Name: Generic-Protocol voor optimalisatie van heterologe eiwitproductie met behulp van geautomatiseerde Microbioreactor technologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Ontdek een iteratieve workflow met Kriging-gebaseerd experimenteel ontwerp en microbioreactortechnologie voor het optimaliseren van microbiele kweekmedia. Deze methode versnelt de ontwikkeling van heterologe eiwitproductie door slimme combinatie van experiment en modellering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De wetenschappelijke activiteiten van het centrum van de wetenschap van de bosbouwbiomassa waren het financieel ondersteund door het ministerie van innovatie, wetenschap en onderzoek in het kader van de NRW-Strategieprojekt-BioSC (nr. 313/323-400-002 13). De auteurs bedanken de ministerie van innovatie, wetenschap, en onderzoek van Noordrijn-Westfalen en de Heinrich Heine Universiteit Düsseldorf voor een beurs voor Lars Freier binnen de CLIB-afgestudeerde Cluster industriële biotechnologie. Verdere financiering van het programma spaties inschakelen "Helmholtz innovatie Labs" van Duitse Helmholtz vereniging ter ondersteuning van het "microbiële Bioprocess Lab – A Helmholtz Innovation Lab" ontvangen.

De auteurs hebben niets te onthullen.

De algemene aard van het gepresenteerde protocol kunt verschillende aanpassingen, bijvoorbeeldvoor het bestuderen van andere microbiële expressie hosts9,47,48,49,50, 51, of andere eigenschappen van de doel-eiwitten, zoals glycosylatie patroon of dissulfide bindingen te optimaliseren. Het protocol wellicht ook worden aangepast aan de beschikbare lab-apparatuur. De integratie van een MBR-systeem kunt verhogen van experimentele doorvoer, waarmee grote besparingen in tijd. Bij vervanging volledig geïnstrumenteerde en controleerbare bioreactoren door MBR systemen dient schaalbaarheid van resultaten evenwel worden overwogen8,37,52,53. Het gebruik van DOE methodologieën en wiskundige modellering helpt bij het maximaliseren van de informatie-inhoud van meetgegevens met betrekking tot de bestudeerde objectieve54 door efficiënte experimentele planning en model-gebaseerde data interpretatie15.
Wijzigingen in de methode Naast multifunctioneel en uitbreidbaar robotic liquid handling-systemen zoals gebruikt in deze studie, dient te worden vermeld zijn er verschillende kleinere liquid handling-systemen commercieel beschikbaar die geschikt zijn voor het uitvoeren van deze taak en afvaltonnen van laminaire flow werk bankjes. Als geen enkel geautomatiseerde pipetting systeem beschikbaar is, kunnen het zijn dat verschillende media composities volgens het plan DOE ook worden gerealiseerd door handmatige pipetteren met behulp van interne en/of meerkanaals pipetten. Aangezien de handmatige voorbereiding meer gevoelig voor fouten is en zeer gerichte werk voor heel lange tijd vergt, is het aanbevolen om een lager aantal composities van verschillende media voor te bereiden.
Afhankelijk van de mogelijkheden van de werknemer MBR-systeem, zal het bijbehorende protocol van de teelt variëren. Bijvoorbeeld, als er geen online meting van biomassa formatie beschikbaar is, wellicht volstaat het voor het meten van de concentratie van de biomassa na voltooiing van de groei-experiment. In combinatie met online monitoring van de pH en de opgeloste zuurstof, die wordt uitgevoerd in verschillende systemen van de MBR, de groei verzadiging kan veilig worden bepaald. In principe kunnen de groei experimenten worden uitgevoerd in MTPs alleen in schudden van starterscentra, zonder het gebruik van een MBR-systeem geplaatst. In dit geval goede teelt voorwaarden moeten worden gewaarborgd: (1) zuurstof-limited teelten kunnen worden vermeden door het gebruik van MTPs met geschikte geometrieën, in combinatie met de juiste frequenties schudden en schudden diameters, bijvoorbeeld, vierkant 96 of 24 diep goed platen bediend, 1000 rpm op 3 mm afstand of bij 250 omwentelingen per minuut op afstand 25 mm, respectievelijk. Nog belangrijker is, hoe lager de overdrachtssnelheden haalbaar maximale zuurstof, hoe lager de belangrijkste koolstofbron moet worden geconcentreerd. Zoals hierboven vermeld, voor deze studie, was het gebruik van 10 g/L glucose geschikt om te voorkomen dat zuurstof beperking voor de werknemer teelt voorwaarden; (2) bemonstering van de culturen van de MTP voor biomassa en product kwantificering moet tot een minimum worden beperkt. Telkens wanneer die de MTP is verwijderd uit de schudden incubator, zuurstof overdracht zal onmiddellijk uitsplitsing die leiden ongunstige teelt voorwaarden tot kan; (3) in het advies van de auteurs, wordt het gebruik van MTP lezers als teelt apparaten niet aanbevolen omdat deze apparaten zijn niet ontwikkeld voor dit doel. Bijvoorbeeld, schudden mechanica werden gebouwd voor de occasionele mengen van microplates na de toevoeging van het reagens en dus vaak gebrek aan robuustheid voor lange runs van voortdurend schudden blijvende dagenlang. Bovendien, kan niet voldoende ingangsvermogen nodig voor microbiële teelten in deze lezers worden gerealiseerd. De integratie van de gemeten optische dichtheid in korte tijdsintervallen vereist stoppen van het schudden beweging, wat resulteert in herhaalde perioden van zuurstof beperking. Bovendien zal verdamping in dergelijke systemen over perioden van de lange teelt resultaten verstoren. Voor meer details over het verrassend complexe onderwerp over het gebruik van MTPs voor microbiële teelten, wordt de lezer verwezen naar de geciteerde literatuur22,23,24,25,26 en verwijzingen daarin.
Verdere overwegingen Speed-up iteratieve optimalisatie stappen, is het aangeraden om zorgvuldig selecteren de analytische methode voor de kwantificering van het product. Snelle en eenvoudige methoden de voorkeur verdient ten koste van de precisie en nauwkeurigheid, zoals de strategie van iteratieve proefopzet experimentele onnauwkeurigheid tolereert. De definitieve resultaten moeten echter worden gecontroleerd tegen voldoende precieze en accurate product kwantificering methodes die ingewikkelder wellicht. In het algemeen, zorgvuldige evaluatie en de besluitvorming over de studie procedures vereist inspanning in het begin van de studie, maar betalen op de lange termijn, nadat routinemethoden hebben vastgesteld.
Het is sterk aanbevolen om het definiëren van een referentie-experiment, dat ten opzichte van is alle experimenten tijdens de optimalisatie. Dat wil zeggen, worden de toegepaste middellange component concentraties evenals gemeten output via delen door referentiewaarden genormaliseerd. Op deze manier worden alle toegepast en gemeten waarde kan worden geïnterpreteerd als de x-vouw van de referentiewaarde. Om te houden rekening variaties tussen de platen, worden vijf referentie experimenten uitgevoerd op elke plaat. De gemiddelde waarde van de gemeten resultaten wordt gebruikt voor de normalisatie.
Het kan over het algemeen niet worden gegarandeerd dat het ontwikkelde medium ook optimaal voor andere stammen is. Het verbeterde medium zal waarschijnlijk ook wel geschikt voor het cultiveren van expressie stammen met kleine genetische verschillen, bijvoorbeeldwanneer mutagenese studies (produceren enzym varianten met één aminozuur vervangingen verkregen Hoewel zelfs één puntmutaties zijn beschreven effect cellulaire metabolisme en heterologe expressie prestaties55,56). In dit geval kan een eerste stap, gevolgd door protocollen voor high-throughput expressie screenings57dienen als de gepresenteerde protocol. Als het protocol wordt gebruikt voor middellange ontwikkeling met latere schaal-up van fed-batch teelten, het geoptimaliseerde medium dient te worden geverifieerd voor de bijbehorende Bioprocestechnologie-voorwaarden, zoals kloon screening van campagnes op de microscale verschillende top artiesten voor verschillende voeding strategieën en teelt media52,58. Bovendien kan de geïntroduceerde KriKit36 in het algemeen bijdragen tot verbeterde holistische Bioprocestechnologie optimalisatie.Pas onlangs, waren de tool capaciteiten uitgebreid ook steunen multi objectieve optimalisatie40, kunnen die van belang zijn voor het optimaliseren van beide bedrijven stroomopwaarts en stroomafwaarts processen59,60.

Moderne recombinante gentechnologie maakt het breed gebruik van technische enzymen voor diverse toepassingen in de farmaceutische industrie, diervoeding, organische chemie, en voedselverwerking1,2,3. De productie van technische enzymen in grote hoeveelheden is een belangrijk onderwerp voor de industriële biotechnologieën en voor geoptimaliseerde recombinante eiwitproductie, en beide stam en bioprocess engineering is nodig. Voor de generatie van efficiënt gemanipuleerde productie stammen, verschillende genetische bibliotheken zijn beschikbaar, bijvoorbeeldvoor evenwichtige gen expressie4 of verhoogde secretie efficiëntie5.
Corynebacterium glutamicum is een belangrijke producent van aminozuren op de industriële schaal6,7 en vertegenwoordigt een aantrekkelijke niet-conventionele expressie gastheer voor de secretoire productie van recombinante eiwitten8 ,9. Zowel de algemene secretoire (Sec) en de tweeling-arginine translocatie (Tat) traject zijn aanwezig in C. glutamicum en werden met succes toegepast voor recombinante eiwitten secretie10. Uitgebreide ervaring in bioprocess engineering met betrekking tot aminozuur productie op de industriële schaal, evenals de mogelijkheid om eiwitten g/L bedragen11 te grote robuustheid betreffende Bioprocestechnologie inhomogeneities gevonden in grootschalige afscheiden teelten12,13, maken C. glutamicum een veelbelovende platform organisme voor de secretoire productie van heterologe eiwitten op de industriële schaal.
Voeding middellange optimalisatie is bekend om de productie van recombinante eiwitten met microbiële systemen14,15,16,17 , en bijgevolg, de aanpassing van medium samenstelling is een veelbelovende stap in Bioprocestechnologie ontwikkeling met betrekking tot optimale productiviteit18,19,20,21. Intens onderzoek betreffende de toepassing van de microtiterplaat platen (MTPs) voor microbiële teelt22,23,24 baande de weg voor de ontwikkeling en het ontwerp van MTPs voor microbiële teelt25 ,26 en de ontwikkeling van MTP gebaseerde microbioreactor (MBR) systemen met online monitoring en milieu controle27,28. MBRs kunnen een aanzienlijke toename van de experimentele teelt doorvoer. Bovendien, MBR systemen als gevolg van andere soorten bioreactoren, bijvoorbeeld, bubble kolommen of stirred tank reactoren, zijn beschikbaar voor microbiële Bioprocestechnologie optimalisatie29,30,31, 32.
In het algemeen, profiteren optimalisatie studies van verhoogde experimentele doorvoer, die wordt nog krachtiger in combinatie met DOE methodologieën, zodanig beoordelen van interacties tussen ontwerp-variabelen of verminderen van hoge-dimensionale Zoek ruimten. Bijgevolg, het gecombineerd gebruik van MBR systemen, lab automatisering en DOE is gebleken een krachtige methode in biotechnologie8,16,33,34,35.
Een protocol voor media optimalisatie wordt gepresenteerd voor het combineren van state-of-the-art lab automatisering, MBR technologie met online proces monitoring en analyse/experimentele design Kriging gebaseerde gegevens. De methodologie van de Kriging is geïmplementeerd in een MATLAB Toolbox ("KriKit") die kunnen worden gedownload en gebruikt gratis voor de gratis36. Als de toepassing bijvoorbeeld is de maximalisatie van secretoire groene ﬂuorescent proteïne (GFP) productie met C. glutamicum komt te staan door het optimaliseren van de samenstelling van de CgXII minimaal medium. GFP titer werd gekozen als de doelstelling optimalisatie als het gemakkelijk kan worden gekwantificeerd en algemeen als model eiwit voor studies over MBR systemen37,38,39 toegepast wordt.
Het voorgestelde kader is verdeeld in vier stappen, die zijn aangegeven in Figuur 1. De stappen worden aangegeven door vak frames en corresponderen met de secties van het protocol. De eerste stap (figuur 1A) is om de doelen van het project definiëren en bepalen welke vereiste methoden. De combinatie van DOE methodologieën, MBR technologie en lab automatisering een doorvoersnelheid kan verhoogd experimentele die vraagt om krachtige gegevensverwerking. De tweede stap (figuur 1B) is gericht op het detecteren van gevoelige ontwerp variabelen (d.w.z., middellange onderdelen) met hoge invloed op de doelstelling van de optimalisatie. Dit leidt tot een verminderd aantal ontwerp van belang zijnde variabelen. De derde stap (Figuur 1 c) bestaat uit een iteratief optimalisatie voor een meer gedetailleerd onderzoek van de functionele relatie tussen de overige ontwerp-variabelen en de doelstelling van belang. Met behulp van de achtereenvolgens uitgebreide gegevensset, wordt de Kriging benadering toegepast voor het voorspellen van de experimentele resultaten op zonder afmetingen locaties. De iteratieve cyclus stopt zodra het Kriging model een optimale of plateau met voldoende nauwkeurigheid voorspelt. De resultaten worden bevestigd in de vierde stap (Figuur 1 d), beginnend met een nadere gevoeligheidsanalyse rond de geïdentificeerde optimale. Als aanvankelijk ongevoelig onderdelen zijn ook ongevoelig worden de optimale regio, is het redelijk te veronderstellen dat dit tijdens de iteratieve optimalisatie-procedure in de derde stap geldt. Daarna wordt het geadviseerd om te controleren of optimalisatie resultaten door toepassing van orthogonale methoden, zoals een bepaling van de activiteit of de SDS-pagina.
De algemene aard van het gepresenteerde protocol voorziet in gemakkelijke aanpassing aan verschillende lab-apparatuur, andere expressie hosts en doel proteïnen van keuze, evenals verdere Bioprocestechnologie variabelen zoals pH waarde of teelt temperatuur.Bovendien kunnen andere optimalisatie doelstellingen zoals eiwit productieomvang, specifieke opbrengst of kwaliteit van de producten worden gekozen aan de werkingssfeer van andere studies voor optimalisatie.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig1.jpg" style="font-size: 14px;"> 
Figuur 1 : Workflow optimalisatie studie. De vier frame vakken komen overeen met delen van het protocol, "Conceiving de studie en definitie van Methods" (deel 1), "Sensitivity Analysis" (sectie 2), "Iteratieve Optimization" (sectie 3) en "Validatie" (punt 4). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

<table><tbody><tr><td>BioLector</td><td>m2p-labs</td><td>G-BL-100</td><td></td></tr><tr><td>Flowerplate</td><td>m2p-labs</td><td>MTP-48-BOH</td><td>Voor cultivatie in het BioLector-apparaat</td></tr><tr><td>Sealing foil</td><td>m2p-labs</td><td>F-GP-10</td><td>Steriele afdichting voor Flowerplate</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>2016b</td><td></td></tr><tr><td>KriKit</td><td>Forschungszentrum J&uuml;lich</td><td>n/a</td><td>Vrij beschikbaar, MATLAB-installatie vereist</td></tr><tr><td>Janus pipetting robot</td><td>Perkin Elmer</td><td>n/a</td><td>Inclusief "WinPrep" software-installatie</td></tr><tr><td>12-column deep well microplate</td><td>E&amp;K Scientific</td><td>EK-2034</td><td>Container voor medium stock oplossingen</td></tr><tr><td>96 well microplates, transparent, F-bottom</td><td>Greiner</td><td>655101</td><td>Voor Bradford-eiwitanalyse</td></tr><tr><td>&micro;clear 96 well microplates, black body, transparent F-bottom</td><td>Greiner</td><td>655087</td><td>Voor fluorescentiemeting in cel-vrije supernatanten</td></tr><tr><td>Pipette Research&nbsp;plus multi-channel pipettes</td><td>Eppendorf</td><td>n/a</td><td>Vereenvoudigt handmatig vloeistofbeheer met microplates</td></tr><tr><td>TruPAG&nbsp;Precast Gels</td><td>Sigma</td><td>PCG2002</td><td>Voor SDS-Page analyse van cel-vrije supernatanten</td></tr><tr><td>Bradford Reagent</td><td>Sigma</td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Bevat pEKEx2 plasmide met fusie van GFP-gen en PhoD signaalpeptide van B.subtilis als expressie-insert. Plasmide biedt kanamycine-resistentie. Beschreven en gepubliceerd door Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633&ndash;42 (2007)</td></tr></tbody></table>

generic-protocol voor optimalisatie van heterologe eiwitproductie met behulp van geautomatiseerde microbioreactor technologie

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Een corebusiness in industriële biotechnologie met behulp van microbiële productie cel fabrieken is het iteratieve proces van stam engineering en optimalisatie van Bioprocestechnologie voorwaarden. Een belangrijk aspect is de verbetering van de teelt medium om te zorgen voor een optimale omgeving voor microbiële vorming van het product van belang. Het is ook aanvaard dat de media samenstelling dramatisch algemene Bioprocestechnologie prestaties kan beïnvloeden. Voeding middellange optimalisatie is bekend om recombinant eiwit productie met microbiële systemen en dus dit is een veelbelovende stap in Bioprocestechnologie ontwikkeling. Echter zijn vaak standaard media recepten afkomstig uit de literatuur, aangezien op maat gemaakt ontwerp van het medium van de teelt is een vervelende taak die microbioreactor technologie voor voldoende teelt doorvoer, snelle product analytics, evenals ondersteuning vereist door lab robotica om betrouwbaarheid in vloeistof verwerken stappen. Bovendien, geavanceerde wiskundige methoden zijn vereist voor rationeel analyseren van meetgegevens en efficiënt ontwerpen van parallelle experimenten zoals te bereiken optimale informatie-inhoud.
De algemene aard van het gepresenteerde protocol voorziet in gemakkelijke aanpassing aan verschillende lab-apparatuur, andere expressie hosts en doel proteïnen van belang, evenals verdere Bioprocestechnologie parameters. Bovendien kunnen andere optimalisatie doelstellingen zoals eiwit productieomvang, specifieke opbrengst of kwaliteit van de producten worden gekozen aan de werkingssfeer van andere studies voor optimalisatie. De toegepaste Kriging Toolbox (KriKit) is een algemene tool voor ontwerp van experimenten (DOE) die aan betere holistische Bioprocestechnologie optimalisatie bijdraagt. Het ondersteunt ook multi objectieve optimalisering die kan van belang in het optimaliseren van processen van zowel upstream- en downstream.

Het geïntroduceerde protocol werd toegepast voor het maximaliseren van de titer van secreted GFP. In het bijzonder de GFP titer na 17u voor teelt werd gekozen als de doelstelling van de optimalisatie. Online fluorescentie detectie van GFP toegestaan eenvoudig product kwantificering. De normalisatie van GFP signaal met gegevens uit de teelt van een verwijzing is echter onontbeerlijk om de reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid van de resultaten. Een voorselectie van de mediacomponenten werd uitgevoerd op basis van rationele, zoals beschreven in sectie 1. Experimenten werden uitgevoerd volgens de instructies van deel 1: de parameters van de natte lab procedures waren gedefinieerd voor de hele studie samenhang en de reproduceerbaarheid van de resultaten.
Zoals beschreven in sectie 2, werd een eerste screening voor het identificeren van relevante bestanddelen waaruit een significant effect op de optimalisatie doelstelling voor de verdere, meer gedetailleerde studie uitgevoerd. De MTP-gebaseerde MBR-systeem maakt het mogelijk 48 experimenten worden uitgevoerd in parallel. Rekening houdend met het maximaal mogelijke aantal parallelle experimenten op één MTP (48) en het totale aantal media onderdelen (11) maakt de 2IVontwerpen11-6 fractionele een goede keuze. Deze proefopzet bestaat uit 32 experimenten en maakt de schatting van het belangrijkste effect voor elk van de onderzochte media-onderdelen. De resterende teelt putten (16) werden gebruikt voor meerdere replicatieonderzoeken van experimenten met de referentie-medium reproduceerbaarheid en positionele effecten te beoordelen. Dat wil zeggen, elk experiment eenmaal is uitgevoerd (geen replicaten), met uitzondering van de verwijzing experiment (vijf wordt gerepliceerd).
Tabel 1 geeft een overzicht van de resultaten van de analyse van de screening. In het weloverwogen concentratiebereik bleek variërend van de meerderheid van de mediacomponenten niet een merkbaar effect op het doel. Component NH4+ toont een sterk negatief effect, terwijl Ca2 + en Mg2 + Toon de sterkste positieve tendens. Het effect van Mg2 + is niet significant voor het stroombereik van concentratie, maar misschien wel voor een breder scala van de concentratie. Bijgevolg werd besloten te weglaten NH4+ van het medium en te onderzoeken van het effect van Ca2 + en Mg2 + in verdere experimenten.
Sectie 3 beschrijft de iteratieve optimalisatie-procedure die wordt gebruikt voor het maximaliseren van het GFP fluorescentie signaal terwijl het variëren van de concentraties van Ca2 + en Mg2 +. In herhaling 1, werd de hypothese dat NH4+ kan worden weggelaten getest. Het concentratiebereik voor Ca2 + en Mg2 + goedgekeurd uit de analyse van de screening. De minimumconcentratie van NH4+ is ingesteld op nul en de maximale concentratie was overgenomen uit de screening-experiment. In de volgende experimenten, waren de component-concentraties verdeeld over een 3 x 3 x 3 grid binnen het gedefinieerde concentratiebereik, resulterend in 27 experimenten. Tijdens alle teelten, vijf replicatieonderzoeken van referentie medium werden opgenomen, die diende als interne standaard en om ervoor te zorgen dat geen positionele effecten over de MTP is opgetreden. Voor de resterende 16 putten, werden de concentraties van NH4+, Ca2 +en Mg2 + willekeurig verspreid binnen het opgegeven bereik.
Figuur 5 A de resultaten van de eerste iteraties visualiseert. Aslabels verwijzen naar de concentraties van de component gebruikt in de oorspronkelijke verwijzing medium, aangegeven door x Ref. De blauwe oppervlakken vertegenwoordigen de Kriging interpolaties die werden berekend aan de hand van de KriKit software. Elk oppervlak is gekoppeld aan een relatieve concentratie voor NH4+ (donkerblauw: 0 x Ref, geruit: 1 x Ref, lichtblauw: 2 x Ref). Deze visuele representatie blijkt dat het is gunstig voor het weglaten van NH4+. Interpolatie oppervlakken tonen ook de positieve effecten van zowel Mg2 + en Ca2 +, als alle vliegtuigen stijgen met toenemende concentraties.
Op basis van de resultaten van iteratie 1, werd besloten uit te breiden van de concentratie bereik van Ca2 + en Mg2 + door een verdubbeling van de maximale concentraties en verschuift de proefopzet venster naar de rechterbovenhoek, Zie Figuur 5 B. binnen dit bereik, de concentraties werden verspreid op een 6 x 6 raster. Dit zorgt voor een gelijkmatige verdeling over het volledige concentratiebereik, wat leidt tot optimale Kriging interpolatie resultaten. Figuur 5 B toont het Kriging interpolatie perceel op basis van de gecombineerde gegevens gemeten in beide iteraties (rode stippen en gele pleinen). Voor beide, Ca2 + en Mg2 +, blijft het positieve effect van de toenemende hun concentraties. Daarom de procedure werd herhaald door een verdubbeling van de maximale concentratie en dus de proefopzet venster werd verplaatst naar het verkennen van de grenzen van de hogere juiste hoek.
Figuur 6 A geeft een overzicht van de resterende optimalisatie-procedure. Het onderzoek van de verzamelde data set tot iteratie 3 bleek dat een beperking van het positieve effect van Mg2 +, dat wil zeggen, een optimale concentratie bereik van Mg2 + werd geïdentificeerd. Daarom werd besloten verder uit te breiden het concentratiebereik alleen voor Ca2 + (iteratie 4). Deze procedure werd tweemaal herhaald (iteratie 5 en 6) totdat een verzadiging van het GFP-signaal is gevonden. Deze verzadiging is te verklaren door de neerslag van Ca-zouten voor de toegepaste concentraties van Ca2 +, die niet beschikbaar voor de cellen zijn.
Als experimentele resultaten zijn altijd verstoord door het lawaai, de resulterende Kriging interpolatie verschijnt onregelmatig en visuele inspectie kan leiden tot valse conclusies. Echter kan het bereik van de optimale concentratie van media-onderdelen voor de verzadigde GFP-signaal op betrouwbare wijze worden geïdentificeerd met de statistische z -test, die ook ten uitvoer wordt gelegd in KriKit. De z -toets gebruikt direct de intrinsieke statistische informatie van de Kriging methode, d.w.z., voorspelling waarden en voorspelling onzekerheden. Figuur 6 B toont het geïdentificeerde plateau, als het vastberaden en gevisualiseerde met de werkset KriKit.Werkset KriKit is vrij beschikbaar36 en komt met een gedetailleerd leerprogramma dat verklaart hoe de functies te gebruiken.
Als er meer dan twee relevante bestanddelen worden gevonden, bereikt 3D-visualisatie zijn limiet. KriKit biedt meerdere andere mogelijke visuele representatie methoden zoals films of "screening plot". Als de optimale potentieel binnen het gedefinieerde concentratiebereik ligt, zijn nieuwe experimenten automatisch ontworpen met behulp van de verwachte verbetering40,46. Het experimentele ontwerp op basis van de verwachte verbetering is geïntegreerd in de werkset KriKit. Meer gedetailleerde informatie kan worden gevonden in de softwaredocumentatie.
Nadat de iteratieve procedure, werd een verificatie van de resultaten uitgevoerd, zoals beschreven in deel D. De geldigheid van de oorspronkelijke aannames werd gecontroleerd door het uitvoeren van een gevoeligheidsanalyse van de extra met behulp van de optimale gemiddelde samenstelling. Dat wil zeggen, alle onderdelen van de oorspronkelijke media van belang waren gevarieerd, maar Ca2 + en Mg2 + waren ingesteld op hun optimale concentratieniveaus. In deze studie, de optimale concentraties <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/56234/56234eq8v2.jpg"> = 32 x Ref en <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/56234/56234eq9v2.jpg"> = 6.8 x Ref werden gekozen. Tabel 2 toont de resultaten van de validatie-screening. Net als bij de eerste gevoeligheid screening (Zie tabel 1), NH4+ heeft nog steeds een aanzienlijke negatieve invloed en resterende effecten zijn nog steeds te verwaarlozen.
Als gevolg van de gemakkelijke toegang, werd het GFP fluorescentie signaal uit de teelt suspensie gebruikt voor het kwantificeren van de extracellulaire GFP-titer tijdens alle experimenten. Omwille van de controle, werd GFP fluorescentie gevalideerd tegen andere metingen. Omdat GFP wordt uitgescheiden via de Tat-traject, kan niet de fluorescentie-signaal discrimineren tussen intra- en extracellulaire GFP. Dus, teelten werden gereproduceerd met behulp van het referentie-medium en het geoptimaliseerde medium. Naast de fluorescentie-meting van cel-vrije teelt supernatant, gehalte aan andere melkeiwitten werd gekwantificeerd door de analyse van Bradford en (semi)-kwaliteitsverbetering GFP gevisualiseerd door SDS-pagina15. Alle resulterende meting signalen werden ongeveer verdubbeld voor teelten met geoptimaliseerde medium in vergelijking met referentie medium en gevalideerd de ongeveer 100% verbetering van de prestaties van de secretie van geoptimaliseerde medium. Bijgevolg kan GFP specifieke fluorescentie van schorsing van de teelt worden beschouwd als een geschikte metric voor optimalisatie doel, dat wil zeggen, de extracellulaire GFP-titer.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig2.jpg"> 
Figuur 2 : Screenshot uit de lijst volume pipetting voor gevoeligheidsanalyse. Vermeldingen in de eerste kolom toewijzen een unieke id aan alle volumes van een rij; Deze identificatie is het MTP goed nummer van de doel-teelt MTP op de vloeibare handler werktafel, Zie Figuur 4C. Overige kolommen coderen volumes voor verschillende oplossingen ("Sln-01" tot "Sln-15") om te worden afgepipetteerde. De cumulatieve omvang van één rij komt overeen met het volume van de definitieve teelt van de desbetreffende goed. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig3.jpg"> 
Figuur 3 : Screenshot van de vloeistof behandeling controlesoftware "WinPREP". Links: Rij-besteld opdrachten, met inbegrip van een opdracht voor bestandsoverdracht voor elke stamoplossing te worden afgepipetteerde. Voordat de definitieve opdracht voor toevoeging van het entmateriaal, wordt een gebruiker prompt ingevoegd om ervoor te zorgen dat de cultuur van het zaad wordt geplaatst aan de tafel net op tijd. Rechts: Schema van de werktafel, met inbegrip van de bron labware voor variatie voorraden (twee diep goed platen met 12 kolom-achtige wells), de trog reagens voor Rest voorraad, water en entmateriaal en de media voorbereiding doel teelt MTP. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig4.jpg"> 
Figuur 4 : Compilatie van gedetailleerde screenshots voor installatie van pipetteren van een stamoplossing. (A) pakte opdracht voor pipetteren van Fe voorraad. Bron labware en bron goed worden binnen gemarkeerd op de werktafel door het Lees frame en de rode kolom van de overeenkomstige diep goed plaat. Bestemming labware en bestemming wells binnen zijn gekenmerkt door het blauwe kader rond en blauwe putjes van de target teelt MTP. (B) gedetailleerd voorbeeld zicht op toewijzing van pipetting volumes voor deze stap (Fe stockoplossing). Aantal bestemmingen wordt afgelezen uit de pipetting lijst, die bestaat uit 48 rijen. Het Doseer volumes voor alle putjes van de bestemming voor Fe stockoplossing wordt gevonden in kolom 4 in de pipetting lijst. Merk op dat de eerste kolom in de pipetting lijst bevat id's en niet de volumes kunnen worden overgedragen, Zie Figuur 2. (C) gegevens over de bestemming goed nummering. Volumes die zijn geschreven in de rij #1 van de bijbehorende pipetting lijst zal worden pipetted in goed gemarkeerd als #1, enzovoort. Wells #01, 08 #, #41 en #48 overeen met putjes A01, A08, F01 en F08 voor de alpha-numerieke codering, die ook in de teelt MTP zelf is afgedrukt. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig5.jpg"> 
Figuur 5 : Gedetailleerde resultaten vanaf de eerste iteratie. (A) Kriging interpolatie gebaseerd op experimentele gegevens van iteratie 1. Rode stippen geven de gegevensset. Ter vergelijking, alle drie interpolatie oppervlakken zijn overlay in één perceel (donkerblauw: 0 x Ref, geruit: 1 x Ref, lichtblauw: 2 x Ref). Een alternatieve weergave van de resultaten kan worden gevonden elders15. (B) Kriging interpolatie op basis van de experimenten uitgevoerd in herhaling 1 (rode stippen) en iteratie 2 (gele pleinen).Delen van de gegevens in dit cijfer zijn eerder gepubliceerde15. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig6.jpg"> 
Figuur 6 : Afbeelding van iteratief verzamelde optimalisatie resultaten. (A) definitieve Kriging model voorspelling. (B) statistische identificatie van optimale ruimte (rood) op basis van de statistische z-test, die wordt verstrekt door KriKit. Vakken geven aan opeenvolgende stappen van iteratieve ontwerp en uitvoering van experimenten. Delen van de gegevens in dit cijfer zijn eerder gepubliceerde15. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Component</td>
			<td>Gemiddelde waarde van de genormaliseerde coëfficiënt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe2 +</td>
			<td>-0.08</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MN2 +</td>
			<td>-0.05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn2 +</td>
			<td>-0.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu2 +</td>
			<td>-0.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4+</td>
			<td>-2.04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni2 +</td>
			<td>-0.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 +</td>
			<td>-0.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoO42-</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BO33-</td>
			<td>0,06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CA2 +</td>
			<td>1,00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2 +</td>
			<td>0,45</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabel 1: resultaten van de gevoeligheidsanalyse. Coëfficiënt waarden dat het gemiddelde effect aangeeft wanneer verhoogt de concentratie van de respectieve media-component van de waarde van het centrum op de maximale waarde. Voor optimale experimentele designs, zoals gevonden in de standaard literatuur en gebruikt hier de standaarddeviatie geeft direct de experimentele variatie toe te schrijven aan de replicatie van het referentie-experiment. Coëfficiënt waarden zijn genormaliseerd door de maximale waarde (0.0422 voor component Ca2 +). De standaarddeviatie van de genormaliseerde en absolute coëfficiënt is 0.54 en 0.0226, respectievelijk.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Component</td>
			<td>Gemiddelde waarde van de genormaliseerde coëfficiënt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe2 +</td>
			<td>-1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MN2 +</td>
			<td>1,00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn2 +</td>
			<td>-3.48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu2 +</td>
			<td>-0.52</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4+</td>
			<td>-15.95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni2 +</td>
			<td>0.69</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 +</td>
			<td>-0.51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoO42-</td>
			<td>-0.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BO33-</td>
			<td>-1.11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabel 2: resultaten van de definitieve gevoeligheidsanalyse. Coëfficiënt waarden dat het gemiddelde effect aangeeft wanneer verhoogt de concentratie van de respectieve media-component van de waarde van het centrum op de maximale waarde. Zoals een optimale proefopzet werd gebruikt, hangt de standaarddeviatie alleen de experimentele variatie met behulp van de geoptimaliseerde middellange samenstelling. Experimentele variatie licht gestegen in vergelijking met de variatie met behulp van het referentie-medium. Coëfficiënt waarden zijn genormaliseerd door de maximale waarde (0.0106 voor component Mn2 +). De standaarddeviatie van de genormaliseerde en absolute coëfficiënt is 3,63 en 0.0385, respectievelijk.

Dit manuscript beschrijft een algemene aanpak voor op maat gemaakte ontwerp van microbiële teelt media. Deze optie is ingeschakeld door een iteratieve werkstroom combineren Kriging gebaseerde experimentele design en microbioreactor technologie voor voldoende teelt doorvoer, die wordt ondersteund door lab robotica om betrouwbaarheid en snelheid in vloeistof behandeling van media voorbereiding.

Generic-Protocol voor optimalisatie van heterologe eiwitproductie met behulp van geautomatiseerde Microbioreactor technologie

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Het algemene doel van deze iteratieve workflow die Kringing-gebaseerd experimenteel ontwerp combineert met microbioreactortechnologie voor voldoende cultivatie-doorvoer is om een generieke benadering te beschrijven voor het op maat maken van cultivatiemedia voor microben. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van ontwikkeling van microbiële bioprocessen, zoals de optimalisatie van cultivatiemedia, bioprocescondities en fenotypering van stammen. We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we ons afvroegen of cultivatiemedia geoptimaliseerd voor kleine metabolietenproductie ook het meest geschikt zijn voor heterologe eiwitproductie.Het grote voordeel van deze techniek is dat het de algehele ontwikkelingstijd versnelt door een slimme combinatie van experiment en modellering. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Roman Jansen, een promovendus uit mijn laboratorium. Begin deze procedure met studieconceptie en definitie van methoden zoals gedetailleerd in het tekstprotocol.Steriliseer diepwelplaten voor de opslag van stockoplossingen op een werktafel door de platen af te vegen met 70 procent ethanol en ze vervolgens te drogen in een laminaire stroomkast. Start de kiemcultuur door 50 milliliter BHI-medium met 25 milligram per liter kanamycine te inoculeren met één aliquot uit de werkcelbank. Plaats alle benodigde laboratoriummaterialen op de robotwerktafel en giet de stockoplossingen in de bijbehorende laboratoriummaterialen.Start vervolgens de robotwerkstroom voor mediavoorbereiding, zodat de laatste stap, dat wil zeggen de inoculatie, op tijd wordt bereikt voor het begin van de kiemcultuur. Bemonster de kiemcultuur na ongeveer twee uur om de groei te bewaken door de optische dichtheid te meten bij 600 nanometer of O-D-600. Blijf de groei elke uur controleren.Na ongeveer vijf uur bereikt de cultuur een O-D-600 tussen drie en vier en wordt gebruikt om de hoofdculturen te inoculeren. Plaats de kiemcultuur op de werktafel van de vloeistofhandler en vervolg het mediavoorbereidingsprotocol. Verzegel de cultivatiemicrotiterplaten na inoculatie.Plaats vervolgens de verzegeld cultivatie-MTP in het Biolector-apparaat. Start vervolgens het voorgedefinieerde cultivatieprotocol. Gooi de resterende stockoplossingen weg volgens de bioveiligheidsvoorschriften, indien nodig.Zaai vervolgens de cultuur vanaf de robotwerktafel. Reinig de herbruikbare laboratoriummaterialen voordat u begint met het protocol voor decontaminatie van de vloeistofhandler. Stop de hoofdcultuur na een looptijd van 17 uur en verwerk de gegevens zoals beschreven in het tekstprotocol.Om de G-F-P-titer te kwantificeren, brengt u eerst de celsuspensies uit alle cultivatieputjes over in vooraf gelabelde reactiebuisjes. Centrifugeer vervolgens de celsuspensies gedurende 10 minuten op maximale snelheid met behulp van een tafelcentrifuge om het celvrije supernatant te verkrijgen. Breng vervolgens 200 microliter van elk celvrij supernatant over in een zwarte 96-wells MTP met een transparante bodem.Lees de G-F-P-specifieke fluorescentie bij 488 nanometer voor excitatie en 520 nanometer voor emissiegolflengte met behulp van een geschikte microplaatlezer. Na het meten van de G-F-P-fluorescentie kan de microplaat direct worden gebruikt voor bepaling van het eiwitgehalte van de celvrije supernatanten met standaardprotocollen zoals een Bradford- of B-C-A-test. Ga vervolgens verder met gegevensanalyse zoals beschreven in het tekstprotocol.De gedemonstreerde procedure bestaat uit één ronde van experimenten, de resultaten worden gebruikt voor het ontwerpen van verdere rondes met maximale verwachte verbetering van het G-F-P-signaal. Referentie-experimenten worden in elke ronde geplaatst voor het analyseren van gegevensvariabiliteit en het detecteren van experimentele uitbijters. Deze contourplot geeft een overzicht van de optimalisatieprocedure.De analyse van de verzamelde gegevensset na iteratie drie onthulde een beperking van het positieve effect van magnesium en identificeerde een optimale concentratiebereik. Daarom werd besloten in iteratie vier de concentratiereeks alleen voor calcium verder uit te breiden. De procedure werd twee keer herhaald in iteratie vijf en zes totdat een verzadiging van het G-F-P-signaal werd gevonden.Deze verzadiging wordt verklaard door precipitatie van calciumzout voor de toegepaste concentraties van calcium, die niet beschikbaar zijn voor de cel. De zevende iteratie werd gebruikt om de grenzen in meer detail te verkennen. De optimale concentratiebereiken van mediacomponenten voor het verzadigde G-F-P-signaal kunnen betrouwbaar worden geïdentificeerd met een statistische Z-test.Het toont het geïdentificeerde plateau zoals bepaald en gevisualiseerd met behulp van de Kringing kit tool box. De Kringing kit toolbox is gratis beschikbaar en wordt geleverd met een gedetailleerde tutorial die uitlegt hoe u de functies kunt gebruiken. De generieke aard van het gepresenteerde protocol maakt verschillende aanpassingen mogelijk, zoals het bestuderen van andere microbiële expressiehosts of het optimaliseren van andere eigenschappen van het doeleiwit, zoals glycosyleringspatroon of disulfidebindingen.De integratie van een embryosysteem verhoogt de experimentele doorvoer, wat grote tijdsbesparingen mogelijk maakt. Bij het vervangen van volledig controleerbare en beïnvloede bioreactoren door amniar-systemen, moet de schaalbaarheid van resultaten worden overwogen. Wiskundig modelleren en ontwerp van experimenten helpen om de informatie-inhoud van meetgegevens te maximaliseren met betrekking tot het onderzochte doel.

generic-protocol-for-optimization-heterologous-protein-production

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

We beschrijven een werkwijze voor de affiniteit-gemerkte zuivering van recombinante eiwitten met vloeistof handling robotica. Deze methode is algemeen toepasbaar op de kleinschalige zuivering van oplosbare His-gemerkte eiwitten in een high-throughput format.

High-throughput Zuivering van Affinity gemerkte recombinante eiwitten

Source: Hemmerich, J., et al. Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the use of an automated microbioreactor to monitor bacterial growth and fluorescent protein secretion in response to varying media formulations. A genetically modified bacterium expressing a secretory fluorescent protein is cultured under antibiotic selection and inoculated into nutrient-varied wells. Real-time optical...

Monitoring Bacterial Growth in Distinct Media Formulations with an Automated Microbioreactor

Deze vijfdaagse protocol beschrijft alle stappen, apparatuur en aanvullende software voor het maken en uitvoeren van een efficiënte endogene Escherichia coli op basis TX-TL-cel-vrije expressie systeem vanaf nul. Met reagentia, het protocol duurt 8 uur of minder voor het inrichten van een reactie, verzamelen en verwerken van gegevens.

Protocollen voor implementatie van een Escherichia coli Op basis TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

We ontwierpen een continu kweken inrichting voor gebruik met systemen optogenetic aan kweken van microben en regelmatig afbeeldingscellen branden in het effluent met een omgekeerde microscoop. Het kweken, sampling, beeldvorming en beeldanalyse zijn volledig geautomatiseerd, zodat dynamische reacties op de verlichting kan worden gemeten over meerdere dagen.

Ontwerp en implementatie van een Automated Verlichten, kweken, en Sampling System voor Microbiële optogenetische Applications

Een gedetailleerd protocol voor de gelijktijdige werking van 48 parallelle celculturen onder uiteenlopende omstandigheden in een systeem van microbioreactor wordt gepresenteerd. Proces van de cultuur van de cel, oogst en latere antilichaam titer analyse worden beschreven.

Gebruik van High-Throughput geautomatiseerd Microbioreactor-systeem voor de productie van Model IgG1 in CHO cellen

Dit protocol detailleert de stappen, kosten, en apparatuur die nodig is voor het genereren van E. coli-op basis van cel extracten en uit te voeren in vitro eiwit synthese reacties binnen 4 dagen of minder. Om de invloed van de flexibele aard van dit platform voor brede toepassingen, bespreken we reactie voorwaarden die kunnen worden aangepast en geoptimaliseerd.

Escherichia coli-cel-Free eiwitsynthese gebaseerd: protocollen voor een robuuste, flexibele en toegankelijk platformtechnologie

Hier presenteren we een gedetailleerde procedure om een ontwerp van experiment uit te voeren in een geautomatiseerde micro-bioreactor gevolgd door celoogst en eiwitkwantificering met behulp van een Protein A-kolom.

Proces optimalisatie met behulp van high throughput geautomatiseerde micro-bioreactoren in de Chinese Hamster Eierstok celteelt

Optogenetische controle van microbieel metabolisme biedt flexibele dynamische controle over fermentatieprocessen. Het protocol hier laat zien hoe blauw licht-gereguleerde fermentaties voor chemische en eiwitproductie op verschillende volumetrische schalen kunnen worden opgezet.

Lichtgestuurde fermentaties voor microbiële chemische en eiwitproductie

Dit protocol biedt een methode voor de systematische wereldwijde optimalisatie van genetisch gecodeerde biosensoren door middel van geautomatiseerde generatie en beoordeling van genetische bibliotheken. Dit gaat gepaard met ontwerp-van-experimentmethodologieën om experimenten te stroomlijnen en de selectie van genetische componenten mogelijk te maken om biosensoren af te stemmen op specifieke ontwerpresultaten.

Efficiënte bemonstering van genetisch gecodeerde biosensorontwerpruimte mogelijk gemaakt met een ontwerp- en automatiseringsworkflow

Dit protocol biedt een standaard high-throughput screeningworkflow voor industriële micro-organismen. Het omvat het construeren van een mutantenbibliotheek via ARTP-mutagenese, het uitvoeren van positieve druppelscreening met geautomatiseerde microfluidica en vervolgens het verifiëren van de resultaten. De betrouwbaarheid van de workflow werd gevalideerd door het screenen van krachtige B. coagulans-stammen .

Hoogdoorvoerscreening van L-melkzuur-hyperproducerende bacilluscoagulansmutanten met behulp van een geautomatiseerd druppel-microflufluïdisch platform

Ontdek een iteratieve workflow met Kriging-gebaseerd experimenteel ontwerp en microbioreactortechnologie voor het optimaliseren van microbiele kweekmedia. Deze methode versnelt de ontwikkeling van heterologe eiwitproductie door slimme combinatie van experiment en modellering.

Generic-Protocol voor optimalisatie van heterologe eiwitproductie met behulp van geautomatiseerde Microbioreactor technologie

Meer video's verkennen