Bereiding van de monsters voor de analyse van de Endopeptidomic van menselijke cerebrospinale vloeistof
4 december 2017
Een methode voor massaspectrometrische analyse van endogene peptiden in menselijke cerebrospinale vloeistof (CSF) wordt gepresenteerd. Door molecuulgewicht cut-off filtratie, chromatografische pre fractionering, massaspectrometrische analyse en een daaropvolgende combinatie van peptide identificatie strategieën, bleek het mogelijk om uit te breiden van de bekende CSF peptidome bijna tien keer in vergelijking naar eerdere studies.
Het doel van dit protocol is om menselijke cerebrospinale vloeistofmonsters voor te bereiden en te analyseren voor LC-MS-analyse van endogene peptiden.Een peptide pre-fractioneringsstap voorafgaand aan LC-MS verhoogt het aantal geïdentificeerde peptiden en maakt detectie van relatief lage abundantie CSF-peptiden mogelijk.Endogene peptiden in CSF zijn calciummoleculen die niet uitgebreid zijn onderzocht en mogelijk belangrijke nieuwe biomarkers van neurodegeneratieve aandoeningen kunnen omvatten.Deze methode maakt een uitgebreide karakterisering van het CSF-peptidome door massaspectrometrie mogelijk.De belangrijkste voordelen van deze methode zijn dat het injectie van laag abundantie CSF-peptiden mogelijk maakt en compatibel is met multiplex isobarische labeltechnieken, waardoor het toepasbaar is voor klinische studies.Tot nu toe hebben we deze methode voornamelijk toegepast op de analyse van cerebrospinale vloeistof.Maar we hebben voorlopige gegevens die aangeven dat met kleine wijzigingen, het ook kan worden gebruikt voor de analyse van plasma- en weefselmonsters.Begin door 1,5 milliliter aliquots van CSF op kamertemperatuur op een rolmixer te ontdooien.Zodra ontdooid, breng de inhoud over naar 10 milliliter polypropyleen buisjes.En voeg 80 microliter van één molaire TAB toe als buffermiddel.Voeg vervolgens 0,65 milliliter van een acht molaire guanidiniumhydrochloride toe om eiwitaggregaten op te lossen en voorzichtig te vortexen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.Vervolgens 60 microliters van 200 millimolair waterig TCEP toevoegen en incuberen bij 55
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor massaspectrometrische analyse van endogene peptiden in menselijk cerebrospinaal vloeistof (CSF). Door gebruik te maken van moleculaire gewichtsafsnijdende filtratie, chromatografische pre-fractionering en massaspectrometrische analyse, breidt dit onderzoek het bekende CSF-peptidoom aanzienlijk uit, waardoor de identificatie van peptiden met een lage abundantie die kunnen dienen als biomarkers voor neurodegeneratieve aandoeningen wordt verbeterd.
Belangrijke onderdelen van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Massaspectrometrie
- Ontdekking van biomarkers
Achtergrond
- Endogene peptiden in CSF zijn potentieel significant bij het identificeren van neurodegeneratieve aandoeningen.
- CSF-peptiden met een lage abundantie zijn nog niet uitgebreid bestudeerd.
- Bestaande methoden hebben beperkte gegevens opgeleverd over het CSF-peptidoom.
Doel van de studie
- Om de identificatie en karakterisering van endogene peptiden in menselijk CSF te verbeteren.
- Om een uitgebreider beeld van het CSF-peptidoom te verschaffen.
- Om de potentie voor nieuwe biomarkers bij neurodegeneratieve aandoeningen te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Massaspectrometrie met voorafgaande fractionering van CSF-monsters.
- Omvat het ontdooien en verwerken van aliquots van 1,5 milliliter CSF met specifieke reagentia.
- Compatibel met multiplex isobare labelingstechnieken.
- Kan met kleine aanpassingen worden aangepast voor de analyse van plasma- en weefselmonsters.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt de detectie van een significant groter aantal peptiden mogelijk in vergelijking met eerdere studies.
- Belangrijke bevindingen wijzen op de aanwezigheid van voorheen onverkende peptiden met een lage abundantie.
- Biedt inzichten die kunnen leiden tot de ontdekking van nieuwe biomarkers.
Conclusies
- Deze studie demonstreert een efficiënte aanpak voor het karakteriseren van het CSF-peptidoom.
- De veelzijdigheid van de methode opent mogelijkheden voor klinische studies naar neurodegeneratieve aandoeningen.
- Potentiële implicaties voor het begrijpen van neuronale mechanismen en het identificeren van ziektemarkers.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directieleden
Deze methode verbetert de detectie van endogene peptiden met een lage abundantie in menselijk hersenvocht, een cruciaal biofluïdum voor de ontdekking van biomarkers voor neurodegeneratieve ziekten. Door de proteïnecomplexiteit te verminderen via MWCO-fractionering en de peptidedekking te verbeteren via hoge-pH RP-HPLC pre-fractionering, wordt de analytische gevoeligheid voor targetvalidatie verhoogd. Deze benadering ondersteunt mechanistische risicoreductie door een diepere profilering van het peptidoom mogelijk te maken, wat kan bijdragen aan de betrouwbaarheid van targets in een vroeg stadium en de selectie van predictieve biomarkers in drug discovery-programma's voor het centrale zenuwstelsel.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk van endogene peptidepopulaties die pathofysiologische processen in het CZS weerspiegelen, wat het testen van target-hypotheses ondersteunt.
- Operationele waarde: Vermindert interferentie van het dynamische bereik door overvloedige CSF-eiwitten, waardoor de detectie van laag-concentratie signaleringspeptiden die relevant zijn voor pathway-modulatie wordt verbeterd.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert reproduceerbare peptide-fractioneringspatronen die consistente LC-MS/MS-uitlezingen mogelijk maken voor assay-standaardisatie.
- Operationele waarde: Compatibel met multiplex isobare labeling, wat vergelijkende peptidoomanalyse mogelijk maakt tussen ziekte- en controlegroepen in workflows voor biomarker-screening.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert de ontdekking van biomarkers door het identificeren van peptiden afkomstig uit CSF die kunnen correleren met mechanismen van neurodegeneratieve ziekten.
- Operationele waarde: Aanpasbaar aan plasma- en weefselmonsters met minimale wijzigingen, wat cross-sample validatie in translationele pipelines ondersteunt.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het continuüm van de vroege ontdekking en ondersteunt hypothese-gestuurde exploratie van het peptidoom voorafgaande aan de fasen van lead-identificatie en preklinische validatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt onbevooroordeelde profilering van endogene peptiden om ziekte-geassocieerde pathways te verduidelijken en het risico bij de selectie van targets te verkleinen.
- Screening: Maakt peptide-detectie met een hoge betrouwbaarheid mogelijk door een verminderde monstercomplexiteit en een verbeterde chromatografische scheiding.
- Analytics: Genereert kwantitatieve, fractie-opgeloste peptidedata die compatibel zijn met label-gebaseerde multiplexing voor vergelijkende studies.
- Translational Research: Biedt een basis voor de afstemming van biomarkers door veranderingen in het CSF-peptidoom te koppelen aan neurodegeneratieve processen.
- Enterprise Reuse: De kernworkflow — MWCO-filtratie, hoge-pH fractionering en LC-MS — kan in verschillende laboratoria worden gestandaardiseerd voor reproduceerbare peptidoomanalyse.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de opbrengst van peptide-identificatie en maakt detectie mogelijk van soorten met een lage abundantie die kunnen dienen als indicatoren voor mechanismen of ziektestadia.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde pre-fractionering en vermindert technische variabiliteit bij de analyse van complexe biofluïda.
- Strategische waarde: Verhoogt het vertrouwen in besluitvorming bij target-validatie door de observeerbare biologische ruimte in CSF te vergroten.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van biomarkers door een bredere peptidoomdekking en verbeterde signaaldetectie.
Overwegingen voor de implementatie
- Expertise in de verwerking van CSF, protease-inhibitie en massaspectrometrie-gebaseerde peptidomics is vereist.
- De instrumentatie moet LC-MS/MS-systemen omvatten die compatibel zijn met high-pH fractionering en gevoelige peptide-detectie.
- Standaardisatie tussen locaties vereist een consistente selectie van MWCO-filters, concatenatie van fractionering en softwarematige identificatieparameters.
- Aanpassing aan plasma of weefsel vereist optimalisatie van de lysis-, depletie- en fractioneringscondities om rekening te houden met de verschillende matrixcomplexiteit.
- Praktische beperkingen omvatten potentieel peptideverlies tijdens filtratie en de noodzaak van zorgvuldige contaminatiecontrole vanwege de analyse van targets met een lage abundantie.
Veelgestelde vragen over biofarmacie
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
Pre-treatment of Bulk Volume CSF without Quantification
2:24
Pre-treatment of Small Volume CSF Samples with Isobaric Labeling
4:00
MWCO Filtration, Desalting, and Sample Clean-up by Solid Phase Extraction
6:00
Offline High-pH Reverse Phase HPLC Sample Fractionation
7:09
LC-MS Analysis
7:47
Results: Peptide Identification After LC-MS Analysis
9:13
Conclusion
