Verbeterde methode voor de vaststelling van een In Vitro bloed - hersenbarrière Model gebaseerd op varkens Endothelial hersencellen

Het algemene doel van dit protocol is om primaire porcine hersenendotheelcellen te zuiveren en isoleren om een strak in vitro bloed-hersenbarrièremodel op te zetten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de bloed-hersenbarrière, zoals medicijnaflevering, permeabiliteit, receptorverkeer, evenals de dichtheid en polariteit van de BB.Het grote voordeel van dit model is de hoge opbrengst van primaire herseneenhele cellen die kunnen worden gebruikt om een in vitro bloed-hersenbarrièremodel te creëren met een hoge TEER en lage permeabiliteit. Om deze procedure te starten, plaatst u de hersenen op een steriele flowbench en spoelt u ze voorzichtig met één liter PBS in een beker op ijs.

Vervolgens verwijdert u voorzichtig de hersenvliezen van elke hersenen met behulp van een fijne pincet. Gebruik een scalpel om de grijze stof van de hersenen één voor één af te schrapen en breng de geïsoleerde materialen over naar petrischalen met 20 milliliter DMEM/F-12 op ijs. Voor initiële fragmentatie, laat het grijze stof materiaal door een 50-milliliter spuit zonder naald lopen.

Herhaal de procedure voor alle hersenen en verzamel het verzamelde grijze stof materiaal. Breng het geïsoleerde grijze stof materiaal met DMEM/F-12 medium over naar de grinderbuis van een handbediende weefselhomogenisator. Homogeniseer het materiaal door acht op-en-neer bewegingen te maken met een losse stamper, gevolgd door acht op-en-neer bewegingen met een strakke stamper.

Vervolgens isoleert u de capillairen door het homogenaat te filteren met behulp van een 500-milliliter fles met blauwe dop met filterhouder en 140-micron filtergaas. Plaats de capillairen bevattende filters in petrischalen met een verteringsoplossing. Vervolgens incubeert u de petrischalen gedurende één uur op een orbitale shaker bij 37 graden Celsius op 180 RPM, of roert u ze elke 10 minuten voorzichtig door.

Na één uur wast u de capillairen van de filters met suspensie uit de petrischaal. Verdeel vervolgens de suspensie uit de drie schalen in twee 50-milliliter buizen en stop de vertering door 10 milliliter DMEM/F-12 toe te voegen aan elke 50-milliliter buis. Centrifugeer de celsuspensies bij 250 keer g, vier graden Celsius gedurende vijf minuten.

Zuig vervolgens de supernatanten af en suspendeer elke pellet in 10 milliliter DMEM/F-12. Voeg vervolgens nog eens 20 milliliter DMEM/F-12 toe aan elke buis. Om de omstandigheden voor de aanhechting van PBECs te optimaliseren, voegt u coatingoplossing toe aan de T-75 flacon, resulterend in de uiteindelijke concentraties van collageen vier bij 150 microgram per milliliter en fibronectine bij 50 microgram per milliliter en door gedistilleerd water, waarbij u ervoor zorgt dat de oplossing het hele oppervlak bedekt.

Ontdooi vervolgens de capillairen in een 37-graad Celsius waterbad. Om het vriesmedium te verwijderen, centrifugeer de capillairen bij 250 keer g, vier graden Celsius, gedurende zeven minuten. Zuig daarna voorzichtig het supernatant af en suspendeer het pellet in één tot twee milliliter van de 10-milliliter aliquot.

Breng vervolgens de capillairen suspensie over naar de gecoate T-75 flacon en kantelt de flacon voorzichtig om een gelijkmatige verdeling over het oppervlak te garanderen. Plaats de T-75 flacon op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Na overnachtelijke incubatie, bereidt u 10 milliliter PBEC groeimedium voor, aangevuld met puromycine bij vier microgram per milliliter voor één T-75 flacon en voert u een mediumwisseling uit.

Bereid vervolgens de permeabele membraaninserts voor PBEC zaaien voor door ze te coaten met collageen IV bij 500 microgram per milliliter en fibronectine bij 100 microgram per milliliter en door gedistilleerd water. Trypsiniseer de cellen door twee milliliter trypsin-EDTA oplossing toe te voegen aan de T-75 flacon en plaats deze bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide, gedurende vijf tot zeven minuten. Om de hersendeelcellen los te maken, tikt u voorzichtig met uw vingertoppen op de zijkant van de T-75 flacon.

Breng vervolgens de celsuspensie over in een 15-milliliter buis en centrifugeer de hersendeelcellen bij 250 keer g, vier graden Celsius, gedurende zeven minuten. Vervolgens verwijdert u voorzichtig het supernatant en suspendeert u het pellet in één milliliter medium. Voeg vervolgens nog eens twee milliliter medium toe om het totale volume op drie milliliter te brengen.

Tel het aantal cellen handmatig met behulp van een celtelkamer of een automatisch celtelsysteem. Voor non-contact cocultuur, brengt u inserts over naar de putjes met astrocyten, die de dag ervoor zijn ververst met astrocyten groeimedium. De volgende dag vervangt u het medium op de permeabele membraaninserts met PBECs.

Zuig vervolgens voorzichtig het medium uit de putjes en voeg 750 microliter differentiatiemedium toe aan elke put. Vervolgens zuigt u voorzichtig medium uit de inserts en voegt u 500 microliter differentiatiemedium toe per insert. Voeg vervolgens de resterende 750 microliter differentiatiemedium toe aan elke astrocyten put.

Incubeer vervolgens de cellen met differentiatiemedium bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide, tot de volgende dag. Op de dag na het stimuleren van de cellen met differentiatiemedium, bereidt u het weerstandsmetingskamer systeem voor TEER metingen voor door de kamer twee keer te spoelen met bidistilleerd water, één keer met 70% ethanol gedurende vijf minuten en nogmaals twee keer met bidistilleerd water. Verbind vervolgens de kamer met het systeem, voeg vier milliliter DMEM/F-12 toe aan de weerstandsmetingskamer en laat het ongeveer 30 minuten op kamertemperatuur staan.

Voer vervolgens TEER metingen uit door de inserts voorzichtig in de weerstandsmetingskamer te plaatsen. Hier zijn de fase contrast microscoopbeelden van PBECs, culturen en astrocyten gedurende vijf dagen. Gezuiverde capillaire fragmenten op de eerste dag van de initiële cultuur vertoonden zowel capillairen als besmettende cellen, die na mediumwisseling op dag twee en een extra