Name: Efficiënte generatie en het bewerken van Feeder-vrije IPSCs van menselijke Pancreatic cellen met behulp van de CRISPR-Cas9-systeem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Leer footprint-vrije iPSCs genereren en bewerken van humane pancreascellen met CRISPR-Cas9 ribonucleoproteïnen. Deze methode produceert betrouwbare klonale lijnen zonder mozaïcisme voor stamcelonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Werk in het lab werd ondersteund door de toekenning van de postdoctorale fellowship aan Dr. Anjali Nandal en verkennende subsidie uit Maryland Fonds voor de onderzoek van de stamcel naar BT (TEDCO).

1. herprogrammering Protocol <ol><li>generatie van menselijke iPSC uit primaire menselijke pancreatic cellen <ol><li>vacht een 6-well plaat met 1,5 mg/mL koude collageen en laat het gel bij 37 ° C gedurende 1 h.</li>
		<li>Plaat vroege passage menselijke primaire cellen van de alvleesklier in Prigrow III medium (~ 1-1,5 × 10 5 cellen) op een collageen 6-well plaat gecoat op dag -2 tot ongeveer 2,5 × 10 5 cellen of ten minste 60% confluency per goed op de dag van transductie (dag 0). Plaat voor de eerste studie, ten minste 2-3 putten om één goed met gewenste confluentie op dag 0. Ten minste één goed te gebruiken als besturingselement aan de cellen tellen.</li>
		<li>Op de dag van de transductie (dag 0), warm 1 mL van Prigrow III medium in een waterbad voor elk putje te worden getransduceerde. Oogsten van de cellen van het ene besturingselement goed in 1 mL 10% FBS medium 1 mL trypsine/EDTA gebruik gedurende 5 minuten of totdat de cellen los als u wilt uitvoeren een telling van de cel. Om 10% FBS medium voegt DMEM, 10% FBS, 1% L-Glutamine, 1% natrium pyruvaat en 1% niet-essentiële aminozuren.</li>
		<li>Tellen en controleren van de levensvatbaarheid van de cellen met behulp van het prestatiemeteritem cel en berekenen van het volume van elk virus nodig om het streefcijfer op basis van de cel nummer en virus-titer. Gebruik van de veelheid van infectie (MOI) van KOS = 5, hc-Myc = 5 en hKlf4 = 3 voor de alvleesklier cellen.</li>
		<li>Dooi één set van Sendai vector buizen in de opslag-80 ° C op ijs en voeg voorzichtig de berekende volumes van elk van de drie Sendai vector buizen tot 1 mL van Prigrow III medium, vooraf opgewarmd tot 37 ° C. Pipet zachtjes aan Meng de oplossing. Een goed in een 6-well-plate is genoeg voor transducing met Sendai virale vectoren voor het genereren van geherprogrammeerde cellen.</li>
		<li>Het Prigrow III medium uit de cellen gecombineerd en voeg langzaam de herprogrammering virus mengsel de putjes met de cellen. Incubeer de cellen overnachting in een incubator 37 ° C met een bevochtigde sfeer van 5% CO 2.</li>
		<li>Zorgvuldig verwijderen van het virus mengsel op cellen en vervangen door verse Prigrow III medium de volgende dag, 24u na transductie. Cultuur van de cellen voor 5 d en veranderen het medium elke alternatieve dag.</li>
		<li>Bereiden op dag 5, MEFs op 0,1% gelatine vooraf gecoat 10 cm cultuur gerechten (1.3 x 10 6 cellen/schotel). Groeien MEFs in T175 kolven tot dag 4 en vervolgens op dag 5, de cellen tot 6.000 rads uit een bron van de γ-straling bloot vóór het zaaien van de cellen 13 of gebruik de commerciële MEF bron.</li>
		<li>Op dag 6, gebruik 1 mL van cel detachement oplossing voor 10 min loskoppelen van de getransduceerde cellen, allemaal op MEF gerechten in Prigrow III medium plaat met rots-remmer (5 mM voorraad, 10 µM final) en na een nacht bebroeden in een incubator 37 ° C met een bevochtigde atmosphe Re van 5% CO 2.</li>
		<li>Te wijzigen in het medium van de Prigrow III hESC normaal de volgende dag. Voor het maken van 500 mL van hESC medium, toevoegen DMEM/F-12, 20% (v/v) knockout serum vervanging (KOSR), 5 ng/mL bFGF; 1 mM l-glutamine; Niet-essentiële aminozuren 100 µM en 100 µM 2-mercaptoethanol. Veranderen van het medium zachtjes elke dag nu.</li>
		<li>Observeren de platen regelmatig voor het ontstaan van cel klontjes of kolonies indicatieve geherprogrammeerde cellen. De getransformeerde cellen vormen klonale aggregaten met geplaveide morfologie en grote kern en nucleoli. Mark van de waarschijnlijke &#39; iPSC &#39; kolonies en controleer ze regelmatig voor groei.</li>
		<li>Bijna vier weken na de signaaltransductie als kolonies klaar voor picken of overdracht zijn, bereiden 24-well MEF platen door plating 1.3 x 10 6 cellen/gelatine vooraf gecoate plaat als voorheen voor de overdracht van enkele kolonies.
		<ol><li>Voorbereiden matrix membraan (bv Matrigel) door aliquoting die het gebaseerd op de verdunningsfactor op het certificaat van analyse. Meng één aliquot 25 mL DMEM/F-12 vier 6-well (1 mL/putje) platen en Incubeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende ten minste 1 uur vóór gebruik. Handmatig kiezen 12-24 kolonies met behulp van een steriele pipet-tip gecombineerd hen en overbrengen naar MEF platen in 500 µL van hESC medium.</li>
			<li>Gecombineerd de media in de put voorzichtig verstoren of splitsen van de koloniën. Ook Kies 24-48 kolonies op matrix membraan gecoat 24-Wells-platen. Voor het membraan gecoate platen, gebruik van mTeSR1 (aangevuld met 10 µM rock-remmer) gedurende 24 uur en veranderen elke dag. Binnen 6-10 d van het kiezen van de koloniën, ze zijn klaar om te worden overgedragen aan de nieuwe 24-well en/of 12-well membraan platen om klonen uit te breiden.</li>
		</ol></li> <li>Indien nodig, loskoppelen van de kolonies op MEFs met behulp van 1 mg/mL collagenase voor 20 min, wassen tweemaal met hESC/mTeSR1 en transfer naar membraan bedekt 12 - of 24-Wells-platen. Als er voldoende robuuste kolonies groeien op het membraan van de matrix uit stap 1.1.12, bevriezen de kolonies op MEFs met behulp van iPSC bevriezing media volgens de fabrikant &#39; s richtsnoeren.</li>
		<li>Loskoppelen de robuuste kolonies verguld op het membraan in stap 1.1.12 met behulp van 500 µL van dispase voor 20 min en plaat weer op matrix membraan gecoat 12-Wells-platen. Handmatig Schraap van gedifferentieerde cellen en de eventuele contaminerende MEF feeder cellen te verrijken voor pluripotente op het membraan klonen.</li>
		<li>Breiden het klonen na 6-8 d door groeien op membraan platen gecoate door distantiëren met dispase oplossing als vóór en 6 - of 12-well plaat plating kleincellige aggregaten op verse membraan gecoat. Wijziging mTeSR1 medium dagelijks. Karakteriseren de geherprogrammeerde klonen door alkalische fosfatase kleuring, immunokleuring voor pluripotent markeringen (OCT3/4 en NANOG), FACS analyse van pluripotente oppervlakte markeringen en differentiatie vitrotests. Groeien en cultuur van de klonen op membraan beklede platen voor alle tests inclusief CRISPR bewerken zoals hierboven uitgelegd, tenzij andere coating oplossing is specifiek vermeld.</li>
	</ol></li> <li>Karakterisering van de mens iPSCs <ol><li>alkalisch fosfatase kleuring Opmerking: een commerciële kit hier wordt gebruikt. Zie de tabel van de materialen.
		<ol><li>Plaat putatief menselijke iPSCs op 24-well plaat en cultuur voor 4-5 d met dagelijks media verandering.</li>
			<li>Start van het protocol van de kleuring, gecombineerd het kweekmedium en wassen van de cellen met 1 mL 1 x PBS met 0,05% Tween-20 (PBST).</li>
			<li>Toevoegen van 0,5 mL van de oplossing van de moeilijke situatie in de kit op de cellen en Incubeer bij RT gedurende 2 tot en met 5 min. Aspirate de fix-oplossing en daarna wassen de vaste cellen met PBST. Laat niet de putjes drogen.</li>
			<li>Voeg 0,5 mL vers bereide AP substraat oplossing per putje door het mengen van oplossing A, B en C. Incubate de cellen in het donker (verpakt met folie of in een donkere container) bij kamertemperatuur gedurende 5 tot 15 minuten 
			Opmerking: Monitoren van de kleur te veranderen en zet de reactie stop wanneer de kleur helder verandert om te voorkomen dat niet-specifieke kleuring.</li>
			<li>Zet de reactie stop door aspirating de AP substraat oplossing en wassen van de putjes tweemaal met 2 mL 1 x PBS.</li>
			<li>Observeren van de kolonies onder de Microscoop en de beelden op 4 X of 10 X vergroting helder veld microscoop met een camera vastleggen.</li>
		</ol></li> <li>Immunokleuring <ol><li>menselijke iPSCs in 24-well plaat en cultuur voor 4-5 d plaat met dagelijks media verandering.</li>
			<li>Wassen van cellen eenmaal kort met PBS en moeilijke situatie voor 20 min met 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS.</li>
			<li>Wassen drie keer, gedurende 10 min (3 x, 10 min) met PBS op RT.</li>
			<li>Saturate aspecifieke sites met 10% normale geit of ezel serum (NS, afhankelijk van de dierlijke secundair antilichaam groeide op in) in PBS voor 40 min op RT. Voor alleen intracellulaire epitopes, inclusief 0.3% TX-100 in PBS (TX/PBS) naar permeabilize.</li>
			<li>Wash 3 x 5 min met PBS op RT.</li>
			<li>De OCT4, NANOG, TUJ1, NKX2-5 en SOX17 antilichamen in een verse oplossing van 5% verdunnen NS in PBS en incubeer gedurende 2 uur bij RT of 's nachts bij 4 ° C.</li>
			<li>Wassen van 3 x 5 min met PBS op RT.</li>
			<li>Verdund passende secundaire Alexa Fluor 488 of 568 antistoffen bij 5% NS/PBS en Incubeer de cellen gedurende 1 uur op RT.</li>
			<li>Wassen van 3 x 5 min op RT.</li>
			<li>Met DAPI in PBS Incubeer gedurende 10 min en wassen 2 x voor 5 min op RT. gebruik een fluorescente microscoop om te fotograferen.</li>
		</ol></li> <li>Fluorescentie-activated Cell Sorting (FACS) <ol><li>plaat menselijke iPSCs in een 6-well plaat en cultuur tot de kolonies worden 80% heuvels (ten minste 10 5 cellen /sample) met dagelijkse mTeSR1 middellange verandering.</li>
			<li>Op de dag van het experiment, het isoleren van de cellen en distantiëren tot de schorsing van een enkele cel, zoals uiteengezet in het protocol. Wassen met 10% FBS medium.</li>
			<li>Voor oppervlakte markers, resuspendeer in 0,5-1 mL 10% FBS medium en blijf ice.</li>
			<li>Voor intracellulaire markers, resuspendeer in 1 mL 4% PFA/PBS en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Wassen met 10% FBS medium. Resuspendeer in 0,1% TX/PBS en incubeer gedurende 15 minuten op het ijs. Wassen opnieuw met 10% FBS medium. Resuspendeer in 0,5-1 mL 10% FBS medium en blijf ice.</li>
			<li>Voeg 50 µL van de celsuspensie aan 50 µL van 10% FBS middellange bevattende aanbevolen hoeveelheid TRA-1-60, TRA-1-81 of SSEA-4 antilichamen en incubeer gedurende 30 min. tot 1 h.</li>
			<li>Wassen tweemaal met 10% FBS.</li>
			<li>Resuspendeer in 100 µL van 10% FBS opslagmedium met fluorescerende secundaire antilichamen en incubeer gedurende 30 min. Wash tweemaal met 10% FBS en resuspendeer in passende hoeveelheid 10% FBS. De levende cellen kunnen worden onderscheiden van dode cellen door propidium jodide dye toegevoegd aan &#60; 1 µg/mL te schatten cel apoptosis tijdens de.</li>
		</ol></li> <li>Tri-bloedlijn differentiatie <ol><li>zaad van twee 6-Wells-platen met 1,5-2 x 10 6 iPSCs per putje in mTeSR1 medium met 10 µM rock remmer.</li>
			<li>De cellen groeien voor 2-3 d met dagelijks mTeSR1 middellange wijzigen totdat de putten 80-90 zijn % confluente toestaan.</li>
			<li>Toevoegen voor ectoderm inductie, neurale inductie medium (NIM) volgens de fabrikant &#39; s instructies in putjes van 2-3 van de 6-Wells-platen.</li>
			<li>Het medium omzetten in RPMI met 2% B27 supplement minus insuline en 12 µM CHIR99021 voor mesoderm inductie in 2-3-putten van de platen 14. Enige RPMI toevoegen met 2% B27 supplement minus insuline voor de volgende 24 h. toevoegen 5 µM IWP4 aan het RPMI medium met 2% B27 aanvulling minus insuline gedurende de volgende 24 uur. Na 72 uur vervangen door de media RPMI met 2% B27 supplement leidt tot de generatie van cardiomyocytes in 2-3 overleden te verslaan</li>
			<li>Voor endoderm inductie, het wijzigen van het medium in putjes van de 6-Wells-platen aan MCDB 131 aangevuld met 1,5 g/L natrium bicarbonaat, 1 x Glutamax, 10 mM glucose, 0,5% BSA, 100 ng/mL GDF8 en 5µM van CHIR99021 voor 24 h. cultuur in hetzelfde medium zonder CHIR99021 voor 2-3 d 15.</li>
			<li>Het protocol van immunokleuring Voer uit stap 2 voor alle drie geslachten en controleer voor de expressie van relevante markers.</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 2. Genoom bewerken van menselijke iPSC met behulp van CRISPR-Cas9 <ol><li>voorbereiding van Cas9 eiwit en sgRNA <ol><li>aliquoot Cas9 eiwit in microcentrifuge buizen onder steriele omstandigheden en op te slaan van de aliquots door bevriezing van de buizen op -80 ° C.</li>
		<li>Ontwerpen twee gericht op gids RNAs per gen op basis van de software van MIT (http://www.genome-engineering.org/crispr/) of enige andere CRISPR gids ontwerp webtool. Gericht op eerste of tweede exon van het gen (gebaseerd op open leesraam) voor het genereren van uitsparingen. Kies de twee gidsen zodat ze dicht bij elkaar knippen (~ 30-100 bp uit elkaar) en we gemakkelijk het verwijderen met behulp van dezelfde set van het screenen van inleidingen kunt visualiseren. Kies de gidsen van de output van de software op basis van een hogere kwaliteitsscore en lagere aantal af-target sites. Screening inleidingen met behulp van het programma primer blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) te ontwerpen. Screening van inleidingen moet ten minste 100 bp uit de buurt van het Cas9 gesneden plaatsen en de grootte van het PCR-product moet bij voorkeur tussen 400-700 bp voor gemakkelijker versterking door PCR.</li>
		<li>Ontwerpen de twee complementaire sgRNA oligo Ani (19-22 nucleotiden in lengte afhankelijk van de volgorde van de gids) met een Bsa1 gesneden website op elk uiteinde. De oligo DNAS-systeem kan worden gesynthetiseerd commercieel en gegloeid om te vormen van dubbele streng DNA. Voor het gloeien, voeg 1 µL van 100 µM gidsen, 25 µL van het gloeien buffer (10 mM Tris, pH7.5-8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) en 23 ÂµL van water. Incubeer in een thermocycler geprogrammeerd om te beginnen bij 95 ° C gedurende 2 min en vervolgens geleidelijk afkoelen tot 25 ° C meer dan 45 min.</li>
		<li>Kloon de 2 µL van resulterende fragment in een restrictie-enzym Bsa1 verteerd 1 µL van in-house T7 promotor pCR2.1 vector met een Cas9 binding site met behulp van T4 DNA ligase volgens de fabrikant &#39; s-protocol.</li>
		De gekloonde DNA-fragmenten van de volgorde van de <li>en als trouw is gevestigd, in vitro transcriberen het klonen met behulp van een T7-kit voor het genereren van één gids RNAs. Zuiveren van de sgRNAs met een commerciële kit en elueer in RNase-gratis water. Controleer de concentratie van RNA.</li>
	</ol></li> <li>Transfectie van hiPSCs <ol><li>hiPSCs in mTeSR1 medium cultuur zoals hierboven beschreven, zolang de cellen niet 40-50% heuvels zijn.</li>
		<li>Twee uur voor nucleofection, wordt het medium vervangen door voorverwarmde mTeSR1 medium met 10 µM rock remmer 2 mL.</li>
		<li>Een uur later, voorbereiden op bestemming wells nucleofected cellen door zuigen membraan, bereid als hierboven, van 12-well plaat en vervangen met voorverwarmde 1 mL mTeSR1 medium met 10 µM rock Inhibitor van de omwenteling. Houden bij 37 ° C gedurende incubatie.</li>
		<li>Voorbereiden nucleofection master mix (schaal op de juiste manier afhankelijk van de monsters) voor elk monster door toe te voegen 16.4 µL van P3 oplaadbare batterij aanvulling; 3.6 µL van Supplement 1 van de nucleofector kit; 0,5 µg Cas9 eiwit en 0,5 µg voor elke sgRNA in 22 µL per reactie volume. pMAX GFP vector was ook nucleofected volgens de fabrikant &#39; s aanbevelingen in cellen te schatten ongeveer de efficiëntie van iPSC transfectie.</li>
		<li>Wassen elk goed met 2 mL RT PBS na aspirating van het medium met rots-remmer de iPSC-putjes. Vervolgens gecombineerd PBS, voeg 1 mL cell detachement oplossing en Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 10 minuten</li>
		<li>Resuspendeer de cellen in 3 mL mTeSR1 voedingsbodem en Pipetteer zachtjes op en neer voor het genereren van een eencellige schorsing. Overdracht losgekoppeld cellen aan een centrifuge 15 mL tube met 5 mL mTeSR1 middellange.</li>
		<li>Cellen met cel counter tellen en totale volume vereist voor 0,5 x 10 6 cellen/Transfectie te berekenen. Breng gewenste hoeveelheid cellen in 15 mL centrifugebuis, centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min op RT en gecombineerd supernatant.</li>
		<li>Resuspendeer elke eenheid van 0,5 x 10 6 cellen in 22 µL van de transfectie master mix, bereid in stap 4. Breng snel cellen in de centrale kamer van één putje van de strip van een nucleocuvette. Plaatsen van de strip in een nucleofector apparaat en nucleofect cellen gebruikt CB150.</li>
		<li>Na nucleofection, Voeg snel 80 µL voorverwarmde mTESR1 medium dat 10 µM rock remmer aan elk putje van de nucleofected cellen. Voorzichtig mengen door omhoog en omlaag pipetteren.</li>
		<li>Voorzichtig overbrengen in cellen van de strip putjes van de membraan vooraf gecoate 12-well plaat met mTeSR1 medium met rots-remmer bereid in stap 3.</li>
		<li>Na 1 d, omzetten in verse mTeSR1 medium zonder rock-remmer. Oogst cellen 2-3 d na nucleofection voor het sorteren van eencellige.</li>
	</ol></li> <li>Eencellige isolatie van gerichte hiPSCs <ol><li>een dag vóór de sortering, bereiden 96-wells-platen voor MEF door het zaaien van 2 x 10 6 cellen/gelatine-beklede plaat in 10% FBS medium. Ongeveer 70-80% van de klonen overleven na nucleofection en 2-3 MEF platen kunnen worden voorbereid voor elke bewerking experiment.</li>
		<li>Na de overnachting incubatie, wijzigen de middellange hESC medium (zoals eerder beschreven) aangevuld met 100 ng /mL bFGF, 1 x SMC4 (remmers toegevoegd aan de media ter verbetering van de levensvatbaarheid van de eencellige), en 5 mg/mL fibronectine ter bevordering van de hechting.</li>
		<li>Vervangt het medium op de hiPSCs in de 12-well plaat van mTeSR1 naar mTeSR1 medium aangevuld met 1 x SMC4 voor ten minste 2 uur voordat u sorteert eencellige.</li>
		<li>Het medium van hiPSCs gecombineerd en wassen van de cellen zachtjes met PBS. Voeg 500 µL van cel detachement oplossing in elk putje en Incubeer bij 37 ° C gedurende 10 minuten na het aspirating van de PBS. Genereren van de eencellige opschorting door toevoeging van 1 mL mTeSR1 (unsupplemented) aan elk putje en pipetteren zachtjes op en neer meermaals.</li>
		<li>Celsuspensie Breng in een conische buis 15 mL en de centrifuge gedurende 5 minuten bij 200 x g bij RT. Aspirate supernatant en resuspendeer de cellen in 1 mL mTeSR1.</li>
		<li>Sorteren van de cellen in afzonderlijke cellen met behulp van een cel sorter met 100 mm nozzle onder steriele omstandigheden met één cel in de individuele put van de 96-wells-platen bereid in stap 1.</li>
		<li>Vier dagen na sortering, kolonie vorming moet blijken; op dit punt het kweekmedium vervangen met hESC medium aangevuld met 1 x SMC4.</li>
		<li>Acht dagen na het sorteren, middellange vervangen door hESC medium en cultuur voor 2 overleden</li>
		<li>Loskoppelen van de kolonies met behulp van 1 mg/mL collagenase voor 20 min en deze overbrengen naar 24-well membraan gecoate platen in mTeSR1 met rots-remmer. Laat de eencellige klonen groeien en pakken hun genomic DNA na het dupliceren of het uitbreiden van hen. Gene specifieke primers kunt versterken van doelDNA door PCR.</li>
		<li>Gebruik fragment analyzer kit voor de eerste screening van PCR versterkte doel genomic regio van alle klonen door hen uit te voeren door middel van de gel/kleurstof mengen volgens de fabrikant &#39; s instructies. Schatting van de uiteindelijke grootte van het fragment in de software PROSize door het te vergelijken met de juiste ladder, die is uitgevoerd met de monsters. Volgorde van de verwachte &#39; bewerkt &#39; klonen en analyseren het rangschikken gegevens te bevestigen de redactie of verwijderingen.</li>
		<li>Voor monoallelic en biallelic klonen te differentiëren, versterken de bewerkte volgorde met PCR en kloon in pJET1.2 vector. Verzenden van minstens 8-10 klonen voor het rangschikken en de volgorde om te bevestigen bewerken in één of beide allelen controleren.</li>
		<li>Nadat met succes gerichte iPSC klonen zijn geïdentificeerd door middel van genotypering, bestuderen om te bevestigen dat zij niet pluripotent verloren of opgedaan chromosomale afwijkingen door middel van het proces.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Malik, N., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+methods+for+human+iPSC+derivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A review of the methods for human iPSC derivation.</a> Methods Mol. Biol. 997, 23-33 (2013).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+generation+using+a+single+lentiviral+stem+cell+cassette%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette.</a> Stem cells. 27, 543-549 (2009).</li>
<li>Macarthur, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+by+a+nonintegrating+RNA+Sendai+virus+vector+in+feeder-free+or+xeno-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+Int%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions.</a> Stem cells Int. , 564612(2012).</li>
<li>Li, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytoplasmic+RNA+vector+derived+from+nontransmissible+Sendai+virus+with+efficient+gene+transfer+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression.</a> J Virol. 74, 6564-6569 (2000).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Jpn.+Acad.+Ser.+B%2C+PhysBiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc. Jpn. Acad. Ser. B, PhysBiol. Sci. 85, 348-362 (2009).</li>
<li>Nakagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+efficient+feeder-free+culture+system+for+the+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells.</a> Sci. Rep. 4, 3594(2014).</li>
<li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Cell stem cell. 18, 573-586 (2016).</li>
<li>Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Based+Technologies+for+the+Manipulation+of+Eukaryotic+Genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes.</a> Cell. 169, 559(2017).</li>
<li>Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Based+Technologies+for+the+Manipulation+of+Eukaryotic+Genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes.</a> Cell. 168, 20-36 (2017).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat. Biotech. 32, 347-355 (2014).</li>
<li>McElroy, S. L., Reijo Pera, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+feeder+cells+for+human+embryonic+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse embryonic fibroblast feeder cells for human embryonic stem cell culture.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E1848-E1857 (2012).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotech. 32, 1121-1133 (2014).</li>
<li>Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+technology%3A+a+decade+of+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 16, 115-130 (2017).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CRISPR%2FHDR-mediated+knock-in+for+mouse+embryonic+stem+cells+and+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes.</a> BioTechniques. 59, (2015).</li>
<li>Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+CRISPR%2FCas9-mediated+precise+genome+editing+by+improved+design+and+delivery+of+gRNA%2C+Cas9+nuclease%2C+and+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotech%22%5BJournal%5D)">Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA.</a> J Biotech. 241, 136-146 (2017).</li>
</ol>

BT is een van de oprichters van renoveren Biosciences Inc.

Herprogrammering van menselijke lichaamscellen te iPSCs, heeft een belangrijke impuls aan het gebied van de fundamentele biologie onderzoek, gepersonaliseerde geneeskunde, ziekte modellering, Geneesmiddelenontwikkeling en regeneratieve geneeskunde16verstrekt. Veel huidige en meest gebruikte methoden van menselijke iPSC generatie vereisen het gebruik van virus met het risico van integratie in het genoom van de host of episomal vectoren met lage herprogrammering van efficiëntie. Hier presenteren we ...

De herprogrammering van menselijke lichaamscellen aan de pluripotente staat door overexpressie van herprogrammering van factoren heeft een revolutie teweeggebracht in stamcelonderzoek met toepassingen in ziekte modellering, regeneratieve geneeskunde en Geneesmiddelenontwikkeling. Verschillende niet-virale herprogrammering methoden zijn beschikbaar voor levering van herprogrammering factoren en het genereren van iPSCs, maar het proces is arbeid intensieve en niet zeer efficiënte1. De virale methoden, zijn hoewel efficiënt, geassocieerd met problemen van de integratie van het virus en tumorigeniciteit2,3,4. In dit manuscript rapporteren we het gebruik van cytoplasmatische Sendai virus voor leveren herprogrammering van factoren en tot oprichting van iPSC voetafdruk-vrije lijnen dat het gebrek aan integratie van alle virale vector sequenties in hun genoom5. Sendai virus is een RNA-virus dat na infectie uit cel cytoplasma ~ 10 passages wordt verdund en produceert herprogrammering factoren in overvloed, wat leidt tot snelle en efficiënte herprogrammering van6,7. De gevestigde iPSCs kunnen dan gemakkelijk worden overgestapt naar feeder-gratis medium om te voorkomen dat het gebruik van muis embryonale fibroblasten (MEFs) als feeder cellen8.
In deze publicatie, naast het overzicht van het virus van de Sendai gemedieerde herprogrammering, beschrijven we ook een verbeterde protocol voor het bewerken van iPSCs, die het potentieel heeft om het verstrekken van onbeperkt menselijke cellen met de gewenste genetische modificaties voor onderzoek. Wij hebben CRISPR/Cas9 technologie gebruikt voor de wijziging van de iPSCs, die nu wordt gebruikt voor een breed scala aan toepassingen waaronder knock-ins en uitsparingen, grootschalige genomic deleties, gebundelde bibliotheek screening voor gene discovery, genetische manipulatie van talrijke modelorganismen, en gene therapie9,10,11. Deze techniek gaat de vorming van complexen van Streptococcus pyogenes-afgeleide Cas9 nuclease en 20-mer gids RNAs dat doel erkenning via base-paring met genomic doel opeenvolging grenzend aan 3' nucleotide protospacer aangrenzende bereiken motief (PAM) volgorde. De Cas9 nuclease induceert een dubbele gestrande onderbreking ~ 3 nucleotiden uit de PAM-site, die vervolgens gerepareerde overwegend door niet-homologe einde (NHEJ) traject leidt tot invoegingen of verwijderingen in de open leesraam toetreden, en daardoor functionele Knockout van genen12.
Onze verbeterde protocol bevat de details voor cultuur van menselijke cellen van de alvleesklier, hun herprogrammering op mitotically geïnactiveerd muis embryonale fibroblasten (MEFs) om hogere efficiëntie te herprogrammeren, latere aanpassing aan de feeder-vrije cultuur op Matrigel, karakterisering van gevestigde iPSCs, begeleide CRISPR RNA ontwerp en voorbereiding, levering in iPSCs als RNP complexen, eencellige sorteren als u wilt klonen van bewerkte iPSCs genereren, gemakkelijk screening en identificatie van bewerkingen en karakterisering van eencellige klonen. Genomic verwijderingen werden efficiënt gegenereerd in deze studie door de invoering van Cas9 eiwit en twee CRISPR sgRNA RNP complexen voor het opwekken van dubbele gestrande einden (DSBs) en verwijdering van de tussenliggende segment. Deze methode speelt in op het gebruik van twee gidsen voor het genereren van verwijderingen in de open leesraam, hoog rendement van NHEJ leidt tot lage aantal klonen dat moet worden gekenmerkt en gemakkelijk oriënterende van klonen door het geautomatiseerde capillair elektroforese eenheid, fragment analyzer. Deze effectieve genoom bewerkingsmethoden voor het genereren van ziekten bij de mens stamcel gebaseerde modellen zal binnenkort een standaard en routinematige benadering in elke cel van de stam-laboratorium. Tenslotte precieze genoom bewerken zal het mogelijk maken te gaan dan stamcel ziekte modellering en potentieel kunnen katalyseren van cel-gebaseerde therapieën.

<table><tbody><tr><td>Sendai viral vectors - CytoTune-iPS 2.0 Kit</td><td>Invitrogen</td><td>A16517</td><td>Ontdooi op ijs; S Nr: 1</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA</td><td>Gibco Life Tech</td><td>25300-054</td><td>0,05%, 100 ml; S Nr: 2</td></tr><tr><td>Rock inhibitor (Y-27632)</td><td>Milipore</td><td>SCM075</td><td>Gebruik 10 &mu;M; S Nr: 3</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 medium</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td>S Nr: 4</td></tr><tr><td>Serum replacement (KSR)</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>S Nr: 5</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11960069</td><td>1X; S Nr: 6</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30071.03</td><td>Portie; S Nr: 7</td></tr><tr><td>L-glutamine (Glutamax, 100X), liquid</td><td>Thermo Scientific</td><td>35050061</td><td>1/100; S Nr: 8</td></tr><tr><td>Non-Essential Amino Acids</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>1/100; S Nr: 9</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>55 mM, 1/1.000; S Nr: 10</td></tr><tr><td>Hausser Hemacytometers</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-54</td><td>S Nr: 11</td></tr><tr><td>0,1% Gelatine-oplossing</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7903</td><td>Incuberen bij 37&ordm; C gedurende 1 uur; S Nr: 12</td></tr><tr><td>SSEA-4-antilichaam</td><td>Santacruz</td><td>sc-21704</td><td>1/100; S Nr: 13</td></tr><tr><td>TRA-1-81-antilichaam</td><td>Cell Signaling</td><td>4745S</td><td>1/200; S Nr: 14</td></tr><tr><td>OCT4-antilichaam</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td>1/1.000; S Nr: 15</td></tr><tr><td>Collageen I, rattenstaart</td><td>Life Technologies</td><td>A10483-01</td><td>Koel bewaren; S Nr: 16</td></tr><tr><td>Alexa Fluor-fluorescentie 488/ 568 (secundaire antilichamen)</td><td>Invitrogen</td><td>A21202/A10042</td><td>1/2.000; S Nr: 17</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30028LS</td><td>1X; S Nr: 18</td></tr><tr><td>100-mm weefselkweekschaaltje</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>S Nr: 20</td></tr><tr><td>96-wels weefselkweekplaat</td><td>Falcon</td><td>353078</td><td>S Nr: 21</td></tr><tr><td>6-wels weefselkweekplaat</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>S Nr: 22</td></tr><tr><td>Dissectiescoop </td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>S Nr: 23</td></tr><tr><td>Picking hood</td><td>NuAire</td><td>NU-301</td><td>S Nr: 24</td></tr><tr><td>15 ml centrifugeerbuis</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>S Nr: 25</td></tr><tr><td>50 ml centrifugeerbuis</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>S Nr: 26</td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat</td><td>Invitrogen</td><td>11360</td><td>S Nr: 28</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td>S Nr: 29</td></tr><tr><td>Prigrow III-medium</td><td>ABM</td><td>TM003</td><td>S Nr: 31</td></tr><tr><td>Countess&trade; Celteller</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td>S Nr: 32</td></tr><tr><td>Faxitron X-ray systeem</td><td>Faxitron</td><td>CellRad</td><td>S Nr: 33</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative cell Technologies</td><td>AT-104</td><td>S Nr: 34</td></tr><tr><td>Collageenase</td><td>Life Technologies</td><td>17104019</td><td>1mg/ml stock; S Nr: 35</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7923</td><td>S Nr: 36</td></tr><tr><td>hESC gekwalificeerd matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>Om te verdunnen, gebruik koud DMEM/F-12; S Nr: 37</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R &amp; D</td><td>233-FB</td><td>Stock 10 ug/ml; S Nr: 38</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>EMS</td><td>15710</td><td>4% stock in PBS; S Nr: 39</td></tr><tr><td>TRA-1-60</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-21705</td><td>1/100; S Nr: 40</td></tr><tr><td>NANOG</td><td>ReproCELL</td><td>RCAB0004P-F</td><td>1/100; S Nr: 41</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416-100ML</td><td>S Nr: 42</td></tr><tr><td>Alkaline fosfatase-kit</td><td>Stemgent</td><td>00-0055</td><td>S Nr: 43</td></tr><tr><td>Cas9-eiwit</td><td>PNA Bio</td><td>CP01-50</td><td>Ontdooi en portioneer; S Nr: 44</td></tr><tr><td>Geiten- of ezelsserum</td><td>Sigma</td><td>D9663/G9023</td><td>S Nr: 45</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-100ML</td><td>S Nr: 46</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1306</td><td>S Nr: 47</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>9285-100ML</td><td>S Nr: 48</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653-250G</td><td>S Nr: 49</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>BP2482-500</td><td>S Nr: 50</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>NEB</td><td>M0202T</td><td>S Nr: 51</td></tr><tr><td>Mega Shortscript T7-kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM1354</td><td>S Nr: 52</td></tr><tr><td>Mega Clear-kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM1908</td><td>S Nr: 53</td></tr><tr><td>SMC4</td><td>BD Biosciences</td><td>354357</td><td>S Nr: 54</td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7159</td><td>S Nr: 55</td></tr><tr><td>CloneJET-klonering-kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1232</td><td>S Nr: 56</td></tr><tr><td>Fragment analyzerTM</td><td>Advanced Analytical</td><td></td><td>S Nr: 57</td></tr><tr><td>mTeSR1-mediumkit</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5850</td><td>Opwarmen tot kamertemperatuur; S Nr: 58</td></tr><tr><td>Invriesmedium mFreSR&trade;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5855</td><td>S Nr: 59</td></tr><tr><td>Invriesmedium CryoStor&reg;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7930</td><td>S Nr: 60</td></tr><tr><td>MEF's</td>

efficiënte generatie en het bewerken van feeder-vrije ipscs van menselijke pancreatic cellen met behulp van de crispr-cas9-systeem

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen kan zichzelf vernieuwen en onderscheid maken in meerdere celtypes van het lichaam. De pluripotente cellen zijn dus begeerde voor onderzoek in de regeneratieve geneeskunde en zijn momenteel in klinische proeven voor oogziekten, diabetes, hart-en vaatziekten en andere aandoeningen. Het potentieel om te differentiëren tot gespecialiseerde celtypen in combinatie met de recente vooruitgang in genoom bewerken van technologieën met inbegrip van de CRISPR/Cas systeem bieden extra mogelijkheden voor het afstemmen van het genoom van iPSC voor gevarieerde toepassingen met inbegrip van ziekte modellering, gentherapie, en vertekenende trajecten van differentiatie, om enkelen te noemen. Onder de beschikbare bewerken technologieën, heeft de CRISPR/Cas9 van Streptococcus pyogenes ontpopt als een instrument van keuze voor specifieke bewerking van het eukaryotische genoom. De CRISPRs zijn gemakkelijk te bereiken, goedkope en zeer efficiënte in de techniek gerichte bewerkingen. Het systeem vereist een nuclease Cas9 en een reeks van de gids (20-mer) specifieke aan de genomic doelgroep een 3-nucleotide "NGG" protospacer-aangrenzende-motief (PAM) voor het targeten van Cas9 naar de gewenste genomic locus, naast een universele Cas9 bindende tracer RNA (aangrenzende samen één gids RNA of genoemd sgRNA). Hier presenteren we een stapsgewijze protocol voor efficiënte generatie feeder-onafhankelijke en voetafdruk-vrije iPSC en beschrijven van methoden voor het bewerken van het genoom van iPSC met behulp van de Cas9 ribonucleoprotein (RNP) complexen. Het genoom bewerken protocol is effectief en gemakkelijk kan worden multiplexed door pre-complexvormers sgRNAs voor meer dan één streefniveau met het Cas9 eiwit en tegelijkertijd leveren in de cellen. Ten slotte, beschrijven we een vereenvoudigde benadering voor de identificatie en karakterisering van iPSCs met gewenste bewerkingen. De geschetste strategieën tezamen, verwachting rendering en bewerken van iPSC voor vele toepassingen stroomlijnen.

Wij hebben in deze publicatie, een eenvoudige maar efficiënte protocol gevolgd voor de generatie van iPSC uit menselijke pancreatic cellen met behulp van integratie of voetafdruk-vrije Sendai virus vectoren. Figuur 1A een schematische voorstelling afgebeeld van dit herprogrammering protocol. De menselijke cellen van de alvleesklier werden aangekocht commercieel, gekweekt in medium Prigrow III en getransduceerde met Sendai virus zoals hierboven uitgelegd. Getr...

Dit protocol beschrijft in detail de generatie van voetafdruk-vrije geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) van menselijke pancreatic cellen onder feeder-vrije, gevolgd door bewerken met behulp van CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins en karakterisering van de gewijzigde eencellige klonen.

Efficiënte generatie en het bewerken van Feeder-vrije IPSCs van menselijke Pancreatic cellen met behulp van de CRISPR-Cas9-systeem

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Het algemene doel van deze procedure is om voetafdruk-vrije geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) te genereren uit menselijke pancreascellen onder feeder-vrije omstandigheden, om deze cellen vervolgens te bewerken met CRISPR-Cas9 ribonucleoproteïnen en tot slot de gemodificeerde enkelcelklonen te karakteriseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van genoommodificatie van menselijke stamcellen, zoals de generatie van voetafdruk-vrije iPSCs en bewerking met CRISPR-Cas9 ribonucleoproteïnen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat klonale lijnen van bewerkte iPSCs met een hoge betrouwbaarheid kunnen worden gegenereerd en dat er geen bewijs is van mosaicisme.Nadat een zes-wells plaat is gecoat met koud collageen, worden op dag 2 menselijke primaire pancreascellen uit een vroege passage geplaatst in Prigrow III-medium om ongeveer 2,5 x 10^5 cellen of ten minste 60% confluentie per well te bereiken op de dag van transductie of dag nul. Op de dag van transductie, na het oogsten en tellen van de cellen volgens het tekstprotocol, wordt één set Sendai-vectorbuisjes op ijs ontdooid en worden de berekende volumes van elke buis zorgvuldig toegevoegd aan 1 mL voorverwarmd Prigrow III-medium. Meng de oplossing voorzichtig door te pipetteren.Aspireer het Prigrow III van de cellen en voeg langzaam het herprogrammeringsvirusmengsel toe aan de wells. Incubeer de cellen vervolgens gedurende de nacht in een incubator bij 37 °C. Vierentwintig uur na transductie wordt het virusmengsel voorzichtig van de cellen verwijderd en vervangen door vers Prigrow III-medium.Voeg op dag zes 1 mL celdetachementsolutie toe aan de cellen en incubeer deze gedurende 10 minuten. Zaai vervolgens alle cellen uit op schalen met MEF's die de vorige dag zijn voorbereid, met gebruik van Prigrow III met rock-remmer. Incubeer de cellen gedurende de nacht bij 37 °C.Inspecteer de platen regelmatig op de vorming van celklonters of kolonies die duiden op gereprogrammeerde cellen; deze zullen clonale aggregaten vormen met een kasseimorfologie, een grote nucleus en nucleoli. Markeer de waarschijnlijke iPSC-kolonies en controleer deze regelmatig op groei. Bijna vier weken na de transductie, nadat de 24-wells MEF-platen zijn voorbereid, wordt het matrixmembraan klaargemaakt door het te aliphaticeren op basis van de verdunningsfactor op het analysecertificaat.Selecteer 24-48 kolonies en breng deze over naar met matrixmembraan gecoate 24-well platen met mTeSR1. Incubeer de platen gedurende 24 uur en ververs het medium dagelijks. Raadpleeg het tekstprotocol voor aanvullende details.Voeg 500 mcL dispase toe om de robuuste kolonies die op het matrixmembraan zijn geplaatst, los te maken. Na het incuberen van de cellen gedurende 20 minuten, worden deze opnieuw geplaatst op met matrixmembraan gecoate 12-wellplaten. Expandeer en karakteriseer de klonen met behulp van alkalische fosfatase-kleuring, immunokleuring en FACS-analyse volgens het tekstprotocol.Om HIPSC's te transfecteren na het synthetiseren van SGRNA's volgens het tekstprotocol, bereidt u voor elk monster een nucleofectie-mastermix door 0,5 mcg Cas9-eiwit en 0,5 mcg van elk SGRNA te combineren in een reactievolume van 22 mcL. Nadat het medium met rock-inhibitor is geaspireerd, gebruikt u 2 mL RTPBS om elke put met ISPC's te wassen. Aspireer vervolgens de PBS en voeg 1 mL celdetacheringsoplossing toe.Incubeer de plaat gedurende 10 minuten bij 37 °C. Resuspendeer de cellen in 3 mL mTeSR1-medium en pipetteer voorzichtig op en neer om een suspensie van enkelvoudige cellen te verkrijgen. Breng de gedissocieerde cellen over naar een centrifugebuis van 15 mL die 5 mL mTeSR1-medium bevat.Voeg 16,4 mcL P3 primair cel-supplement en 3,6 mcL supplement één uit de Nucleofector-kit toe aan de nucleofectie-mastermix. Nadat de cellen zijn geteld en gecentrifugeerd, wordt elke eenheid van 0,5 x 10^6 cellen geresuspendeerd in 22 mcL van de eerder bereide transfectie-mastermix. Breng de cellen snel over naar de centrale kamer van één well van een Nucleocuvette-strip.Plaats vervolgens de strip in een Nucleofector-apparaat en voer de nucleofectie van de cellen uit met programma CB150. Voeg na de nucleofectie snel 80 mcL voorverwarmd mTeSR1-medium met 10 micromolar rock-inhibitor toe aan elke put met genucleofecteerde cellen. Meng voorzichtig door herhaaldelijk te pipetteren.Breng de cellen voorzichtig over van de strip naar de wells van de met matrixmembraan geprecoatede 12-well plaat met mTeSR1-medium en rock-remmer. Op de tweede dag van incubatie na het voorbereiden van de MEF-platen wordt het medium van de HIPSCs vervangen van mTeSR1 door mTeSR1 aangevuld met 1XSMC4 gedurende ten minste twee uur vóór de single-cell sortering. Aspireer het medium van de HIPSCs en gebruik PBS om de cellen voorzichtig te wassen.Voeg vervolgens 500 mcL celdetachementoplossing toe aan elke well en incubeer de cellen gedurende 10 minuten bij 37 °C. Maak een enkelcel-suspensie door 1 mL mTeSR1 aan elke well toe te voegen en voorzichtig enkele keren met de pipet op en neer te zuigen. Sorteer de enkelvoudige cellen in individuele wells van een vooraf geprepareerde 96-well plaat.Vier dagen na het sorteren moet de kolonievorming zichtbaar zijn. Vervang op dit punt het kweekmedium door HESC-medium aangevuld met 1X SMC4. Nadat het doeldna volgens het tekstprotocol is geëxtraheerd en geëxpandeerd, wordt een fragment analyzer-kit gebruikt om de PCR-geamplificeerde doelregion van het genoom van alle klonen via de gel dye mix te analyseren, conform de instructies van de fabrikant.Bevestig pluripotente iPSC-klonen volgens het tekstprotocol. Voor de transductie met het Sendai-virus vertonen pancreascellen een typische spoelvormige morfologie. Tegen dag 12 verschijnen er kleine, compacte kolonies op MEF's die lijken op menselijke pluripotente celkolonies.Normaal gesproken hebben volledig gereprogrammeerde menselijke IPSC-koloniën zeer duidelijke grenzen en kunnen deze tussen dag 23 en 30 worden opgepikt. Hier wordt een gedissocieerde kolonie op dag 23 getoond. Hier wordt een typische fasecontrastafbeelding van een IPSC-kolonie getoond na het oppikken en kweken onder feeder-vrije omstandigheden na Sendai-virus-reprogrammering van pancreascellen.Rechtelijk zijn de met alkalische fosfatase rood gekleurde iPSC-kolonies te zien. iPSC's werden bevestigd door immunokleuring voor de pluripotentiemarkers OCT4 en NANOG, zoals getoond in deze panelen. In dit experiment werden iPSC's gekleurd met celoppervlaktemarkers en werd er een FACS-analyse uitgevoerd op een suspensie van enkelvoudige cellen.De groene piek vertegenwoordigt pancreatische IPSC's, en de paarse piek bevat IPSC-negatieve cellen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om aseptische of steriele omstandigheden te handhaven voor het sorteren van cellen en de celkweek. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals gentargeting in IPSC's en ESC's, worden uitgevoerd, en kunnen aanvullende vragen worden beantwoord door nauwkeurige genetische modificaties door te voeren.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u op betrouwbare wijze footprint-vrije en feeder-vrije iPSCs kunt genereren en hoe u biallellische genoomredigering kunt uitvoeren.

efficient-generation-editing-feeder-free-ipscs-from-human-pancreatic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Genoombewerkingstools zoals het CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) systeem hebben de efficiëntie van gentargeting in humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) aanzienlijk verbeterd. Dit manuscript beschrijft een protocol voor het genereren van een lijnspecifiek hiPSC-reporter met behulp van CRISPR/Cas systeem-ondersteunde homologe recombinatie.

Efficiënte generatie van iPSC Neural Lineage Specifieke Knockin Reporters Met de CRISPR / Cas9 en Cas9 Double Nickase System

Genoombewerking van humane pluripotente stamcellen (hPSC's) kan snel en efficiënt worden uitgevoerd. Hier wordt een robuuste experimentele procedure gepresenteerd om hPSC's genetisch te manipuleren, zoals geïllustreerd door het bewerken van het AAVS1-veilige havenlocus om EGFP tot expressie te brengen en antibioticaresistentie te introduceren.

Oprichting van Genome bewerkte menselijke pluripotente stamcellijnen: Van Targeting naar Isolation

Protocollen bij HPSC mutant lijnen met behulp van de iCRISPR platform te genereren en om hPSCs in glucose-responsief β-achtige cellen te onderscheiden zijn beschreven. De combinatie van genoom editing-technologie met HPSC gerichte differentiatie biedt een krachtig platform voor de systematische analyse van de rol van de lijn determinanten in de menselijke ontwikkeling en de progressie van de ziekte.

Genoom bewerken en Directed Differentiatie van hPSCs voor ondervragen Lineage Determinanten in Human eilandjes Development

Een protocol voor snelle CRISPR/Cas9-gemedieerde gene verstoring van muis en mens primaire hematopoietische cellen wordt beschreven in dit artikel. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins worden ingevoerd via electroporation met sgRNAs gegenereerd via in vitro transcriptie en commerciële Cas9. Hoge bewerken rendementen worden bereikt met beperkte tijd en de financiële kosten.

Hoogefficiënte Gene verstoring van lymfkliertest en menselijke hematopoïetische voorlopercellen door CRISPR/Cas9

Met behulp van een voorgemonteerd Cas9 is ribonucleoprotein complex (RNP) een krachtige methode voor het bewerken van nauwkeurige en efficiënte genoom. Hier, wijzen wij op het nut ervan over een breed scala van cellen en organismen, met inbegrip van de primaire menselijke cellen en beide klassieke en opkomende modelorganismen.

Verbeterde genoom bewerken met Cas9 Ribonucleoprotein in verschillende cellen en organismen

Hier wordt beschreven, is een protocol voor tagging endogeen uitgedrukt eiwitten met fluorescerende codes in menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van CRISPR/Cas9. Vermoedelijk bewerkte cellen zijn verrijkt door fluorescentie geactiveerd cel Sorteren en klonen cellijnen worden gegenereerd.

Endogene eiwit Tagging in mens geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van CRISPR/Cas9

Hier gepresenteerd is een protocol voor efficiënte SCHERPEr/Cas9 ribonucleoproteã-gemedieerde gen bewerken in zoogdiercellen met behulp van buis Electroporation.

SCHERPEr/Cas9 Ribonucleoproteã-gemedieerde nauwkeurige Gene bewerking door buis Electroporation

Dit protocol biedt een methode om het genereren van gedefinieerde heterozygoot of homozygoot nucleotide veranderingen te vergemakkelijken met behulp van CRISPR CAS9 in menselijke pluripotente stamcellen.

Generatie van gedefinieerde genomische modificaties met CRISPR CAS9 in menselijke pluripotente stamcellen

Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor naadloze genbewerking in menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een piggyBac-gebaseerd donorplasmide en de Cas9-nickasemutant. Tweepuntsmutaties werden geïntroduceerd in exon 8 van de hepatocytaire alfafactor 4 alfa (HNF4α) locus in menselijke embryonale stamcellen (hESCs).

Introductie van puntmutaties in menselijke pluripotente stamcellen met behulp van naadloze genoombewerking

De gepresenteerde methode beschrijft het genereren van een CRISPR-gemedieerde gen-knock-out in de menselijke embryonale stamcel (hESC) lijn H9, die sgRNA's gericht op het L2HGDH-gen stabiel tot expressie brengt met behulp van een zeer efficiënt lentiviraal-gemedieerd genafgiftesysteem.

CRISPR-Cas9 gemedieerde gendeletie in menselijke pluripotente stamcellen gekweekt onder feedervrije omstandigheden

Leer footprint-vrije iPSCs genereren en bewerken van humane pancreascellen met CRISPR-Cas9 ribonucleoproteïnen. Deze methode produceert betrouwbare klonale lijnen zonder mozaïcisme voor stamcelonderzoek.

Efficiënte generatie en het bewerken van Feeder-vrije IPSCs van menselijke Pancreatic cellen met behulp van de CRISPR-Cas9-systeem (Video) | JoVE Journal

Efficiënte generatie en het bewerken van Feeder-vrije IPSCs van menselijke Pancreatic cellen met behulp van de CRISPR-Cas9-systeem

Meer video's verkennen