Een standaard methodiek te onderzoeken ter plaatse mutageniteit als een functie van punt mutatie reparatie gekatalyseerd door CRISPR/Cas9 en SsODN in menselijke cellen
25 augustus 2017
Dit protocol beschrijft de workflow van een CRISPR/Cas9 gebaseerde gen bewerken systeem voor de reparatie van puntmutaties in zoogdiercellen. Hier, gebruiken wij een combinatorische benadering voor het gen bewerken met een gedetailleerde opvolgzuigelingenvoeding experimentele strategie voor het meten van indel vorming op de doelsite — Kortom, het analyseren van on-site mutagenese.
Het algemene doel van deze experimentele procedure is om een fundamentele aanpak in gedetailleerde methodologie te schetsen om genetische heterogeniteit op de doelsite op een betrouwbare en robuuste manier te meten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van genbewerking, zoals hoe onsite mutagenese kan worden geanalyseerd en gemeten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een gestandaardiseerde methodologie is voor homologie-gerichte reparatie of gencorrectie met behulp van enkelstrengs oligonucleotiden.
Om het protocol te beginnen, kweek HTT11619-cellen in 25 milliliter van eerder bereid medium voor de kweek van HTT116-cellen in een T-175-fles. Zuig het medium af en was de cellen met dulbecco's fosfaatgebufferd zout of PBS, zonder calcium en magnesium, en zuig vervolgens de PBS af. Voeg vervolgens druppelsgewijs trypsine toe aan de T-175-fles, met behulp van een pipet van vijf milliliter.
Laat de cellen in een incubator loslaten. Tik op de fles om de cellen los te maken en doof de cellen dan met de acht milliliter volledig medium over het hele oppervlak van de fles. Pipet vervolgens de mix meerdere keren op en neer om celklonters te breken en breng de cellen over naar een conische buis van 15 milliliter.
Voordat u de cellen draait, neem 10 microliter uit de conische buis van 15 milliliter en combineer het met 10 microliter trypanblauw om de cellen te tellen en pel de cellen. Breng 10 microliter van de cellen gemengd met trypanblauw over naar de hemocytometer en tel de vier roosters rond de buitenkant. Voeg voor elke 10 centimeter plaat cellen die gesynchroniseerd moeten worden vijf milliliter volledig medium en zes micromolar aphidicoline toe.
Breng vervolgens 100 microliter van de opnieuw gesuspendeerde celpellet over naar elke centimeter plaat en draai de plaat voorzichtig om te mengen. Incubeer de platen om de cellen te synchroniseren op de G1S-grens. Vier uur voordat het doelwit wordt aangesproken, zuig het medium af en was met PBS.
Zuig de PBS af en voeg vijf milliliter volledig medium toe. Plaats de plaat terug in de incubator gedurende vier uur. Voer de mutante EGFP-gensequentie in in de online generator van Zane Labs en kies de CRISPR-gidssequenties die in de buurt van de doelsite binden.
Meng het RNA in gelijke molaire concentraties tot 45 micromolar. Voeg 6,75 microliter van een 200 micromolar stock van CR RNA en 6,75 microliter van een 200 micromolar stock van tracer RNA toe aan een centrifugeerbuis van 1,5 milliliter. Voeg vervolgens 16,50 microliter IDT-buffer toe om een eindvolume van 30 microliter te bereiken.
Verhit vervolgens het mengsel gedurende vijf minuten op 95 graden Celsius in een PCR-machine. Laat de monsters afkoelen tot kamertemperatuur. Verdun voor elk monster 2,22 microliter CR RNA tot tracer RNA complex en 2,78 microliter IDT buffer tot een eindvolume van vijf microliter.
Verdun 1,67 microliter Cas9-eiwit van een 60 micromolar stock in 3,33 microliter laag serum medium tot een eindvolume van vijf microliter. Meng vijf microliter Cas9-eiwit met vijf microliter complex RNA. Zuig het medium af en was met vijf milliliter PBS.
Zuig de PBS af en voeg een milliliter voorverwarmd trypsine toe aan elke 10 centimeter plaat. Zet de platen in de incubator. Tik vervolgens op de 10 centimeter plaat om ervoor te zorgen dat alle cellen loslaten en doof ze dan met vier milliliter volledig medium, door het over het hele oppervlak van de plaat te verspreiden.
Pipet meerdere keren op en neer om celklonters te breken en breng de cellen over naar een conische buis van 15 milliliter. Neem 10 microliter uit de conische buis van 15 milliliter en combineer het met 10 microliter trypanblauw om de cellen te tellen. Pel de cellen door vijf minuten te draaien bij 125 x G bij kamertemperatuur.
Zuig het medium af en was met vijf milliliter PBS. Pel de cellen door vijf minuten bij 125 x G bij kamertemperatuur te draaien. Breng 100 microliter van de celsuspensie over naar elke elektroporeringscuvette met een opening van vier millimeter.
Voeg 10 microliter van het RNP-complex toe aan 100 microliter cellen, bij een celdichtheid van 5 x 10 tot de vijfde. Voeg twee micromolar ODN toe aan elk monster. Neem vervolgens de rek mee naar een elektroporeringsmachine.
Flik lichtjes met elk van de monsters en plaats ze in de kamer. Plaats de rek terug in de kap en breng elk monster over naar een putje met twee milliliter volledig medium in een zesputtenplaat. Incubeer de plaat voordat u de correctieniveaus controleert.
Zuig het medium af en was de cellen met twee milliliter PBS. Vervang de PBS met 500 microliter voorverwarmd trypsine voor elke put van de zesputtenplaat. Zet de platen in de incubator.
Tik vervolgens op de plaat om ervoor te zorgen dat alle cellen loslaten en doof ze dan met een milliliter volledig medium door het over het hele oppervlak van de put te verspreiden. Breng de cellen over in een centrifugeerbuis van 1,5 milliliter en pel. Na het pellen van de cellen, zuig het medium af en suspendeer de celpellet opnieuw in 500 microliter FACS-buffer.
Elektroporeren de gesynchroniseerde en vrijgegeven HTT11619-cellen bij een concentratie van 5 x 10 tot de vijfde cellen per 100 microliter, met het RNP-complex bij 100 picomolen en 100 picomolen van 72 NTODN bij 2,0 micromolar. Breng de cellen over naar een zesputtenplaat en laat ze 72 uur herstellen. Sorteer vervolgens de cellen afzonderlijk in 96-puttenplaten, met behulp van een fac sorter met een 488 nanometer laser voor EGFP plus min.
Isoleer van de putten met groei cellulair gDNA met behulp van een commercieel verkrijgbaar DNA-isolatiekit. Amplificeer de gebieden rond de doelbase via PCR. Voer tenslotte DNA-sequencinganalyse uit op de monsters.
72 uur na incubatie bevestigt flowcytometrieanalyse de functionele reparatie van groen fluorescerend eiwit. Er werd een geleidelijke dosisrespons waargenomen naarmate de gecoördineerde niveaus van RNP en 72NT toenemen.
Overzicht
Dit protocol beschrijft een op CRISPR/Cas9 gebaseerd genbewerkingssysteem voor het herstellen van puntmutaties in zoogdiercellen. Het bevat een gedetailleerde methodologie voor het meten van genetische heterogeniteit en onsite mutagenese-analyse.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Genbewerking
- CRISPR/Cas9-technologie
- Moleculaire biologie
Achtergrond
- CRISPR/Cas9 is een revolutionaire tool voor genbewerking.
- Inzicht in onsite mutagenese is essentieel voor gentherapie.
- Gestandaardiseerde methodologieën verbeteren de reproduceerbaarheid van experimenten.
- Dit protocol richt zich op homology directed repair met behulp van enkelstrengs oligonucleotiden.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het analyseren van genetische veranderingen op doelplaatsen.
- Om het begrip van gencorrectietechnieken te verbeteren.
- Om een gestandaardiseerde aanpak vast te stellen voor toekomstig onderzoek naar genbewerking.
Gebruikte methoden
- Celkweek en synchronisatie van HTT11619-cellen.
- Bereiding van CRISPR-RNA en Cas9-proteïnecomplexen.
- Elektroporatie van cellen met het RNP-complex.
- Flowcytometrie-analyse om de resultaten van de genbewerking te bevestigen.
Belangrijkste resultaten
- De functionele herstel van het groen fluorescerende eiwit werd bevestigd.
- Indelvorming werd gemeten op de doelplaats.
- Er werd een dosisafhankelijke respons waargenomen bij de RNP-concentraties.
- Er werd een correctie van ongeveer 1% bereikt in de doelcellen.
Conclusies
- Deze methode biedt een robuust kader voor genbewerkingsstudies.
- Standaardisatie is essentieel voor de reproduceerbaarheid in gentherapieonderzoek.
- Toekomstige toepassingen kunnen therapeutische strategieën voor genetische aandoeningen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Dit protocol biedt een gestandaardiseerde methodologie om on-site mutagenese te kwantificeren tijdens CRISPR/Cas9-gemedieerde puntmutatiereparatie, een kritische factor bij het beoordelen van de veiligheid en precisie van genbewerkingsbenaderingen voor therapeutische ontwikkeling. Door de vorming van indels op de doellocatie te meten, maakt deze methode een mechanische risicoreductie van homologie-gestuurde reparatiestrategieën mogelijk, wat bijdraagt aan voorspellend vertrouwen bij de identificatie van lead-kandidaten en beslissingen over preklinische voortgang. De benadering pakt een belangrijke uitdaging in de ontdekkingsfase aan: het onderscheiden van werkelijke correctie van collaterale genetische laesies, waardoor go/no-go-evaluaties in vroege stadia van genetische medicijnpijplijnen worden geïnformeerd.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt toetsing van therapeutische hypothesen mogelijk door precieze puntmutatiereparatie te onderscheiden van onbedoelde indel-vorming op de doellocatie.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbare workflow voor het kwantificeren van genetische heterogeniteit, wat functionele targetvalidatie ondersteunt door middel van beoordeling van de correctiegetrouwheid.
- Voorspellende waarde: Meet off-target-achtige activiteit op de on-target locus, wat bijdraagt aan biologische risicoreductie en portfolio-triage van genbewerkingsconstructen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Vestigt een gestandaardiseerd celgebaseerd model (HCT116 met mutant eGFP) voor een consistente meting van editingsresultaten over verschillende experimentele condities.
- Kwantitatieve output: Levert meetbare indel-frequentie en grootteverdeling (deleties van 1–19 bp) als functionele readout voor assay-optimalisatie en reagentia-titratie.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt de voorbereiding van gevalideerde biologische systemen voor downstream screeningcampagnes die precisiemetrieken voor correctie vereisen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Verbindt de precisie van editing in de ontdekkingsfase met preklinische validatie door een benchmark te definiëren voor acceptabele mutageneseniveaus in therapeutische kandidaten.
- Risico-gecorrigeerde Voortgang: Kwantificeert de mate van on-site mutagenese als functie van reparatiekatalyse, wat datagestuurde beslissingen over de progressie van constructen mogelijk maakt.
- Mechanistische Risicoreductie: Verduidelijkt of geobserveerde correcties voortkomen uit werkelijke homology-directed repair of uit foutgevoelige mechanismen, wat bijdraagt aan de veiligheidsprofielering.
Pipeline- & workflowintegratie
De methode past binnen het continuüm van ontdekking naar preklinisch onderzoek en ondersteunt specifiek de identificatie van lead-verbindingen door een kwantitatieve maatstaf voor bewerkingsprecisie te bieden die voorafgaat aan functionele validatie in ziekterelevante systemen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van reparatiemechanismen door de bijdrage van CRISPR/Cas9 en ssODN aan nucleotide-uitwisseling versus indel-vorming te isoleren.
- Screening: Maakt assay-standaardisatie mogelijk via gesynchroniseerde celpreparatie en gedefinieerde electroporatieparameters, wat de reproduceerbaarheid tussen herhalingen verbetert.
- Analytics: Genereert kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen (indel-grootte, frequentie, clonale distributie) die een vergelijking mogelijk maken van RNP- en donor-oligonucleotide-doseringscondities.
- Translational Research: Verbindt moleculaire precisie-resultaten met preklinische risicobeoordeling door een drempelwaarde vast te stellen voor acceptabele off-target-achtige activiteit op de doellocatie.
- Enterprise Reuse: Vestigt een fundamentele, herbruikbare workflow voor het evalueren van elke CRISPR/Cas9-gebaseerde strategie voor de correctie van puntmutaties in menselijke cellen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellende zekerheid over de precisie van genbewerking door on-site mutagenese direct te meten als een storende factor voor de schijnbare correctie.
- Operationele waarde: Garandeert standaardisatie via gedetailleerde protocollen voor cellsynchronisatie, RNP-preparatie en elektroporatie, waardoor variabiliteit in de metingen van genetische uitkomsten wordt verminderd.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming door aan het licht te brengen of de waargenomen correctie gepaard gaat met significante indel-vorming, wat het biologische risico in een laat stadium vermindert.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van genbewerkingsbenaderingen mogelijk op basis van gekwantificeerde mutageneseprofielen, wat de kapitaalefficiëntie bij preklinische investeringen ondersteunt.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in mammalia-celkweek, flowcytometrie en moleculaire klonering voor gDNA-isolatie en PCR-amplificatie.
- Afhankelijk van toegang tot electroporatieapparatuur met cuvetten met een opening van 4 mm en een FACS-sorter die in staat is tot EGFP-gebaseerde single-cell sorting.
- Vereist standaardisatie van celsynchronisatie (behandeling met aphidicoline) en de bereiding van RNP-complexen tussen laboratoria voor reproduceerbare resultaten.
- Aanpassing aan andere modelsystemen kan optimalisatie van de electroporatiecondities en de afleveringsefficiëntie van donor-oligonucleotiden vereisen.
- Praktische beperking: De assay meet endogene mutagenese, maar maakt geen onderscheid tussen de bijdragen van verschillende herstelpaden zonder aanvullende mechanistische inhibitoren.
Veelgestelde vragen over biofarmacie
Chapters in this video
0:05
Title
0:38
Cell Line, Culture Conditions, and Harvest
1:57
Plating the Cells and Releasing Them from Aphidicolin Synchronization
2:44
RNA Complexing
4:13
Harvesting the Cells for Targeting
5:30
Targeting Samples
6:13
Analysis of Gene Edited Cells and Transfection Efficiency
6:57
DNA Sequence Analysis
7:56
Results: Effective Point Mutation Repair
9:41
Conclusion
