij immunofluorescentiemicroscopie is de aanwezigheid van endogene achtergrondfluorescentie die uw signaal kan storen. In veel gevallen kan deze autofluorescentie uw resultaten oninterpreteerbaar maken. In dit protocol demonstreren we hoe autofluorescentie kan worden verwijderd uit menselijke hersenweefselmonsters middels fotobleken met een commerciële LED-bureaulamp.

De belangrijkste voordelen van deze methoden zijn de aanzienlijke kostenbesparing ten opzichte van huidige technieken zonder in te boeten op effectiviteit, en het feit dat er geen exogene verbindingen in het monster worden geïntroduceerd. Bereid voordat u begint stamoplossingen voor van 1× tris-gebufferde zoutoplossing, TBS, en 10% natriumazide. Voor elke drie standaardformaat microscoopglaasjes die u wilt verwerken, heeft u één vierkige Petrischaal van 100 millimeter bij 100 millimeter nodig als glaaskamer.

Bereid voor elke objectglas-kamer 50 milliliter 0,5% azide in TBS voor door 25 milliliter 10% natriumazide toe te voegen aan 50 milliliter eenmaal TBS. Maak een standaard om uw objectglas-kamer te verhogen, zodat een lampkop eronder past. Voor een vierkante Petrischaal van 100 millimeter kan een plastic vershoudbakje van vergelijkbare grootte op maat worden gesneden.

Alles wat de objectkamer veilig kan verhogen zonder het licht naar de monsters te belemmeren, kan worden gebruikt. Schaf een witte fosfor-LED-bureaulamp aan en verwijder eventuele diffusors of ondoorzichtig plastic dat de lichtbron afdekt. Richt de LED-array naar boven.

Hiervoor wordt een lamp met een flexibele hals aanbevolen. Maak een reflecterende koepelkap voor het apparaat door de binnenkant van een doos, die groot genoeg is om de objectglaskamers en het steunframe te bedekken, te bekleden met aluminiumfolie. Voor een enkele kamer kan een doosje voor pipetpunten van één millimeter worden gebruikt.

Voor deze video werd formaline-gefixeerd menselijk FTLD-T orbitaal frontaal gyri hersenweefsel onderworpen aan de photobleaching-voorbehandeling. De procedures voor weefselpreparatie en aminokleuring kunnen variëren afhankelijk van de bron, fixatie en inbedding van uw weefselcoupes. Plaats de lamp onder het frame en de monsterkamer bovenop het frame in een koelruimte, koelkast of koelkast van 4 °C.

Vul de monsterkamer met 50 milliliter azide TBS. Dompel weefselcoupes van 10 micrometer dik, gemonteerd op standaard glazen microscopische objectglazen, met schone pincetten in de monsterkamer. Dek het apparaat af met de reflecterende koepel en zet de LED-lamp aan.

Laat de monsters 48 uur lang fotobleken. Deze incubatietijd kan variëren, afhankelijk van de lampintensiteit en de hoeveelheid autofluorescerend materiaal in het weefsel. Na de fotobleken-voorbehandeling kunnen de coupes immunostained worden volgens een standaardprotocol voor uw specifieke weefsel en de eiwitten van belang.

Voor demonstratiedoeleinden werd FTLD-T hersenweefsel gekleurd voor gefosforyleerd tau met behulp van secundaire antilichamen geconjugeerd aan Alexa 488 en Texas Red. DAPI werd gebruikt als kerntegenkleuring. Bereid 500 milliliter antigeen-retrievalbuffer, 500 milliliter 0,025% Triton X-100 in TBS, 10 milliliter 1% runderseumalbumine, BSA, in TBS, en twee milliliter blokkeeroplossing, bestaande uit geiten serum toegevoegd aan BSA TBS.

Voer antigeenherstel uit door de gefotobleekte coupes onder te dompelen in antigeenherstelbuffer in een objectgashouder. Verwarm de houder 30 minuten lang op 90 degrees Celsius. Zodra de houder uit de warmtebehandeling is gehaald, is het belangrijk om de kamer 30 minuten op kamertemperatuur te laten afkoelen.

Het onmiddellijk verwijderen van de coupes zal ertoe leiden dat de secties uitdrogen. Bereid uw primaire antilichaammengsel voor volgens de aanbevelingen van de fabrikant. In dit geval werd anti-phospho PHF tau p-serine 202 plus threonine 205 AT8 antilichaam 1 op 100 verdund met BSA TBS en op ijs bewaard.

Per sectie zijn 150 µL van het antilichamenmengsel vereist. Nadat de secties 30 minuten zijn afgekoeld, worden de dia's overgebracht van de opvangbak voor antigeen-retrieval naar een kleurpot gevuld met TBS Triton. Was de dia's vijf minuten in deze oplossing onder voorzichtig schudden.

Giet de TBS Triton weg en vul deze opnieuw om deze wasstap voor een tweede keer te herhalen. Verwijder na het wassen de coupes uit de kleurbeker en absorbeer het overtollige buffer met een pluisvrije doek. Teken met een hydrofobe pen een omtrek rondom het weefsel.

Dit voorkomt dat uw oplossingen van de coupes afvloeien. Zorg ervoor dat de coupes niet uitdrogen. Blokkeer het weefsel door 200 µL blokkeringsoplossing op de coupes te pipetteren en plaats deze vervolgens in een bevochtigingskamer.

Deze kamer kan iets eenvoudigs zijn, zoals een objectglashouder in een pipetpuntendoos met een nat vel keukenpapier. Zorg ervoor dat het volledige weefselmonster is bedekt met de blokkeringsoplossing. Incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur.

Verwijder de blokkeringsoplossing met een aspirator of pipette. Pipetteer 100 tot 150 µL van het primaire antilichaammengsel op de objectglazen. Zorg ervoor dat het gehele monster bedekt is met de antilichaamsoplossing en dat de coupes op een vlak oppervlak blijven liggen om ongelijkmatige ophoping van het antilichaam te voorkomen.

Incubeer met het primaire antilichaam bij vier graden Celsius gedurende de nacht in een bevochtigde kamer. Bereid de volgende dag het mengsel van secundaire antilichamen. In dit geval werden goat anti-mouse Alexa 488 en goat anti-mouse Texas Red één op 100 verdund in BSA TBS.

Haal de weefselsneden uit de oplossing en verwijder de primaire antilichaamoplossing met een aspirator of pipet. Was de slides twee keer op dezelfde manier als voorheen, met gebruik van een kleurpot gevuld met TBS Triton gedurende vijf minuten per wasbeurt. Verwijder na het wassen het overtollige buffer met een papieren strip.

Pipetteer 100 tot 150 µL van de secundaire antilichaamoplossing, waarbij opnieuw moet worden gecontroleerd of het weefselmonster volledig is bedekt. Incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur in de bevochtigte kamer in het donker. Bereid een DAPI-tegenkleuring van 0,1 µg/mL in TBS voor volgens de aanbevelingen van de fabrikant of via seriële verdunning.

Zorg ervoor dat de DAPI-stoomoplossing grondig wordt gemengd vanwege mogelijke onoplosbaarheid. Haal de coupes uit de oplossing en verwijder het mengsel met de secundaire antistoffen. Was de monsters twee keer, maar gebruik gewone TBS in plaats van TBS Triton.

Zuig de resterende wasoplossing af of pipetteer deze weg en pipetteer 100 tot 150 µL DAPI-kleuring op de weefselsneden. Incubeer 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Haal de monsters eruit en was ze drie keer met gewone TBS in plaats van twee keer.

Verwijder na het wassen voorzichtig de resterende wasoplossing. Breng het monteermiddel aan. Voltooi het monteren van de coupes door de monsters af te dekken met glasdekglasjes.

Voorkom luchtbellen door één zijde van het dekglas neer te leggen en de tegenovergestelde zijde zeer langzaam te laten zakken met een pincet. Laat het montage medium drogen voordat de preparaten donker worden bewaard bij vier graden Celsius. De coupes kunnen nu worden gevisualiseerd.

De instellingen voor de fluorescentiemicroscopie variëren afhankelijk van de gebruikte fluorforen voor kleuring en de microscoop. Schakel de fluorescentielamp, de microscoop en de computer in en laat de lamp 15 minuten opwarmen. Plaats de gekleurde weefselsnijplaten in de fluorescentiemicroscoop.

Gebruik het helderveld om het weefsel bij een 10-voudige vergroting te lokaliseren. Zodra er een geschikt weefselgebied is gevonden, wordt er een druppel water op het dekglas van het monster aangebracht. Schakel over naar een 20-voudige waterimmersie-objectief.

Selecteer laser-excitatie- en emissiegolflengten die geschikt zijn voor elke fluorofoor in aparte kanalen voor het beste signaal. Verdere details over de gebruikte instellingen en golflengten zijn te vinden in het bijbehorende manuscript. Pas het laservermogen en de gain-instellingen aan om de signaalintensiteit voor elk kanaal te optimaliseren.

Zodra de juiste instellingen en het gezichtsveld zijn gevonden, slaat u een samengestelde afbeelding op die de fluorescentiegegevens van elk spoor bevat. Voor de visualisatie van de fluorescentie-intensiteit in elk kanaal installeert u de RGB Profile Tools-macro voor ImageJ. Open het lsm-confocale afbeeldingsbestand in ImageJ en converteer de samengestelde afbeeldingen van de drie stacks naar RGB door naar Image, Color, Channel Tool te gaan.

Selecteer Composite en vink alle drie de kanalen aan. Ga vervolgens naar Image, Type en RGB Color. Selecteer het icoon voor de RGB Profile Tools en trek een lijn door het gedeelte in de afbeelding dat geprofileerd moet worden.

In deze video worden de stappen beschreven voor het uitvoeren van een fotoblekingsvoorbehandeling van weefselmonsters om achtergrondfluorescentie te reduceren. Deze procedure kan aan elk standaard amino-fluorescentieprotocol worden toegevoegd voorafgaand aan de antigeenblootlegging en amino-kleuring. De apparatuur die wordt gebruikt voor fotobleking is goedkoop en gemakkelijk verkrijgbaar, bestaande uit standaard componenten.

Witte fosfor-LED's zenden licht uit over een breed spectrum van golflengten, waardoor ze zeer geschikt zijn voor breedbandige fotobleking. Met behulp van een gemakkelijk verkrijgbare LED-bureaulamp werden niet-gekleurde menselijke FTLD-T hersenweefselmonsters gefotobleekt en afgebeeld met de golflengten die passend zouden zijn als deze monsters waren gekleurd met Texas Red en Alexa 488. Onbehandelde monsters vertoonden grote hoeveelheden autofluorescentie.

In tegenstelling hiermee leidde fotobleking tot een significant verminderde intensiteit van autofluorescente spikkels die leken op lipofuscine, evenals een algemene achtergrondfluorescentie. Voor verdere validatie van deze techniek werden hersenweefselmonsters van FTLD-T gekleurd voor hypergefosforyleerd tau, een eiwit dat bij deze ziekte misvouwt en zich ophoopt als duidelijke inclusielichamen. Er werden twee verschillende secundaire antilichamen toegepast om het onderscheid tussen tau-labeling en aspecifieke fluorescentie te verbeteren.

In deze samengestelde beelden is de colokalisatie van Alexa 488 en Texas Red in het geel weergegeven, wat staat voor correct gekleurd tau-eiwit. De aanwezigheid van rode of groene regio's duidt op ofwel aspecifieke fluorescentie of quenching van een van de chromoforen. In het onbehandelde controlemonster is aanzienlijke achtergrond en een aspecifiek signaal zichtbaar, met name in het Texas Red-kanaal.

Zowel de voorbehandeling door fotobleken als de toepassing van een chemische quencher leiden tot een sterk verminderd achtergrondsignaal. Als we de fluorescentiekanalen splitsen en de beelden onder een hogere vergroting bekijken, kunnen meer gedetailleerde waarnemingen worden gedaan. De onbehandelde controle vertoont achtergrondfluorescentie in alle kanalen, evenals aspecifieke kenmerken, voornamelijk in het Texas Red-kanaal, die een vergelijkbare intensiteit hebben als de tau-specifieke labeling.

Indien tau-inclusielichamen geen duidelijke, voorspelbare morfologie hadden, hadden deze Texas Red-resultaten verkeerd geïnterpreteerd kunnen worden vanwege de aanwezigheid van deze autofluorescerende kenmerken. Een voorbehandeling met fotobleken heft deze aspecifieke Texas Red-kenmerken volledig op, terwijl het grootste deel van de tau-specifieke Texas Red- en Alexa 488-signalen behouden blijft. Fotobleken lijkt echter weinig effect te hebben op de DAPI-achtergrondfluorescentie.

Een chemische quencher verminderde de achtergrondfluorescentie in het Alexa 488-kanaal net zo effectief als fotobleken. Het verminderde echter ook de fluorescentie-intensiteiten van zowel DAPI als Texas Red, wat wijst op de aanwezigheid van enige contraproductieve quenching. De kwantificering van deze effecten is te zien in de signaalprofielen.

Zoals u kunt zien, levert deze methode schone beelden op zonder storende kenmerken. Deze fotobleaching-voorbehandeling kan worden geïntegreerd in elk standaard amino-fluorescentieprotocol om autofluorescentie te verwijderen en kwalitatief hoogwaardige, eenduidige resultaten te genereren.