Ontwikkeling van een menselijke preklinische Model van Osteoclastogenesis uit perifeer bloed monocyten mede gekweekt met borst kanker cellijnen
13 september 2017
Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van een in vitro menselijke preklinische model van osteoclastogenesis uit perifeer bloed monocyten gekweekt met borst kanker cellijnen na te bootsen de kanker cel-osteoclast interactie. Het model kan worden gebruikt om verdere van ons begrip van metastase biomineralisatie en therapeutische opties te verbeteren.
Het algemene doel van dit in vitro menselijke preklinische model van osteoclastogenese, afgeleid van perifere bloedmonocyten, of PBMC's, gekweekt met borstkankercellijnen, is om de interacties tussen kankercellen en osteoclasten na te bootsen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van botmetastase te beantwoorden over de effecten van de interactie tussen kankercellen en botcellen binnen de botmicro-omgeving. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een volledig menselijk preklinisch model is.
Deze methode kan ook inzicht geven in botmetastase. Het kan ook worden toegepast op de studie van andere botgerelateerde pathologische mechanismen, zoals osteoporose. Personen die nieuw zijn in deze methode kunnen worstelen vanwege de variabiliteit tussen gezonde donoren en bij het selecteren van de juiste PBMC-celdichtheid.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat ze onze PBMC-selectie- en zaaistappen moeten zien. Er is enige handmatige ervaring nodig voordat vakbekwaamheid kan worden bereikt. Begin met het verdunnen van minimaal 20 milliliter gezonde donor-volbloed in EDTA in een een-op-een verhouding in PBS. Na grondig mengen, verdeel de bloedoplossing in 30 milliliter aliquoten in 50 milliliter conische buisjes.
Leg voorzichtig 15 milliliter lymfocytscheidingsmedium onder in de bodem van elke buis. Scheid de cellen door dichtheidsgradiëntcentrifugering. En trek de witte buffy coats met mononucleaire cellen in een nieuwe 15 milliliter buis.
Was de geoogste cellen twee keer in 20 milliliter PBS per wassing, gevolgd door lysis van de rode bloedcellen met vijf milliliter rode bloedcel lysisbuffer gedurende drie tot vijf minuten, op ijs. Stop de reactie met 20 milliliter PBS, en verzamel de witte bloedcellen door centrifugatie. Resuspendeer het pellet en voltooi alfa M-E-M voor het tellen.
Plateer vervolgens de cellen bij een concentratie van zeven en een half keer 10 tot de vijf PBMC per vierkante centimeter in elke put van een 24-welplate voor hun incubatie bij 37 graden Celsius en vijf procent CO2. Verwijder na ongeveer drie uur het supernatant, puin, niet-gehechte cellen en niet-gelyseerd erytrocyten uit de culturen. En voeg vers medium toe, aangevuld met MCSF.
Vier dagen na het zaaien, was de cellen twee keer met PBS en fixeer ze in vier procent paraformaldehyde gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Voer trap staining uit volgens de instructies van de fabrikant. De osteoclast-achtige cellen zullen TRAP-positief zijn met minimaal vier kernen.
Tel de osteoclast-achtige cellen handmatig onder de microscoop bij een 10X vergroting. Voor kankercel-geïnduceerde osteoclastdifferentiatie wanneer de kankercellen negentig procent confluency bereiken, worden ze losgemaakt door trypsinisatie en gezaaid op nul punt vier micrometer poriëninserts bij een concentratie van vier keer 10 tot de drie cellen per vierkante centimeter in vers alfa MEM. De volgende dag, plaats de gezaaide inserts over ongedifferentieerde een-dag geplateerde mononucleaire celculturen in compleet alfa M-E-M, en ververs het medium elke twee tot drie dagen.
Vervolgens, 11 dagen na het begin van de co-cultuur, breng de inserts over in een nieuwe plaat met het juiste reagens voor de gewenste downstream analyse. Borstkankercellen kunnen osteoclastogenese in stand houden, aangezien het aantal osteoclasten in de putjes geïnduceerd door kankercellen vergelijkbaar is met dat verkregen in de positieve groeifactor controleputjes. Het aantal waargenomen osteoclasten in alle culturen is echter verminderd wanneer de cellen worden behandeld met een anti-tumorgeneesmiddel.
Interessant is dat de oppervlaktes van gerijpte osteoclasten afgeleid van groeifactoren groter zijn dan die geïnduceerd door kankercellen. Dit effect wordt niet waargenomen in behandelde culturen met anti-tumorgeneesmiddelen. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in zeven à acht uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd.
Na dit proces kunnen aanvullende downstream analyses worden uitgevoerd zoals genexpressieanalyse, Western Blot, immunofluorescentieanalyse of ELISA om aanvullende vragen over kankercel/botcel-interacties of over anti-tumorgeneesmiddelmechanismen te beantwoorden. Na de ontwikkeling van deze techniek baant het de weg voor onderzoekers op het gebied van botmetastase om de botmicro-omgeving te bestuderen in een volledig menselijk preklinisch model. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u monocyten kunt co-cultiveren en differentiatie met kankercellen kunt ondergaan.
Vergeet niet dat werken met biologische monsters en geneesmiddelen uiterst gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van handschoenen en laboratoriumjassen altijd moeten worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van een in vitro menselijk preklinisch model van osteoclastogenese uit perifere bloedmonocyten gekweekt met borstkankercellijnen om de interactie tussen kankercellen en osteoclasten na te bootsen. Dit model kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over botmetastasen en het verbeteren van therapeutische opties.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Osteoclastogenese
- Botmetastasen
- Kankercelinteracties
Achtergrond
- Het model maakt gebruik van perifere bloedmonocyten (PBMC's).
- Het beoogt de interacties tussen kankercellen en osteoclasten na te bootsen.
- Dit onderzoek is belangrijk voor het begrijpen van botgerelateerde pathologieën.
- Variabiliteit tussen gezonde donoren kan de resultaten beïnvloeden.
Doel van het onderzoek
- Om interacties tussen kankercellen en osteoclasten na te bootsen.
- Om de effecten van deze interacties binnen het botmicro-omgeving te onderzoeken.
- Om inzichten te bieden in botmetastasen en gerelateerde aandoeningen.
Gebruikte methoden
- Kweek van PBMC's met borstkankercellijnen.
- Beoordeling van osteoclastogenese.
- Evaluatie van kankercel- en botcelinteracties.
- Analyse van variabiliteit in PBMC-celdichtheid.
Belangrijkste resultaten
- Het model bootst met succes interacties tussen kankercellen en osteoclasten na.
- De verkregen inzichten kunnen therapeutische strategieën voor botmetastasen informeren.
- Mogelijke toepassingen breiden zich uit tot andere botgerelateerde ziekten.
- Uitdagingen omvatten donorvariabiliteit en selectie van PBMC-celdichtheid.
Conclusies
- Dit menselijk preklinisch model is waardevol voor het bestuderen van botmetastasen.
- Het verbetert het begrip van kankercelinteracties in de botmicro-omgeving.
- Toekomstige studies kunnen dit model gebruiken voor bredere toepassingen in botpathologie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This fully human preclinical model enables mechanistic de-risking of osteoclastogenic pathways in bone metastasis by recapitulating cancer cell-osteoclast crosstalk in a physiologically relevant system. It supports target validation and assay development for anti-tumor therapeutics by providing quantitative readouts of osteoclast differentiation and function. The model enhances predictive confidence in lead identification by allowing direct observation of reciprocal interactions and downstream analysis of both cell types under drug treatment conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding tumor-induced osteoclastogenesis and pathway clarification in the bone microenvironment.
- Operational Value: Supports biological de-risking and functional target validation by modeling osteoclast differentiation from primary human monocytes under defined co-culture conditions.
- Scientific Value: Facilitates predictive confidence and portfolio triage by quantifying osteoclast formation in response to cancer cell stimuli versus growth factor controls.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows through standardized osteoclast differentiation from PBMCs using RANKL and MCSF.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility via fixed cell density seeding (7.5×10⁵ PBMC/cm²) and timed differentiation (14 days) with TRAP-based osteoclast quantification.
- Scientific Value: Enables reliable compound evaluation by testing drug effects on osteoclastogenesis in both indirect (conditioned medium) and direct co-culture formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease relevance modeling for osteoporosis and other bone conditions through adaptation of the osteoclastogenesis assay.
- Operational Value: Ensures translational continuity by using fully human cells, reducing species translation risk in preclinical-to-clinical extrapolation.
- Scientific Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by measuring changes in osteoclast number and surface area as pharmacodynamic biomarkers of drug efficacy.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for bone-targeted therapies and bone microenvironment modulators.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of cancer cell-derived factors in osteoclast activation and pathway clarification of RANKL-independent osteoclast induction mechanisms.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized monocyte isolation, differentiation, and co-culture with breast cancer cell lines on permeable inserts for paracrine and juxtacrine signaling studies.
- Analytics: Provides quantitative osteoclast readouts via TRAP staining, multinucleated cell counting, and morphometric analysis (surface area) to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling study of drug effects on the metastatic bone microenvironment using clinically relevant breast cancer cell lines.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for studying osteoclast modulation across multiple cancer types and bone pathologies beyond breast cancer.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Delivers predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in osteoclast-cancer cell interactions.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined PBMC isolation, seeding density, and cytokine supplementation protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of drug effects on osteoclast formation and function, reducing late-stage biological risk in bone metastasis programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by quantifying osteoclastogenic potential of compounds and guiding advancement based on bone microenvironment modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary human cell isolation, culture, and differentiation techniques, including PBMC separation and monocyte adherence.
- Depends on instrumentation for cell counting, centrifugation, microscopy (10X magnification for osteoclast counting), and incubation (37°C, 5% CO₂).
- Necessitates cross-team standardization of PBMC donor sourcing, cell density optimization (7.5×10⁵ PBMC/cm²), and co-culture timing (11 days post-cancer cell seeding) to minimize variability.
- Involves adaptation considerations when extending to non-breast cancer cell lines or alternative osteoclast stimuli beyond RANKL/MCSF.
- Includes practical limitations such as donor variability in osteoclast differentiation potential and the need for manual proficiency in PBMC seeding and co-culture setup.
