Regeneratie van gekleed gouden Microelectrodes uitgerust voor een Real-Time cel Analyzer
12 maart 2018
Dit protocol beschrijft een algemene strategie om te regenereren commerciële gekleed gouden microelectrodes uitgerust voor een label-vrije cel analyzer besparing op de hoge lopende kosten ofmicrochip gebaseerde tests gericht. Het regeneratieproces omvat de spijsvertering van de trypsine, spoelen met ethanol en water, en een stap van spinnen, waardoor herhaalde gebruik van microchips.
Het algemene doel van deze procedure is om commerciële elektronische platen uitgerust voor een Real-Time Cell Analyzer, of RTCA, te regenereren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in de regeneratie van wegwerpbare goudgebaseerde chips, inclusief de regeneratie van elektronische plannen die worden gebruikt in RTCA. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de regeneratieprocedure kan worden uitgevoerd met behulp van milde en gemakkelijk verkrijgbare laboratoriumreagentia met lage toxiciteit.
We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we begonnen met het gebruik van de Real-Time Cell Analyzer, waarbij goudgebaseerde chips duur zijn. Begin deze procedure met incubatie en proliferatie van A549-cellen in een celcultuurbakje zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg 150 microliters celmedium toe aan elke incubatieput van de elektronische plaat L8. Laat de plaat 30 minuten in de bio-veiligheidskast om te gelijkwaardig te worden.
Na 30 minuten brengt u de elektronische plaat L8 handmatig in de Real-Time Cell Analyzer in de CO2-incubator bij 37 graden Celsius. Start vervolgens het Real-Time Cell Analyzer-operatieprogramma op de computer. Op de standaardexperimentopzetpagina, selecteer Experiment Model en geef de lopende test een naam.
Op de lay-outpagina, selecteert u de corresponderende putten die in het experiment zijn opgenomen en voert u de informatie zoals celtype, aantal en drugsnamen in de bewerkingsvakken in. Op de planningspagina voegt u de experimentele stappen toe en selecteert u vervolgens de looptijd van elke stap en het interval van realtime data-acquisitie. Klik op starten om de achtergrondimpedantie van de media te meten.
Het experimentbestand wordt opgeslagen. De resulterende gegevens worden automatisch afgetrokken. Op de plotpagina, voegt u putten toe en wordt de grafiek van tijd-celindex getoond.
Voor het celproliferatie-experiment, klikt u eerst op de pauzeknop om het programma te onderbreken. Neem vervolgens de elektronische plaat uit de test en voeg 100 microliters A549 celsuspensiebuffer per put toe bij kamertemperatuur. Laat de plaat 30 minuten in de bio-veiligheidskast om de cellen op de bodem van de incubatieputten te laten bezinken.
Breng de elektronische plaat handmatig in de realtime cel-analyzer-station in. Klik vervolgens op de startknop om het experiment voort te zetten. Op de plotpagina, registreert de analyzer continu celindexwaarden, of curven, gedurende het experiment.
Wanneer het experiment voltooid is, gaat u naar de plotpagina en opent u het experimentbestand. Selecteer vervolgens alle geteste incubatieputten en de resulterende celindexcurven die gemiddeld of genormaliseerd kunnen worden voor de laatste keer voordat farmaceutische geneesmiddelen worden toegevoegd of het medium wordt vervangen om variaties tussen tests te verminderen. Op de gegevensanalysepagina kunnen EC50 of IC50 worden berekend.
Na het uitvoeren van de cytotoxiciteitsevaluatie van het antikankergeneesmiddel zoals beschreven in het tekstprotocol, haalt u de elektronische plaat met cellen uit de Real-Time Cell Analyzer-station. Plaats de gebruikte elektronische plaat in een steriele bio-veiligheidskast bij kamertemperatuur en meng het kweekmedium grondig met behulp van een pipet. Gebruik vervolgens een pipet om het hele medium af te zuigen.
Spuit de elektronische platen drie keer met 200 microliters gedeïoniseerd water bij kamertemperatuur. Verwerk de resterende cellen op de elektronische platen met 0,25% vers bereide trypsine gedurende één tot twee uur in een incubator bij 37 graden Celsius. Wanneer de vertering voltooid is, werkt u in de bio-veiligheidskast bij kamertemperatuur om de incubatieoplossing vijf tot tien keer met een pipet te mengen en vervolgens de oplossing te verwijderen.
Spuit de elektronische platen twee keer met 200 microliters gedeïoniseerd water. Was vervolgens met 200 microliters 100%ethanol twee keer, gevolgd door dezelfde hoeveelheid 75%ethanol twee keer. Spoel ten slotte met nog eens 200 microliters gedeïoniseerd water twee keer.
Keer de elektronische plaat om op een steriele gaas of papieren doek om het resterende water bij kamertemperatuur af te tappen. Voer vervolgens ultraviolette sterilisatie uit op de geregenereerde elektronische plaat gedurende één tot twee uur in de bio-veiligheidskast bij kamertemperatuur. Nadat de platen zijn gebruikt voor het afleveren van geneesmiddelen met behulp van mesoporeus materiaal zoals beschreven in het tekstprotocol, verwerkt u de resterende cellen met trypsine zoals eerder.
Aangezien de pipet vaak wordt gebruikt in de experimenten, moet de persoon erop letten om krabben van de punt en het oppervlak van de microchips te voorkomen. Spoel de microchips eenmaal met 200 microliters gedeïoniseerd water in de bio-veiligheidskast bij kamertemperatuur. Was vervolgens de microchips twee keer met 200 microliters absoluut ethanol bij kamertemperatuur.
Spoel vervolgens de microchips eenmaal met 200 microliters 75%ethanol bij kamertemperatuur. Voeg 250 microliters 75%ethanol toe in elke put en verzegel de elektronische plaat met de afdichtingsfolie bij kamertemperatuur. Na het draaien van de elektronische plaat bij 114 keer G gedurende twee minuten, leeg de plaat.
Keer de elektronische plaat om op een steriele gaas of papieren doek om de resterende vloeistof bij kamertemperatuur af te tappen. Herhaal de 75%ethanol-spoelingen gevolgd door het draaien. Voer vervolgens ultraviolette sterilisatie uit op de geregenereerde elektronische plaat gedurende één tot twee uur in de bio-veiligheidskast bij kamertemperatuur.
Beoordeel de optische kenmerken van het geregenereerde elektronische plaatoppervlak door eerst het onderste deel van de incubatieput te demonteren zoals beschreven in het tekstprotocol. Gebruik een confocale laser-scanning microscoop om de spontane fluorescentie van DOX-moleculen te monitoren die door A549-cellen worden geabsorbeerd om de levensvatbaarheid van gehechte cellen na opname van antikankergeneesmiddelen op de nieuwe en geregenereerde elektronische platen te evalueren. Gebruik een 63-voudige olieobjectief en 485 nanometer als de opwindingsgolflengte om de spontane fluorescentie van geabsorbeerd DOX door de cellen op te nemen.
<Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het regenereren van commerciële gouden micro-elektroden die worden gebruikt in een Real-Time Cell Analyzer (RTCA). Het regeneratieproces is ontworpen om de kosten geassocieerd met wegwerpbare microchips te verlagen door herhaaldelijk gebruik mogelijk te maken via een reeks milde behandelingen.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Elektrofysiologie
Achtergrond
- Op goud gebaseerde chips worden veel gebruikt in RTCA voor celanalyse.
- Wegwerpbare microchips brengen hoge kosten met zich mee in onderzoeksomgevingen.
- Regeneratie van deze chips kan de duurzaamheid in laboratoriumpraktijken verbeteren.
- De methode maakt gebruik van reagentia met lage toxiciteit, waardoor het veiliger is voor laboratoriumomgevingen.
Doel van het onderzoek
- Om een kosteneffectieve methode te ontwikkelen voor het regenereren van gouden micro-elektroden.
- Om de haalbaarheid van het hergebruiken van elektronische platen in RTCA te onderzoeken.
- Om afval te minimaliseren en de milieu-impact van wegwerpbaar laboratoriummateriaal te verminderen.
Gebruikte methoden
- Incubatie en proliferatie van A549 cellen in een celkweekbakje.
- Toepassing van trypsine-digestie om cellen los te maken van de micro-elektroden.
- De elektroden spoelen met ethanol en water.
- Implementatie van een draaistap om het regeneratieproces te vergemakkelijken.
Belangrijkste resultaten
- De regeneratieprocedure maakt meerdere gebruiken van gouden micro-elektroden mogelijk.
- Het gebruik van milde reagentia zorgt voor lage toxiciteit tijdens het proces.
- De methode toont effectiviteit in het behoud van elektrodefunctionaliteit.
- De kostenbesparingen zijn aanzienlijk vergeleken met het kopen van nieuwe microchips.
Conclusies
- Dit regeneratieprotocol presenteert een haalbaar alternatief voor wegwerpbare micro-elektroden.
- Het ondersteunt duurzame praktijken in celanalyse-onderzoek.
- De aanpak kan worden aangepast voor verschillende soorten elektronische platen die worden gebruikt in RTCA.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Disposable gold microchips in real-time cell analysis impose significant recurring costs that limit assay scalability in drug discovery workflows. This regeneration protocol enables cost-effective reuse of commercial electronic plates, supporting sustainable and scalable label-free impedance-based cell assays. By reducing consumable expenses, the method improves capital efficiency and supports higher-throughput screening in early discovery stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables repeated label-free monitoring of cellular responses to compounds, supporting consistent target engagement assessment.
- Operational Value: Reduces variability between assays by allowing reuse of standardized electrode surfaces under controlled conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a reusable platform for real-time impedance readouts, facilitating kinetic profiling of compound effects on cell adhesion and proliferation.
- Operational Value: Supports assay standardization across multiple runs, improving data comparability in dose-response and cytotoxicity screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains electrode functionality for longitudinal studies, enabling assessment of drug-induced cellular changes over time.
- Operational Value: Allows for repeated testing of the same plate format, supporting follow-up mechanistic studies after initial screening hits.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum by enabling reusable impedance-based readouts from early compound screening through follow-up mechanistic validation, reducing the need for repeated chip procurement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via real-time, label-free measurement of cellular impedance as a proxy for adhesion, viability, and morphology.
- Screening: Enhances assay readiness and reproducibility by allowing consistent electrode performance across multiple experimental cycles.
- Analytics: Generates quantitative impedance outputs (e.g., cell index) that can be normalized and compared across conditions to assess compound effects.
- Translational Research: Enables continuity from initial screening to secondary validation by preserving electrode functionality for repeated use.
- Enterprise Reuse: Positions the regeneration process as a reusable laboratory capability rather than a single-use consumable workflow.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence by enabling consistent, low-variability measurements across replicate assays.
- Operational Value: Increases throughput and reduces downtime associated with chip replacement and revalidation.
- Strategic Value: Lowers cost per assay, improving budget efficiency in high-volume screening campaigns.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted decision-making by generating reliable, reproducible data across multiple test cycles.
Implementation Considerations
- Requires aseptic technique and familiarity with cell culture handling to avoid electrode surface damage.
- Depends on access to standard lab equipment including incubators, pipettes, centrifuges, and UV sterilization units.
- Necessitates optimization of trypsin exposure time based on cell type and adhesion strength to prevent electrode degradation.
- Requires training to ensure consistent execution of rinsing, spinning, and sterilization steps across users.
- Performance should be validated via impedance baseline stability and optical/electrochemical characterization before reuse in critical assays.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:52
Proliferation/Cytotoxicity Experiment and Data Acquisition
3:54
Case 1: Regeneration of Electronic Plates after Cytotoxicity Evaluation of Anti-cancer Drug
5:53
Case 2: Regeneration of Electronic Plates after Drug Delivery using Mesoporous Material
7:34
Assessment of Regeneration Effect
10:22
Results: Evaluationof Regenerated Electronic Plates
12:01
Conclusion
