Eenvoudige verwijdering van achtergrond fluorescentie in formaline-vaste menselijk hersenweefsel voor immunofluorescentie microscopie

Een veelvoorkomend probleem bij immunofluorescentiemicroscopie is de aanwezigheid van endogene achtergrondfluorescentie die je signaal kan verstoren. In veel gevallen kan deze autofluorescentie je resultaten oninterpreteerbaar maken. In dit protocol zullen we laten zien hoe je autofluorescentie uit menselijke hersenweefselmonsters kunt verwijderen met behulp van fotobleken met een commerciële LED-bureaulamp.

De belangrijkste voordelen van deze methoden zijn de aanzienlijke kostenbesparingen ten opzichte van huidige technieken zonder in te boeten aan effectiviteit en dat er geen exogene verbindingen in het monster worden geïntroduceerd. Voordat je begint, bereid voorraadoplossingen van eenmaal tris-gebufferde zoutoplossing, TBS, en 10% natriumaziet. Voor elke drie standaard microscoopglazen die je wilt verwerken, heb je een enkele 100 millimeter bij 100 millimeter vierkante petrischaal nodig als glijlager.

Voor elke glijlager bereid je 50 milliliter van 0,5% azidet in TBS voor door 25 milliliter van 10% natriumaziet toe te voegen aan 50 milliliter van eenmaal TBS. Maak een rekconstructie om je glijlager op te tillen zodat een lampkop eronder past. Voor een 100 millimeter vierkante petrischaal kan een plastic voedselcontainer van vergelijkbare grootte worden gesneden tot de gewenste vorm.

Alles dat de glijlager veilig kan tillen zonder het licht te belemmeren om de monsters te bereiken, kan worden gebruikt. Koop een witte fosfor LED-bureaulamp en verwijder eventuele diffusers of ondoorzichtig plastic dat de lichtbron bedekt. Richt de LED-array naar boven.

Voor dit doel wordt een lamp met een flexibele nek aanbevolen. Bouw een reflecterende koepel voor het apparaat door de binnenkant van een doos, groot genoeg om de glijlagers en de rekconstructie te bedekken, met aluminiumfolie te bekleden. Voor een enkele kamer kan een een millimeter pipettentipdoos worden gebruikt.

Voor deze video werd formaldehyde-gefixeerd menselijk FTLD-T orbitale frontale gyri hersenweefsel onderworpen aan de fotoblekbehandeling. Weefselvoorbereiding en aminokleuringsprocedures kunnen variëren op basis van de bron, fixatie en inbedding van je weefselsecties. Plaats de lamp in een koude ruimte van vier graden Celsius, koude kast of koelkast onder de rekconstructie en de monsterkamer bovenop de rekconstructie.

Vul de monsterkamer met 50 milliliter azidet TBS. Dompel 10 micrometer dikke weefselsecties, gemonteerd op standaard glazen microscoopglazen, onder in de monsterkamer met schone pincetten. Bedek het apparaat met de reflecterende koepel en zet de LED-lamp aan.

Laat de monsters 48 uur fotobleken. Deze incubatietijd kan variëren, afhankelijk van de lampintensiteit en de hoeveelheid autofluorescentiemateriaal in het weefsel. Na de fotoblekbehandeling kunnen de glijlagers worden geïmmunokleurgekleurd met een standaardprotocol voor je specifieke weefsel en eiwitten van belang.

Voor demonstratiedoeleinden werd FTLD-T hersenweefsel gekleurd voor gefosforyleerd tau met secundaire antilichamen geconjugeerd aan Alexa 488 en Texas Red. DAPI werd gebruikt als nucleaire contrakleuring. Bereid 500 milliliter antigeenretrievalbuffer, 500 milliliter 0,025% Triton X-100 in TBS, 10 milliliter 1% bovijn serum albumine, BSA, in TBS, en twee milliliter blokkeeroplossing, bestaande uit geitenserum toegevoegd aan BSA TBS.

Voer antigeenretrieval uit door de fotoblekte glijlagers onder te dompelen in antigeenretrievalbuffer in een glijlagercollector. Verwarm de collector gedurende 30 minuten op 90 graden Celsius. Zodra de collector uit de warmtebehandeling is verwijderd, is het belangrijk om de kamer 30 minuten op kamertemperatuur te laten afkoelen.

De glijlagers onmiddellijk verwijderen zal ervoor zorgen dat de secties uitdrogen. Bereid je primaire antilichaammenging volgens de aanbevelingen van de fabrikant. In dit geval werd anti-fosfo PHF tau p-serine 202 plus threonine 205 AT8 antilichaam verdund één op 100 met BSA TBS en op ijs gehouden.

150 microliters antilichaammenging is vereist per sectie. Nadat de secties gedurende 30 minuten zijn afgekoeld, breng de glijlagers over van de antigeenretrievalcollector naar een kleurpot gevuld met TBS Triton. Was de glijlagers gedurende vijf minuten in deze oplossing met zacht schudden.

Lege en vervang de TBS Triton om deze wasstap een tweede keer te herhalen. Na het wassen, verwijder de glijlagers uit de kleurpot en veeg eventueel overtollig buffer weg. Teken met een hydrofobe pen een omtrek rond het weefsel.

Dit zal voorkomen dat je oplossingen van de glijlager lopen. Zorg ervoor dat de glijlagers niet uitdrogen. Blokkeer het weefsel door 200 microliters blokkeeroplossing op de glijlagers te pipetteren en plaats ze in een bevochtigde kamer.

Deze kamer kan iets zo eenvoudigs zijn als een glijlagerrek in een pipettentipdoos met een natte papieren handdoek. Zorg ervoor dat het hele weefselmonster bedekt is met blokkeeroplossing. Incubeer twee uur bij kamertemperatuur.

Verwijder de geblokkeerde oplossing door aspiratie of pipettering. Pipet 100 tot 150 microliters primaire antilichaammenging op de glijlagers. Zorg ervoor dat het hele monster bedekt is met antilichaamoplossing en dat de secties op een vlak oppervlak worden gehouden om ongelijkmatig poolen van antilichamen te voorkomen.

Incubeer met primair antilichaam gedurende een nacht bij vier graden Celsius in een bevochtigde kamer. De volgende dag bereid je het secundaire antilichaammenging voor. In dit geval werden goat anti-mouse Alexa 488 en goat anti-mouse Texas Red verdund één op 100 met behulp van BSA TBS.

Haal de weefselsecties op en verwijder de primaire antilichaamoplossing door aspiratie of pipettering. Was de glijlagers twee keer op dezelfde manier als eerder met behulp van een kleurpot gevuld met TBS Triton gedurende vijf minuten per wasstap. Na het wassen, veeg eventueel overtollig buffer weg.

Pipet 100 tot 150 microliters secundaire antilichaamoplossing, waarbij je er nogma