Generic-Protocol voor optimalisatie van heterologe eiwitproductie met behulp van geautomatiseerde Microbioreactor technologie
15 december 2017
Dit manuscript beschrijft een algemene aanpak voor op maat gemaakte ontwerp van microbiële teelt media. Deze optie is ingeschakeld door een iteratieve werkstroom combineren Kriging gebaseerde experimentele design en microbioreactor technologie voor voldoende teelt doorvoer, die wordt ondersteund door lab robotica om betrouwbaarheid en snelheid in vloeistof behandeling van media voorbereiding.
Het algemene doel van deze iteratieve workflow die Kringing-gebaseerd experimenteel ontwerp combineert met microbioreactortechnologie voor voldoende cultivatie-doorvoer is om een generieke benadering te beschrijven voor het op maat maken van cultivatiemedia voor microben. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van ontwikkeling van microbiële bioprocessen, zoals de optimalisatie van cultivatiemedia, bioprocescondities en fenotypering van stammen. We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we ons afvroegen of cultivatiemedia geoptimaliseerd voor kleine metabolietenproductie ook het meest geschikt zijn voor heterologe eiwitproductie.
Het grote voordeel van deze techniek is dat het de algehele ontwikkelingstijd versnelt door een slimme combinatie van experiment en modellering. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Roman Jansen, een promovendus uit mijn laboratorium. Begin deze procedure met studieconceptie en definitie van methoden zoals gedetailleerd in het tekstprotocol.
Steriliseer diepwelplaten voor de opslag van stockoplossingen op een werktafel door de platen af te vegen met 70 procent ethanol en ze vervolgens te drogen in een laminaire stroomkast. Start de kiemcultuur door 50 milliliter BHI-medium met 25 milligram per liter kanamycine te inoculeren met één aliquot uit de werkcelbank. Plaats alle benodigde laboratoriummaterialen op de robotwerktafel en giet de stockoplossingen in de bijbehorende laboratoriummaterialen.
Start vervolgens de robotwerkstroom voor mediavoorbereiding, zodat de laatste stap, dat wil zeggen de inoculatie, op tijd wordt bereikt voor het begin van de kiemcultuur. Bemonster de kiemcultuur na ongeveer twee uur om de groei te bewaken door de optische dichtheid te meten bij 600 nanometer of O-D-600. Blijf de groei elke uur controleren.
Na ongeveer vijf uur bereikt de cultuur een O-D-600 tussen drie en vier en wordt gebruikt om de hoofdculturen te inoculeren. Plaats de kiemcultuur op de werktafel van de vloeistofhandler en vervolg het mediavoorbereidingsprotocol. Verzegel de cultivatiemicrotiterplaten na inoculatie.
Plaats vervolgens de verzegeld cultivatie-MTP in het Biolector-apparaat. Start vervolgens het voorgedefinieerde cultivatieprotocol. Gooi de resterende stockoplossingen weg volgens de bioveiligheidsvoorschriften, indien nodig.
Zaai vervolgens de cultuur vanaf de robotwerktafel. Reinig de herbruikbare laboratoriummaterialen voordat u begint met het protocol voor decontaminatie van de vloeistofhandler. Stop de hoofdcultuur na een looptijd van 17 uur en verwerk de gegevens zoals beschreven in het tekstprotocol.
Om de G-F-P-titer te kwantificeren, brengt u eerst de celsuspensies uit alle cultivatieputjes over in vooraf gelabelde reactiebuisjes. Centrifugeer vervolgens de celsuspensies gedurende 10 minuten op maximale snelheid met behulp van een tafelcentrifuge om het celvrije supernatant te verkrijgen. Breng vervolgens 200 microliter van elk celvrij supernatant over in een zwarte 96-wells MTP met een transparante bodem.
Lees de G-F-P-specifieke fluorescentie bij 488 nanometer voor excitatie en 520 nanometer voor emissiegolflengte met behulp van een geschikte microplaatlezer. Na het meten van de G-F-P-fluorescentie kan de microplaat direct worden gebruikt voor bepaling van het eiwitgehalte van de celvrije supernatanten met standaardprotocollen zoals een Bradford- of B-C-A-test. Ga vervolgens verder met gegevensanalyse zoals beschreven in het tekstprotocol.
De gedemonstreerde procedure bestaat uit één ronde van experimenten, de resultaten worden gebruikt voor het ontwerpen van verdere rondes met maximale verwachte verbetering van het G-F-P-signaal. Referentie-experimenten worden in elke ronde geplaatst voor het analyseren van gegevensvariabiliteit en het detecteren van experimentele uitbijters. Deze contourplot geeft een overzicht van de optimalisatieprocedure.
De analyse van de verzamelde gegevensset na iteratie drie onthulde een beperking van het positieve effect van magnesium en identificeerde een optimale concentratiebereik. Daarom werd besloten in iteratie vier de concentratiereeks alleen voor calcium verder uit te breiden. De procedure werd twee keer herhaald in iteratie vijf en zes totdat een verzadiging van het G-F-P-signaal werd gevonden.
Deze verzadiging wordt verklaard door precipitatie van calciumzout voor de toegepaste concentraties van calcium, die niet beschikbaar zijn voor de cel. De zevende iteratie werd gebruikt om de grenzen in meer detail te verkennen. De optimale concentratiebereiken van mediacomponenten voor het verzadigde G-F-P-signaal kunnen betrouwbaar worden geïdentificeerd met een statistische Z-test.
Het toont het geïdentificeerde plateau zoals bepaald en gevisualiseerd met behulp van de Kringing kit tool box. De Kringing kit toolbox is gratis beschikbaar en wordt geleverd met een gedetailleerde tutorial die uitlegt hoe u de functies kunt gebruiken. De generieke aard van het gepresenteerde protocol maakt verschillende aanpassingen mogelijk, zoals het bestuderen van andere microbiële expressiehosts of het optimaliseren van andere eigenschappen van het doeleiwit, zoals glycosyleringspatroon of disulfidebindingen.
De integratie van een embryosysteem verhoogt de experimentele doorvoer, wat grote tijdsbesparingen mogelijk maakt. Bij het vervangen van volledig controleerbare en beïnvloede bioreactoren door amniar-systemen, moet de schaalbaarheid van resultaten worden overwogen. Wiskundig modelleren en ontwerp van experimenten helpen om de informatie-inhoud van meetgegevens te maximaliseren met betrekking tot het onderzochte doel.
Overzicht
Dit manuscript beschrijft een generieke aanpak voor het op maat gemaakte ontwerp van microbiële kweekmedia met behulp van een iteratieve workflow. Deze methode combineert Kriging-gebaseerd experimenteel ontwerp en microbioreactortechnologie om de doorvoersnelheid en betrouwbaarheid van de kweek te verhogen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Ontwikkeling van microbiële bioprocessen
- Experimenteel ontwerp
- Microbioreactortechnologie
Achtergrond
- De optimalisatie van kweekmedia is cruciaal voor microbiële processen.
- De productie van kleine metabolieten en heterologe eiwitten vereist op maat gemaakte media.
- Het combineren van experimenten met modellering kan de ontwikkeltijden versnellen.
- Robotische systemen verhogen de efficiëntie van vloeistofbehandeling bij de bereiding van media.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor het optimaliseren van microbiële kweekmedia.
- Het onderzoeken van de relatie tussen de samenstelling van het medium en de eiwitproductie.
- Het demonstreren van de iteratieve workflow voor het ontwerp van media.
Gebruikte methoden
- Gebruik van een experimenteel ontwerp gebaseerd op Kriging.
- Implementatie van microbioreactortechnologie voor cultivatie.
- Robotgestuurde vloeistofbehandeling voor de bereiding van media.
- Statistische analyse om de optimale concentraties van mediacomponenten te identificeren.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van optimale concentratiebereiken voor mediumcomponenten.
- Demonstratie van het iteratieve proces dat leidt tot een verbeterd G-F-P-signaal.
- Validatie van resultaten via statistische Z-toetsen.
- Aanpasbaarheid van het protocol voor diverse microbiële expressiegastheren.
Conclusies
- De gepresenteerde methode verbetert het ontwerp van microbiële kweekmedia aanzienlijk.
- Integratie van robotica verhoogt de doorvoer en efficiëntie.
- Resultaten kunnen worden geschaald en aangepast voor verschillende toepassingen in het microbiologisch onderzoek.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Dit protocol behandelt de biofarmaceutische uitdaging van het optimaliseren van microbiële kweekmedia voor de productie van heterologe eiwitten, een cruciale stap in stamontwikkeling en de efficiëntie van bioprocessen. Door Kriging-gebaseerd experimenteel ontwerp te integreren met microbioreactortechnologie en robotgestuurde vloeistofbehandeling, versnelt deze methode de optimalisatiecycli van media en verbetert het het voorspellend vertrouwen in de mediaformulering. De generieke, aanpasbare workflow ondersteunt vroege beslissingen in het ontdekkingsproces door een snelle, datagestuurde identificatie van optimale nutriëntenomstandigheden mogelijk te maken die de opbrengst aan recombinant eiwit en de robuustheid van het proces verhogen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de effecten van mediumcomponenten op de eiwitproductie te onderzoeken om de biologische vereisten voor heterologe expressie te verduidelijken.
- Operationele waarde: Ondersteunt de snelle screening van mediumformuleringen om de levensvatbaarheid van het doelwit te waarborgen alvorens op te schalen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve GFP-titergegevens als een reproduceerbare readout voor de efficiëntie van eiwitproductie onder verschillende mediumcondities.
- Operationele waarde: Standardiseert cultivatie- en detectieworkflows via automatisering, waardoor de reproduceerbaarheid en doorvoer van de assay worden verbeterd.
- Strategische waarde: Bereidt gevalideerde mediumcondities voor op downstream screeningcampagnes, wat de variabiliteit bij de evaluatie van verbindingen of stammen vermindert.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Stelt een vertaalbaar kader vast voor het optimaliseren van microbiële gastheren die worden gebruikt bij preklinische eiwitproductie, wat de consistentie tussen de verschillende ontwikkelingsstadia ondersteunt.
- Operationele waarde: Faciliteert de naadloze overdracht van geoptimaliseerde media van discovery- naar preklinische workflows via gestandaardiseerde protocollen.
Integratie van pipeline en workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van stamengineering tot lead-identificatie, waarbij mediumoptimalisatie een directe invloed heeft op de eiwitexpressieniveaus en de haalbaarheid van het downstreamproces.
- Discovery Biology: Toetst hypothesen over de impact van nutriënten op de eiwitopbrengst, wat mechanistische risicoreductie van expressiesystemen mogelijk maakt.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare cultivatieresultaten die geschikt zijn voor high-throughput screeningplatforms.
- Analytics: Biedt GFP-fluorescentie- en eiwitconcentratiemetingen die een kwantitatieve vergelijking van mediaformuleringen mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Ondersteunt continuïteit door mediagebonden condities te definiëren die gereproduceerd kunnen worden in grootschaligere preklinische modellen.
- Bedrijfsbrede Hergebruik: Biedt een modulair, aanpasbaar protocol dat toepasbaar is op meerdere projecten, hosts en eiwitdoelen, waardoor redundante ontwikkelingsinspanningen worden verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in mediumontwerp door iteratieve, modelgestuurde experimenten.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en schaalbaarheid via robotische vloeistofbehandeling en integratie van microbioreactoren.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door de samenstelling van het medium te koppelen aan de proteineopbrengst, waardoor biologische risico's in een later stadium worden verminderd.
- Impact op de portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van stammen en mediumcondities mogelijk op basis van datagestuurde optimalisatie-uitkomsten.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in experimenteel ontwerp, het bedienen van microbioreactoren en robotische vloeistofhandelingssystemen.
- Afhankelijk van toegang tot microbioreactorplatforms (bijv. Biolector), platenvlezers en centrifugatieapparatuur voor de verwerking van het supernatant.
- Vereist afstemming tussen teams over gegevensverzameling, GFP-meetnormen en protocollen voor statistische analyse (bijv. Z-toetsing).
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij het overbrengen van het protocol naar verschillende microbiële gastheren of eiwitdoelen (bijv. glycosylering, disulfidebrug-afhankelijke eiwitten).
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak van referentie-experimenten per iteratie om uitschieters te detecteren en de betrouwbaarheid van de gegevens te waarborgen, zoals vermeld in de iteratieve workflow.
