Regeneratie van gekleed gouden Microelectrodes uitgerust voor een Real-Time cel Analyzer

Het algemene doel van deze procedure is het regenereren van commerciële elektronische platen die zijn uitgerust voor een Real-Time Cell Analyzer, of RTCA. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van de regeneratie van wegwerpbare chips op basis van goud, inclusief de regeneratie van elektronische platen die in RTCA worden gebruikt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de regeneratieprocedure kan worden uitgevoerd met milde en gemakkelijk verkrijgbare laboratoriumreagentia met een lage toxiciteit.

Het idee voor deze methode ontstond toen we begonnen met het gebruik van de Real-Time Cell Analyzer, waarbij goudgebaseerde chips worden gebruikt. Begin deze procedure met de incubatie en proliferatie van A549-cellen in een kweekschaal zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg 150 µL celmedium toe aan elke incubatieput van de elektronische plaat L8. Laat de plaat 30 minuten in de bio-safety cabinet staan voor equilibratie.

Plaats na 30 minuten handmatig de elektronische plaat L8 in de Real-Time Cell Analyzer in de CO2-incubator bij 37 °C. Start vervolgens het bedieningsprogramma van de Real-Time Cell Analyzer op de computer. Selecteer op de standaard pagina voor de instellingen van het experimentpatroon Experiment Model en geef de lopende assay een naam.

Select op de lay-outpagina de overeenkomstige wells die in het experiment zijn opgenomen en voer informatie zoals celtype, aantal en drugnamen in de bewerkingsvakken in. Voeg op de planningpagina de experimentele stappen toe, selecteer vervolgens de looptijd van elke stap en het interval voor de realtime gegevensacquisitie. Klik op start om de achtergrondimpedantie van het medium te meten.

Het experimentbestand wordt opgeslagen. De resulterende gegevens worden automatisch afgetrokken. Voeg op de plotpagina putjes toe, waarna de grafiek van de tijd-celindex wordt weergegeven.

Klik voor het celproliferatie-experiment eerst op de pauzeknop om het programma te pauzeren. Haal vervolgens de elektronische plaat eruit en voeg bij kamertemperatuur 100 microliters A549-cel-suspensiebuffer per well toe. Laat de plaat 30 minuten in de biologische veiligheidskast staan zodat de cellen naar de bodem van de incubatiewells kunnen zakken.

Plaats de elektronische plaat handmatig in het realtime celanalyse-station. Klik vervolgens op de startknop om het experiment voort te zetten. Op de plotpagina registreert de analyzer gedurende het hele experiment continu de celindexwaarden, of curven.

Wanneer het experiment is voltooid, gaat u naar de plotpagina en opent u het experimentbestand. Selecteer vervolgens alle geteste incubatieweltjes en de resulterende celindexcurves die voor de laatste keer kunnen worden gemiddeld of genormaliseerd vóór de toevoeging van farmaceutische geneesmiddelen of het vervangen van het medium om variaties tussen assays te verminderen. Op de pagina voor data-analyse kunnen de EC50 of IC50 worden berekend.

Nadat de cytotoxiciteitsevaluatie van het antikankermiddel is uitgevoerd zoals beschreven in het tekstprotocol, haalt u de elektronische plaat met cellen uit het Real-Time Cell Analyzer-station. Plaats de gebruikte elektronische plaat in een steriele biologische veiligheidskast bij kamertemperatuur en meng het cultuurmedium grondig met een pipet. Gebruik vervolgens een pipet om het gehele medium af te zuigen.

Spoel de elektronische platen drie keer af met 200 µL gedeïoniseerd water bij kamertemperatuur. Verteer de resterende cellen op de elektronische platen met vers bereide 0,25% trypsine gedurende één tot twee uur in een incubator bij 37 °C. Wanneer de digestie is voltooid, mengt u de incubatieoplossing vijf tot 10 keer met een pipet in een biologische veiligheidskast bij kamertemperatuur en verwijdert u vervolgens de oplossing.

Spoel de elektronische plaques twee keer af met 200 µL gedeïoniseerd water. Was daarna twee keer met 200 µL 100% ethanol, gevolgd door twee keer hetzelfde volume 75% ethanol. Spoel tot slot nog twee keer af met 200 µL gedeïoniseerd water.

Keer de elektronische plaat om op een steriel gaasje of vloeipapier om het resterende water bij kamertemperatuur af te gieten. Voer vervolgens ultraviolette sterilisatie uit op de geregenereerde elektronische plaat gedurende één tot twee uur in de biologische veiligheidskast bij kamertemperatuur. Nadat de platen zijn gebruikt voor geneesmiddelentoediening met gebruik van mesoporeus materiaal zoals beschreven in het tekstprotocol, worden de resterende cellen zoals voorheen gedigesteerd met trypsine.

Omdat de pipet regelmatig in de experimenten wordt gebruikt, dient de gebruiker erop te letten dat de tip en het oppervlak van de microchips niet worden bekrast. Spoel de microchips eenmaal met 200 microliters gedeïoniseerd water in de veiligheidskast bij kamertemperatuur. Spoel de microchips vervolgens twee keer met 200 microliters absolute ethanol bij kamertemperatuur.

Spoel de microchips vervolgens eenmaal met 200 µL 75% ethanol bij kamertemperatuur. Voeg 250 µL 75% ethanol toe aan elke put en sluit de elektronische plaat af met de afdichtfilm bij kamertemperatuur. Centrifugeer de elektronische plaat gedurende twee minuten bij 114 ×g en leeg daarna de plaat.

Keer de elektronische plaat om op een steriel gaasje of vloeipapier om de resterende vloeistof bij kamertemperatuur af te gieten. Herhaal de spoelingen met 75% ethanol, gevolgd door het centrifugeren. Voer vervolgens ultraviolette sterilisatie uit op de geregenereerde elektronische plaat gedurende één tot twee uur in de veiligheidskast bij kamertemperatuur.

Beoordeel de optische kenmerken van het geregenereerde oppervlak van de elektronische plaat door eerst het onderste deel van de incubatieput te demonteren, zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de levensvatbaarheid van gehechte cellen na de opname van anticancer-medicatie op de nieuwe en geregenereerde elektronische platen te evalueren, wordt een confocale laser-scanning microscoop gebruikt om de spontane fluorescentie van DOX-moleculen die door A549-cellen zijn geabsorbeerd te monitoren. Om de spontane fluorescentie van de door de cellen geabsorbeerde DOX vast te leggen, wordt een 63-voudige olie-objectief en 485 nanometers als excitatiegolflengte gebruikt.

Beoordeel vervolgens het elektrochemische gedrag van de geregenereerde elektroden door eerst de goudelektrode en de glaskoolstofelektrode tot een spiegelglad oppervlak te polijsten met een illuminoslurry op een polijstdoek. Soniceren de elektroden daarna in water om eventuele deeltjes te verwijderen. Activeer vervolgens de goudelektrode in 0,5-molaire zwavelzuur.

Verkrijg gegevens van de elektrochemische impedantiespectroscopie, of EIS-gegevens, van de onbehandelde goudelektrode en de glaskoolstofelektrode in een 10-millimol kaliumchloride-elektrolytoplossing, bevatten één millimol kaliumferricyanide. Breng vervolgens 10 µL van een celsuspensie aan op het oppervlak van de goudelektrode in de GCE. Na het toevoegen van de cellen wordt de goudelektrode in de GCE gedurende drie uur geïncubeerd in een incubator bij 37 °C, alvorens de EIS-gegevens van de met cellen gemodificeerde elektroden te verkrijgen, zoals beschreven in het tekstprotocol.

Om de elektroden te regenereren, wordt de gouden elektrode samen met de met cellen gemodificeerde GCE 0,5 tot twee uur lang ondergedompeld in 0,25%trypsine. Spoel beide elektroden vier keer voorzichtig af met water. Spoel de elektroden vervolgens vier keer voorzichtig af met absolute ethanol.

Dompel vervolgens de gouden elektrode in de GCE gedurende ongeveer vijf minuten onder in 75% ethanol. Spoel de chip na vijf minuten vier keer voorzichtig af met 75% ethanol voordat de EIS-gegevens van de geregenereerde elektroden worden verzameld, zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de regeneratie-efficiëntie van de gelaagde gouden elektronische plaat te evalueren, zijn microscopische waarnemingen verricht voor zowel verse als behandelde elektronische platen.

Er werd geen virtueel verschil gevonden in de optische eigenschappen van het microchipoppervlak. De fluorescentie van doxorubicine-moleculen wordt gebruikt om de celstatus op de gouden microchips voor en na regeneratie te beoordelen. De vergelijkbare homogeniteit en goed gedefinieerde cellulaire morfologie toonden de herbruikbaarheid van de chips aan.

Het regeneratieprotocol wordt toegepast voor de feitelijke test van celproliferatie. De groeicurves verkregen uit meerdere incubatieputjes van een geteste elektronische plaat vertonen een goede consistentie, wat wijst op de succesvolle regeneratie van de commerciële chip. Hier is de geregenereerde elektronische plaat L8 getest voor cytotoxiciteitsevaluatie met behulp van mesoporeuze silicamaterialen.

De celindex van het met mesoporeuze materialen behandelde monster nam af in vergelijking met de controle, wat duidt op een lichte cytotoxiciteit van de materialen. Verdere inkapseling en afgifte van het antikankermiddel doxorubicine door mesoporeuze materialen veroorzaakte een drastische afname in de groeicurve van A549-cellen. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in vier uur worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de digestietijd van de type sink per chip kan verschillen. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals confocale laser-scanning microscopie of zelfs spectroscopie en elektrochemische impedantiespectroscopie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de beoordeling van het regeneratie-effect.