Hoornvlies weefselengineering: Een In Vitro Model van de interacties die stromale-zenuwen van het hoornvlies, menselijke
24 januari 2018
Dit protocol beschrijft een nieuwe driedimensionale in vitro model, waar hoornvlies stromale cellen en gedifferentieerde neuronale cellen samen worden gekweekt om te helpen bij het onderzoek en het begrijpen van de interacties van de twee celtypes.
Het algemene doel van dit protocol is om de cellulaire interacties tussen menselijke corneale stromale cellen en neuronale cellen in hun natuurlijke extracellulaire matrix te onderzoeken. Het protocol kan worden uitgebreid om corneale ziekten en dystrofieën te bestuderen, zoals keratoconus, diabetische keratopathie en Fuchs'dystrofie. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van de biologie van de menselijke cornea te beantwoorden, door de onderliggende mechanismen en defecten in de stroma-zenuwinteracties tijdens een specifieke corneale ziekte of dystrofie te identificeren.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat cellen in staat zijn om hun eigen extracellulaire matrix in vitro af te scheiden, wat een beter en nauwkeuriger model van het werkelijke menselijke corneale weefsel in vivo biedt. De implicaties van deze techniek reiken tot de therapie van corneale ziekten, omdat beoordeling van cel-cel- en cel-extracellulaire matrixinteracties zal zorgen voor een nauwkeurige weergave van het corneale weefsel en toekomstige geneesmiddelontwikkeling mogelijk maken. Nu kan deze methode inzicht geven in corneale zenuwbeschadiging en regeneratie.
Het kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals geneesmiddelscreening en -ontwikkeling. Bij ontvangst van menselijke corneaweefselmonsters, breng de weefsels over in een schaal van 21,5 vierkante centimeter met twee milliliter steriele Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing. Plaats de cornea-koepel met de bovenkant naar boven en gebruik een scheermesje onder een hoek van 45 graden om de epitheliale laag af te schrapen.
Draai vervolgens de cornea-koepel met de bovenkant naar beneden en schraap het endotheel grondig van de stroma. Was het stromale weefsel met DPBS. Houd de stromale stukken nat met DPBS en gebruik een chirurgisch mesje nummer 10 om de stromale weefsels in kleine stukken te snijden.
Gebruik steriele pincetten om de stromale stukken over te brengen naar een T25 kweekfles zonder medium. Laat de explanten gedurende ongeveer 30 tot 40 minuten op 37 graden Celsius aan de bodem van de fles hechten. Na nauwkeurig snijden van het stromale weefsel, zet de fles voorzichtig in de incubator.
Het is belangrijk om 30 tot 40 minuten te wachten en vervolgens langzaam medium toe te voegen. Deze stap is cruciaal om volledige aanhechting van de explanten mogelijk te maken en losraken te voorkomen. Eenmaal gehecht, voeg langzaam Eagle's Minimum Essential Medium toe, met 10% foetaal bovien serum en 1% antibioticum-antimyoticum aan de fles, zonder de explanten te verstoren.
Plaats de fles voorzichtig in de incubator bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Laat de explanten ongestoord totdat de cellen beginnen te isoleren en migreren in de fles. Na ongeveer twee tot vier weken zouden de cellen 100%confluentie moeten bereiken.
Bij 100%confluentie, passeer de cellen door het weefselkweekmedium te verwijderen en de cellen met DPBS te wassen. Voeg trypsine toe aan de cellen en incubeer vervolgens bij 37 graden Celsius. Na ongeveer vijf minuten bekijk de cellen onder een lichtmicroscoop om te bevestigen dat ze los zijn komen te zitten.
Stop de proteolyse door vers medium toe te voegen en breng de celsuspensie over in een 15 milliliter conische buis. Centrifugeer de buizen bij 1000 x g om de cellen te pelleten. Verwijder voorzichtig het supernatant zonder de pellet te verstoren en suspendeer de cellen in vers medium.
Na het uitvoeren van een celtelling, zaai ongeveer een keer 10 tot de zesde macht cellen in een T75 kweekfles met vers medium voor verdere expansie. Om een 3D-construct samen te stellen, passeer en tel eerst menselijke corneale fibroblasten en zaai vervolgens ongeveer een keer 10 tot de zesde macht HCF op een polycarbonaatmembraaninsert met 0,4 micron poriën. Voeg 1,5 milliliter vers medium toe aan de bovenkant van de construct.
Pipetteer vervolgens nog eens 1,5 milliliter van hetzelfde medium naar de bodem van elke construct. Voeg na 24 uur 1,5 milliliter medium toe, aangevuld met 0,5 millimolair vitamine C aan de boven- en onderkant van elke construct. Incubeer bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende drie weken, en voeg elke andere dag vers medium met vitamine C toe.
Dit zal de cellen stimuleren om hun eigen extracellulaire matrix af te scheiden en samen te stellen. Voeg na drie weken acht keer 10 tot de derde macht SH-SY5Y menselijke neuroblastoomcellen toe aan de bovenkant van de eerder geassembleerde 3D-constructen. Het is van cruciaal belang om het exacte aantal cellen in deze stap te berekenen en 24 uur te wachten voordat de celdifferentiatie wordt geïnitieerd.
Na 24 uur incubatie, start de SH-SY5Y-celdifferentiatie door de cellen te stimuleren met 1,5 milliliter EMEM met 10%FBS en 10 micromolair retinoïnezuur. Voeg vervolgens 1,5 milliliter van het medium met vitamine C toe aan de bodem van de construct. Retinoïnezuur is lichtgevoelig, dus deze stap moet in het donker worden uitgevoerd.
Na vijf dagen, wanneer de cellen de differentiatiefase bereiken, voeg 1,5 milliliter serumvrij medium toe met twee nanomolair BDNF en 1% antibioticum-antimyoticum aan de bovenkant van de construct. Voeg vers vitamine C-gesupplementeerd medium toe aan de bodem van de construct. Kweek de cellen nog twee dagen voor verdere analyse.
Dit is een transmissie-elektronenmicroscoopbeeld met hoge vergroting van de 3D zelfgeassembleerde construct, die het polycarbonaatmembraan en de corneale stromale cellen aan de bovenkant toont. Deze afbeelding toont de gedifferentieerde neuronale cellen aan de bovenkant, die een stroma-neurone celopstelling vertonen. De pijlen in de afbeelding tonen de neuronale cellen.
Wanneer u deze procedure probeert, is het belangrijk om te onthouden om corneaweefsel altijd nat te houden, bij het snijden van explanten, en chirurgische instrumenten en messen steriel te houden. Na het bekijken van deze video, zou u een goed
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een nieuw driedimensionaal in vitro-model, waarbij stromale hoornvliescellen en gedifferentieerde neurale cellen samen worden gekweekt om het onderzoek naar en het begrip van de interacties tussen deze twee celtypen te ondersteunen. Deze methode kan inzicht bieden in zenuwschade en regeneratie van het hoornvlies.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Hoornvliesonderzoek
Achtergrond
- De studie richt zich op cellulaire interacties in het menselijk hoornvlies.
- Hoornvliesziekten en dystrofieën, zoals keratoconus en diabetische keratopathie, zijn van bijzonder belang.
- Het begrijpen van interacties tussen het stroma en de zenuwen is cruciaal voor de aanpak van aandoeningen aan het hoornvlies.
- De extracellulaire matrix speelt een belangrijke rol in het cellulaire gedrag.
Doel van de studie
- Om de interacties tussen stromale hoornvliescellen en neurale cellen te onderzoeken.
- Om mechanismen en defecten in zenuwinteracties tijdens hoornvliesziekten te identificeren.
- Om het begrip van de biologie van het hoornvlies te vergroten.
Gebruikte methoden
- Driedimensionaal in vitro cultuurmodel.
- Co-cultuur van corneale stromale en neuronale cellen.
- Beoordeling van cel-cel interacties en interacties tussen cellen en de extracellulaire matrix.
- Evaluatie van cellulaire responsen in een natuurlijke extracellulaire matrixomgeving.
Belangrijkste resultaten
- Het model maakt de secretie van een authentieke extracellulaire matrix mogelijk.
- Er is inzicht verkregen in beschadiging en regeneratie van de hoornvlieszenuwen.
- De techniek ondersteunt de gerichte ontwikkeling van geneesmiddelen voor hoornvliesziekten.
- Kernvragen binnen de hoornvliesbiologie werden met deze methode beantwoord.
Conclusies
- Dit nieuwe model biedt een nauwkeurigere weergave van menselijk corneaweefsel.
- Het heeft implicaties voor de therapie bij hoornvliesziekten.
- Verder onderzoek kan het begrip van interacties tussen cornea-zenuwen uitbreiden.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Dit 3D in vitro-model beantwoordt de behoefte aan fysiologisch relevante menselijke cornea-systemen in de vroege ontdekkingsfase, waardoor mechanistische analyse van interacties tussen het stroma en de zenuwen bij cornea-aandoeningen mogelijk wordt. Door de natuurlijke depositie van de extracellulaire matrix en de co-cultuur van stromale en neuronale cellen na te bootsen, ondersteunt het model de validatie van targets en het verminderen van risico's bij therapeutische hypothesen voorafgaand aan dierproeven. Het biedt een schaalbaar, reproduceerbaar platform voor het beoordelen van de effecten van verbindingen op de integriteit en regeneratie van de cornea-zenuwen, wat aansluit bij de inspanningen binnen de sector om de afhankelijkheid van in vivo-modellen te verminderen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de interactie tussen stroma en zenuwen in menselijk hoornvliesweefsel te onderzoeken, waardoor pathogene mechanismen bij aandoeningen zoals keratoconus en diabetische keratopathie worden verduidelijkt.
- Operationele waarde: Biedt een menselijk relevant systeem om targets te valideren die betrokken zijn bij zenuwbeschadiging en regeneratiepaden.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door ziekte-relevante celinteracties te modelleren binnen een gedefinieerde context van de extracellulaire matrix.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantitatieve resultaten op over neuronale differentiatie, morfologie van stromale cellen en assemblage van de extracellulaire matrix onder blootstelling aan een geteste verbinding.
- Operationele waarde: Een gestandaardiseerd 3D-constructformaat maakt reproduceerbaar uitplaten, doseren en uitlezen mogelijk over verschillende screeningscampagnes.
- Klaarheid van de assay: Ondersteunt medium-throughput evaluatie van neuroprotectieve, neuroregeneratieve of antifibrotische middelen in een menselijke corneale micro-omgeving.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele waarde: Slaat een brug tussen de ontdekkingsfase en de preklinische stadia door menselijke cellulaire fenotypen en matrixsamenstellingen te behouden die relevant zijn voor hoornvliesdystrofieën.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Maakt vroege beoordeling mogelijk van de effecten van verbindingen op de integriteit van de stromale zenuwen, wat go/no-go-beslissingen informeert voorafgaand aan in vivo-efficiëntiestudies.
- Afstemming van biomarkers: Faciliteert de correlatie van functionele read-outs (bijv. neurietuitgroei, matrixdepositie) met het ziekte-modificerende potentieel.
Integratie van Pipeline & Workflow
Het model past binnen het ontdekkingscontinuüm van target-hypothesetesten tot lead-optimalisatie en biedt een mensrelevant co-cultuursysteem van stroma en zenuwen voorafgaand aan de preklinische validatie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing van stroma-zenuwsignaleringspaden in hoornvliesziektemodellen.
- Screening: Maakt assay-klare 3D-constructen mogelijk voor compoundscreening met read-outs die afhankelijk zijn van de extracellulaire matrix.
- Analytics: Genereert kwantitatieve imaging- en biochemische resultaten (bijv. celuitlijning, differentiatiemarkers, matrixdepositie) om behandelcondities te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Handhaaft menselijke corneale fibroblast- en gedifferentieerde neuronale fenotypen, wat de continuïteit naar preklinisch effectiviteitsonderzoek ondersteunt.
- Bedrijfsmatige herbruikbaarheid: Het platform kan worden aangepast voor verschillende hoornvliesziektemodellen en compoundklassen, waardoor de inspanning voor herontwikkeling wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Mechanische risicoreductie van hypothesen over stroma-zenuwinteracties in de cornea-pathofysiologie.
- Operationele waarde: Een gestandaardiseerd protocol voor 3D-weefselassemblage, co-cultuur en differentiatie ondersteunt de reproduceerbaarheid tussen laboratoria.
- Strategische waarde: Informeert vroege go/no-go-beslissingen door de effecten van verbindingen op de integriteit van menselijke cornea-zenuwen te voorspellen.
- Portfolio-impact: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van therapeutische kandidaten voor het hoornvlies mogelijk op basis van mens-relevante gegevens over zenuwinteracties.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in primaire celkweek, 3D-weefselengineering en neuronale differentiatie.
- Afhankelijk van steriele celkweekinfrastructuur, incubatoren en microscopie voor de beoordeling van het construct.
- Vereist standaardisatie van de isolatie van stromale explantaten, fibroblastexpansie en de timing van de SH-SY5Y-differentiatie.
- Aanpassing aan andere neuronale of gliale celtypen kan optimalisatie van differentiatiefactoren vereisen.
- De tijdlijn voor de rijping van het construct (5+ weken) vereist planning voor langdurige assay-vensters.
