Name: Ontwikkeling van een menselijke preklinische Model van Osteoclastogenesis uit perifeer bloed monocyten mede gekweekt met borst kanker cellijnen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Leer hoe je een preklinisch model van osteoclastogenese ontwikkelt uit perifere bloedmonocyten gekweekt met borstkankercellijnen. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van botmetastasen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We zouden graag bedanken Yibin Kang voor het verstrekken van de cellijn van SCP2 en Cristiano Verna voor redactionele ondersteuning.

menselijke osteoclasten van PBMCs van gezonde donoren die gaf schriftelijke geïnformeerde toestemming om deel te nemen in de studie werden onderscheiden. Het studie-protocol is goedgekeurd door de lokale ethische Commissie, volgens de ethische normen vastgelegd in de verklaring van Helsinki van 1964.
 1. osteoclast differentiatie Opmerking: perifeer bloed of buffy coats van gezonde menselijke donoren in EDTA verzamelen. Gebruik niet minder dan 20 mL perifeer bloed. Buffy coats zijn beter omdat ze een grotere overvloed van mononucleaire cellen hebben. Alle van de volgende stappen uitvoeren in de kap van een steriele weefselkweek.
<ol><li>Verdun EDTA bloed 1:1 met 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Resuspendeer goed.</li>
	<li>Laag op lymfocyt scheiding media (bloed PBS: lymfocyt scheiding media, 2:1) in 50 mL tubes.
	<ol><li>Pipetteer 30 mL van bloed verdund in PBS in een tube van 50 mL.</li>
		<li>Ondertapijt zachtjes 15 mL lymfocyt scheiding media in de onderkant van de buis van 50 mL.</li>
	</ol></li> <li>Centrifuge op 757 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (geen remmen).</li>
	<li>Verzamelen de mononucleaire cellen: <ol><li>de witte laag van mononucleaire cellen met een 5 mL-pipet verzamelen zonder schudden en breng dit in een nieuwe tube van 50 mL.</li>
		<li>De verzamelde PBMCs met 20 mL PBS verdunnen.</li>
	</ol></li> <li>De PBMCs wassen: <ol><li>Centrifuge op 225 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Verwijder het supernatant door het omkeren van de buis. Eenmaal herhaald.</li>
	</ol></li> <li>Lysis van de RBC: Opmerking: als de cel pellet rood is, cellen te behandelen met rode bloedcellen lysing van bufferoplossing (Zie Tabel van materialen).
	<ol><li>Zet de tube 50 mL op ice.</li>
		<li>Voeg toe 5 mL rode bloedcellen lysing van buffer.</li>
		<li>Wacht 3-5 min om te voltooien de lysis van de erytrocyt. De tijd varieert afhankelijk van de mate van verontreiniging van de erytrocyt.</li>
		<li>Zet de reactie stop door toevoegen van 20 mL PBS.</li>
		<li>Centrifuge op 225 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant door het omkeren van de buis. 
		Opmerking: Optioneel: als de lysis van de RBC wordt uitgevoerd, de PBMCs wassen zoals hieronder beschreven.</li>
	</ol></li> <li>Wash PBMCs: <ol><li>Voeg toe 20 mL PBS en centrifuge bij 225 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Verwijder het supernatant door het omkeren van de buis.</li>
	</ol></li> <li>Resuspendeer de cellen in volledige α-MEM (aangevuld met 1% glutamine (beginconcentratie 100 X) en 10% foetale runderserum).</li>
	<li>Rekenen de cellen met een Neubauer-kamer.
	<ol><li>Verdunnen van het monster 1:100 in ijsazijn en cellen tellen met 10 µL van de verdunning.</li>
		<li>Ten minste tweemaal tellen en berekent het gemiddelde van replicaat-organismen om het totale gemiddelde aantal cellen verzamelde.</li>
	</ol></li> <li>Plaat cellen: <ol><li>plaat cellen bij een concentratie van 750.000 PBMCs per cm 2.</li>
		<li>Vergulde cellen opslaan in een incubator bij 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO 2. 
		Opmerking: Ontwerp het experiment wilt opnemen van de negatieve controles, waaraan de cellen die zijn behandeld met normale volledige α-MEM zonder MCSF of RANKL GFs. Vergeet niet om uit te voeren elke voorwaarde in ten minste 3 technische repliceert. Uitvoeren van ten minste 3 biologische replicatieonderzoeken.</li>
	</ol></li> <li>Het medium aangevuld met GFs wijzigen: <ol><li>ongeveer 3 uur wachten na het zaaien van de cel en verwijder het medium Pipetteer (200-1000 µL) verwijderen van puin en losse cellen erytrocyten. 
		Opmerking: Wees voorzichtig met het wijzigen van het medium om te voorkomen mobiele-detachement.</li>
		<li>Toevoegen nieuwe volledige α-MEM aangevuld met 20 ng/mL MCSF (500 µL per putje). 
		Opmerking: Wanneer mede kweken met kankercellen, zaad de kanker cellen de dag na het zaaien van de PBMC.</li>
	</ol></li> <li>De media veranderen elke 2-3 dagen (α-MEM aangevuld met 20 ng/mL van MCSF): <ol><li>verwijderen van het medium met een 200-1000 µL pipet.</li>
		<li>Toevoegen nieuwe verse medium een 200-1000 µL Pipetteer.</li>
	</ol></li> <li>6-7 dagen na de cel zaaien, Voeg 20 ng/mL van RANKL aan volledige α-MEM + MCSF.</li>
	<li>Wijzigen van het medium (volledige α-MEM + MCSF + RANKL) elke 2-3 dagen: <ol><li>verwijderen van het medium met een 200-1000 µL pipet.</li>
		<li>Toevoegen nieuwe medium met een 200-1000 µL pipet. Stoppen met inductie van differentiatie 14 dagen na het zaaien van de cel.</li>
		<li>Discard medium en wassen tweemaal met PBS.</li>
	</ol></li> <li>Herstellen van cellen met paraformaldehyde: <ol><li>cellen te drogen.</li>
		<li>4% paraformaldehyde toevoegen (Zie Tabel of Materials).</li>
		<li>Gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur Incubate.</li>
	</ol></li> <li>Negeren paraformaldehyde en spoel tweemaal met 500 µL van PBS. 
	Let op: Paraformaldehyde is giftig; Gelieve het dragen van handschoenen, masker en brillen.</li>
	<li>Cellen te drogen toestaan.</li>
	<li>Uitvoeren TRAP kleuring volgens de fabrikant &#39; s instructies (Zie Tabel of Materials).</li>
	<li>Tellen osteoclast-achtige cellen handmatig onder de Microscoop op vergroting 10 X; NB 0,30. 
	Opmerking: Osteoclast-achtige cellen zijn gedefinieerd als TRAP + polycarion cellen met minstens 4 kernen.</li>
</ol> 2. Kanker celculturen Opmerking: de experimenten kunnen worden uitgevoerd met verschillende soorten borst adenocarcinoom cellijnen zoals SCP2 17, een osteotropic-cellijn afkomstig uit de triple negatieve mens borst kanker cellijn (MDA-MB-231) en de hormonale receptor-positieve cellijn MCF7.
<ol><li>Cultuur de cellen als een enkelgelaagde in 75 cm 2 kolven.
	<ol><li>Zaad 1.000.000 kankercellen in een maatkolf van 75 cm 2.</li>
		<li>Slaan de cellen bij 37 ° C in de volledige α-MEM medium aangevuld met 1% glutamine en 10% foetale runderserum in een sfeer van 5% CO 2.</li>
	</ol></li> <li>Losmaken van de cellen in een confluentie van ongeveer 90%: <ol><li>verwijderen van het medium, wassen met PBS en voeg 2-3 mL trypsine 1 X in PBS.</li>
		<li>Incubeer de cellen gedurende 3-5 minuten bij 37 ° C.</li>
		<li>De vrijstaande cellen ophalen in de kolf van 75 cm 2 door een 10 mL Pipet, 8 mL volledige voedingsbodem om te stoppen met de enzymatische reactie toevoegen.</li>
		<li>Centrifugeer bij 225 x g gedurende 5 min.</li>
	</ol></li> <li>Wassen van de kankercellen: <ol><li>Voeg toe 10 mL PBS.</li>
		<li>Centrifugeer bij 600 x g gedurende 5 min.</li>
	</ol></li> <li>Kankercellen met een kamer Neubauer tellen.
	<ol><li>Ten minste tweemaal kankercellen tellen en berekent het gemiddelde van replicaat-organismen om het totale gemiddelde aantal cellen verzamelde.</li>
	</ol></li></ol> 3. Directe co culturen van kankercellen een nd monocyten ondergaan differentiatie naar osteoclasten <ol><li>zaad van de kankercellen op inserts (porie diameter 0,4 µm): <ol><li>zaad van de kankercellen bij een concentratie van 4.000 cellen per cm 2.</li>
		<li>Incubeer bij 37 ° C en 5% CO 2. 
		Opmerking: Zaad de kanker cellen overmorgen PBMC zaaien voor de co cultuur experiment in 0.4 µm inzetstukken.</li>
	</ol></li> <li>Wacht 24 uur om de cellen te houden.</li>
	<li>Plaats de geplaatste invoegen cultuur over de mononucleaire culturen om te beginnen de co cultuur (zie punt 1.10 van het protocol).</li>
	<li>Veranderen de media elke 2-3 dagen met volledige α-MEM.
	<ol><li>Verwijderen van het medium met een 200-1000 µL pipet.</li>
		<li>Voeg toe 500 µL van verse medium. 
		Opmerking: Het hoofddoel van de co cultuur is te begrijpen van de kracht van de osteoclastogenic van kankercellen, daarom de GFs worden niet toegevoegd aan α-MEM. In elk experiment van co cultuur, omvatten negative controles (zienoot in stap 1.10 van het protocol) en positieve controles van osteoclasten onderscheiden zich door RANKL en MCSF (geen kankercellen). Kankercellen zaadjes in de inserts niet geplaatst over mononucleaire cellen worden gebruikt als een negatieve controle van de co cultuur.</li>
	</ol></li> <li>Stop de co cultuur en gebruik van kankercellen downstream p.a.: <ol><li>13 dagen na PBMC zaaien en 12 dagen na kanker cel zaaien, plaats de invoegen op een nieuwe plaat.</li>
		<li>Stoppen met de cultuur van de cel kanker op basis waarvan downstream analyses worden uitgevoerd moeten (Zie discussie).</li>
	</ol></li> <li>Op dag 14, stoppen osteoclast differentiatie en monteren van cellen, zoals gemeld in stap 1.15.</li>
	<li>Uitvoeren TRAP kleuring onmiddellijk of binnen 14 tot 30 dagen. 
	Opmerking: Optionele kleuring: om te bevestigen dat de TRAP + polycarion cellen osteoclasten zijn, onderzoekers kunnen uitvoeren extra kleuring voor het detecteren van CTR, een osteoclast-specifieke marker. De detectie van F-actine ringen is een ander osteoclast-specifieke kleuring assay 12 , 13 , 14.</li>
</ol>

<ol><li>Ibrahim, T., Mercatali, L., Amadori, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+and+cancer%3A+the+osteoncology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cases+Miner+Bone+Metab%22%5BJournal%5D)">Bone and cancer: the osteoncology.</a> Clin Cases Miner Bone Metab. 10 (2), 121-123 (2013).</li>
<li>Coleman, R. E., Rubens, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+course+of+bone+metastases+from+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">The clinical course of bone metastases from breast cancer.</a> Br J Cancer. 55 (1), 61-66 (1987).</li>
<li>Ibrahim, T., Mercatali, L., Amadori, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+emergency+in+oncology%3A+bone+metastases+in+breast+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Lett%22%5BJournal%5D)">A new emergency in oncology: bone metastases in breast cancer patients.</a> Oncol Lett. 6 (2), 306-310 (2013).</li>
<li>Swartz, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+complexity%3A+emerging+roles+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy.</a> Cancer Res. 72 (10), 2473-2480 (2012).</li>
<li>Roodman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Eng+J+Med%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of bone metastasis.</a> N Eng J Med. 350 (12), 1655-1664 (2004).</li>
<li>Patel, L. R., Camacho, D. F., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cancer+cell+metastasis+to+the+bone%3A+a+multistep+process%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Oncol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cancer cell metastasis to the bone: a multistep process.</a> Future Oncol. 7 (11), 1285-1297 (2011).</li>
<li>Chen, Y. C., Sosnoski, D. M., Mastro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+metastasis+to+the+bone%3A+mechanisms+of+bone+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Breast cancer metastasis to the bone: mechanisms of bone loss.</a> Breast Cancer Res. 12 (6), 215(2010).</li>
<li>Guise, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+bone+metastases%3A+it%27s+all+about+the+neighborhood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Breast cancer bone metastases: it's all about the neighborhood.</a> Cell. 154 (5), 957-959 (2013).</li>
<li>Ell, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-induced+osteoclast+miRNA+changes+as+regulators+and+biomarkers+of+osteolytic+bonemetastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor-induced osteoclast miRNA changes as regulators and biomarkers of osteolytic bonemetastasis.</a> Cancer Cell. 24 (4), 542-556 (2013).</li>
<li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VCAM-1+promotes+osteolytic+expansion+of+indolent+bone+micrometastasis+of+breast+cancer+by+engaging+%CE%B14%CE%B21-positive+osteoclast+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">VCAM-1 promotes osteolytic expansion of indolent bone micrometastasis of breast cancer by engaging α4β1-positive osteoclast progenitors.</a> Cancer Cell. 20 (6), 701-714 (2011).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+osteogenic+niche+promotes+early-stage+bone+colonization+of+disseminated+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The osteogenic niche promotes early-stage bone colonization of disseminated breast cancer cells.</a> Cancer Cell. 27 (2), 193-210 (2015).</li>
<li>Liverani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSF-1+blockade+impairs+breast+cancer+osteoclastogenic+potential+in+co-culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">CSF-1 blockade impairs breast cancer osteoclastogenic potential in co-culture systems.</a> Bone. 66, 214-222 (2014).</li>
<li>Mercatali, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+everolimus+in+an+in+vitro+model+of+triple+negative+breast+cancer+and+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">The effect of everolimus in an in vitro model of triple negative breast cancer and osteoclasts.</a> Int J Mol Sci. 1 (11), e1827(2016).</li>
<li>Glantschnig, H., Fisher, J. E., Wesolowski, G., Rodan, G. A., Reszka, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-CSF%2C+TNFalpha+and+RANK+ligand+promote+osteoclast+survival+by+signaling+through+mTOR%2FS6+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+DeathDiffer%22%5BJournal%5D)">M-CSF, TNFalpha and RANK ligand promote osteoclast survival by signaling through mTOR/S6 kinase.</a> Cell DeathDiffer. 10 (10), 1165-1177 (2003).</li>
<li>Sugatani, T., Hruska, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt1%2FAkt2+and+mammalian+target+of+rapamycin%2FBim+play+critical+roles+in+osteoclast+differentiation+and+survival%2C+respectively%2C+whereas+Akt+is+dispensable+for+cell+survival+in+isolated+osteoclast+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Akt1/Akt2 and mammalian target of rapamycin/Bim play critical roles in osteoclast differentiation and survival, respectively, whereas Akt is dispensable for cell survival in isolated osteoclast precursors.</a> J Biol Chem. 280 (5), 3583-3589 (2005).</li>
<li>Bertoldo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+bone+metastatic+cancer%3A+role+of+the+mTOR+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Targeting bone metastatic cancer: role of the mTOR pathway.</a> Biochim Biophys Acta. 1845 (2), 248-254 (2014).</li>
<li>Kang, Y., Siegel, P. M., Shu, W., Drobnjak, M., Kakonen, S. M., Cordón-Cardo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multigenic+program+mediating+breast+cancer+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone.</a> Cancer Cell. 3 (6), 537-549 (2003).</li>
<li>Simone, V., Ciavarella, S., Brunetti, O., Savonarola, A., Cives, M., Tucci, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Everolimus+restrains+the+paracrine+pro-osteoclast+activity+of+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Everolimus restrains the paracrine pro-osteoclast activity of breast cancer cells.</a> BMC Cancer. 14 (15), 692(2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.

Preklinische in vitro modellen bestuderen van de mechanismen van Overspraak tussen kankercellen en bot cellen zijn nodig om het identificeren van de mechanismen van bot metastase, die kan worden gebruikt voor het maken van nieuwe therapeutische strategieën. We ontwikkelden een model volledig mens in vitro van osteoclastogenesis uit menselijk perifere bloed (Figuur 3). Tijdens de optimalisatie van de methodologie, werden een aantal kritische punten geïdentificeerd en opgelos...

Bot is een gemeenschappelijke site van metastase voor verschillende soorten primaire tumoren zoals prostaat-, Long- en borstkanker kanker, met 20-25% van de patiënten ontwikkelen botmetastasen in de loop van ziekte1,2,3. In het bijzonder, dragen 70% van de borstkankerpatiënten bewijs van bot metastase op dood4. Tumor en stromale cellen interactie is essentieel voor de progressie van kanker in zowel primaire kanker en secundaire laesies. In de communicatie van het bot, is osteolytic botmetastasen van borstkanker afhankelijk van de oprichting van een pathologische vicieuze cirkel die zich voordoen tussen kankercellen, cellen van het bot en de bot-communicatie. Kankercellen verstoren bot evenwicht, toenemende bot resorptie5,6,7.
In normale en pathologische omstandigheden zijn osteoclasten de cellen die verantwoordelijk zijn voor bot resorptie, terwijl botcellen, in het deponeren van de nieuwe matrix, verantwoordelijk voor het nieuwe bot vorming8 zijn. Osteoclast activiteit wordt gereguleerd door botcellen door de uitdrukking van RANKL, dat aan de receptor rang op het oppervlak van de pre osteoclast bindt, inducerende pre osteoclast fusion, een noodzakelijk proces voor differentiatie in volwassen osteoclasten. De inductie van osteoclastogenesis verhoogt bot resorptie. Een groot aantal in vivo studies verbeterd ons begrip van bot metastase vorming9,10,11aanzienlijk. Borstkankercellen van de primaire tumor en in het bot communicatie erover bot homeostase, bevordering van osteoclastogenesis en bot resorptie8. In dit scenario zijn alle de moleculaire interacties die tussen kankercellen en osteoclasten plaatsvinden van cruciaal belang. Zoals reeds vermeld, heeft het mechanisme van metastase biomineralisatie in in vivo muizen modellen zijn opgehelderd. Naast de noodzaak voor de goedkeuring van alle in vivo dierproeven door de ethische commissie zijn er echter verscheidene andere nadelen aan het uitvoeren van in vivo experimenten met inbegrip van hoge kosten en tijdrovende methoden. Verschillende auteurs hebben gecombineerd preklinische in vivo en in vitro modellen van osteoclastogenesis met behulp van een lymfkliertest lijn van pre osteoclasten genaamd RAW246.79,10,11. De nadelen van dit model vloeien voort uit het feit dat de cellen zich al aan het worden pre osteoclasten en niet van menselijke oorsprong. Om deze redenen kon translationeel onderzoek sterk profiteren van de beschikbaarheid van in vitro volledig menselijk preklinische modellen om te studeren bot kanker cel interacties.
We een methode van osteoclastogenesis in vitro vanaf perifere bloed monsters12,13geoptimaliseerd. Osteoclasten ontlenen monocyten, die zijn aanwezig, zij het in een kleine graad, in perifeer bloedmonsters. Mononucleaire cellen worden eerst gescheiden van de erytrocyten en granulocyten in het bloed aanwezig door densiteitgradiënt dichtheid verloop; ze worden dan geselecteerd dankzij hun vermogen zich te houden aan het plastic substraat, in tegenstelling tot lymfocyten. Na het zaaien, de cellen worden gekweekt voor 14 dagen. MCSF en RANKL zijn de GFs door monocyten moeten eerst onderscheiden in macrofagen en vervolgens in de osteoclasten14,15. MCSF is nodig voor de gehele duur van de test, terwijl RANKL wordt gebruikt voor het opwekken van het proces van differentiatie in de late stadia van osteoclastogenesis. In de vroege fase van differentiatie helpt MCSF monocyten vermenigvuldigen en het overleven van14,15. Tijdens het tweede deel van osteoclastogenesis, cellen samensmelten en volwassen als osteoclasten, waarin de karakteristieke verdeling van actine F in ringen en het uiten van specifieke markers zoals tartraat-resistente zure fosfatase (TRAP) en calcitonine receptor (CTR) 14 , 15. onze methode bestaat uit het toevoegen van MCSF aan de monocyt cultuur voor de eerste 7 dagen van het experiment en een combinatie van MCSF en RANKL van 7 tot 14 dagen. Aan het einde van het experiment, wordt osteoclastogenesis geanalyseerd door het tellen van de gedifferentieerde cellen, zoals hieronder beschreven.
De culturen van de monocyt aangezet te onderscheiden door de GFs vormen de basis van ons preklinische model. We geoptimaliseerd een co cultuur systeem zonder GFs om de osteoclastogenic kracht van borstkankercellen beter te begrijpen. We een model van indirecte co culturen voor het eerst ontwikkeld door het toevoegen van een medium (80% α-minimaal essentiële Medium (α-MEM) en 20% geconditioneerd medium verzameld van een cultuur van borstkankercellen dat waren ongeveer 90% heuvels naar cellen ondergaan differentiatie12 . Het geconditioneerde medium (niet verzameld onder serum ontbering voorwaarden) werd verzameld na 24 uur en gemengd met verse medium bij een verhouding van 1:4. Het geconditioneerde medium veroorzaakte significante osteoclast differentiatie ten opzichte van de negatieve controle. Echter verbeterd wij zoals ik de informatie over de wederzijdse interactie tussen kankercellen en bot cellen verloren is gegaan bij het gebruik van indirecte co culturen, onze systeem door het uitvoeren van directe co culturen. We zaadjes kankercellen in 0.4 µM wordt ingevoegd en plaatste ze in putten waar mononucleaire cellen werden verguld. Met behulp van deze methode, cellen delen hetzelfde medium en wisselen secreted eiwitten. We dus een volledig mens preklinische model van osteoclastogenesis die zijn geïnduceerd door kanker cellen13gemaakt.
Dit systeem is zeer veelzijdig en kan worden gebruikt voor verschillende onderzoeksdoeleinden, bijvoorbeeldin farmacologische studies onderzoeken de rol van drugs in bot metastase. Ons model maakt het mogelijk om het onderzoek naar de werkzaamheid en de mechanismen van de actie van bot-gerichte therapieën en/of antitumorale geneesmiddelen in de communicatie van de bot in het bijzijn van kanker cellen13. U ontwerpt de experimenten met de juiste besturingselementen, gemakkelijker d.w.z., kankercellen en osteoclasten gekweekte individueel, te begrijpen de impact van de co-cultuur op drug activiteit. Deze aanpak wordt nog interessanter wanneer de drug bestudeerd richt zich op zowel kanker cellen en osteoclasten, bijvoorbeeldeverolimus16is. Dit model kan ook worden gebruikt ter identificatie van nieuwe trajecten van interactie tussen kankercellen en bot cellen.

<table><tbody><tr><td>&alpha;MEM</td><td>Euroclone</td><td>BE12-169F</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Life-technologies</td><td>ECB3000D</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Life-technologies</td><td>ECS0180DPR</td><td></td></tr><tr><td>hMCSF</td><td>Peprotech</td><td>300-25</td><td>Opslagindicaties moeten worden gerespecteerd</td></tr><tr><td>hRANKL</td><td>Peprotech</td><td>310-01</td><td>Opslagindicaties moeten worden gerespecteerd</td></tr><tr><td>Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>387 A</td><td></td></tr><tr><td>Lymphocyte separation media</td><td>Biowest</td><td>L0560-100</td><td></td></tr><tr><td>Red Blood cell lysing buffer</td><td>SIgma</td><td>11814389001 ROCHE</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>EuroClone</td><td>COD. ECB3052D</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>157-4-100</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231 cell line</td><td>ATCC</td><td>CRM-HTB-267</td><td></td></tr><tr><td>MCF7</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3470-Clear</td><td>Deze inserts zijn voor 24-well platen; 6.5 mm, 0.4 &mu;M; poriegrootte</td></tr></tbody></table>

ontwikkeling van een menselijke preklinische model van osteoclastogenesis uit perifeer bloed monocyten mede gekweekt met borst kanker cellijnen

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

De Overspraak tussen tumorcellen en bot cellen in het bot-communicatie is van cruciaal belang voor het begrip van het mechanisme van metastase biomineralisatie. We een in vitro volledig menselijk preklinische model ontwikkeld van een co cultuur van borstkankercellen en monocyten ondergaan differentiatie naar osteoclasten. We een model van osteoclastogenesis vanaf een steekproef van perifeer bloed verkregen van gezonde donoren geoptimaliseerd. Perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) waren eerst gescheiden door dichtheid kleurovergang centrifugeren, ontpit op een hoge dichtheid en geïnduceerde te onderscheiden door de toevoeging van twee groeifactoren (GFs): receptor activator van nucleaire factor-recombination ligand (RANKL) en macrofaag kolonie-stimulerende factor (MCSF). De cellen waren nog in cultuur voor 14 dagen vast en geanalyseerd door downstream analyse. In osteolytic botmetastasen is een van de gevolgen van kanker cel aankomst in bot de inductie van osteoclastogenesis. We dus ons model met co culturen van borstkankercellen te bestuderen van de kracht van de differentiatie van de kankercellen met betrekking tot de GFs uitgedaagd. Een eenvoudige manier voor het bestuderen van kanker cel-osteoclast interactie is voor het uitvoeren van indirecte co culturen, gebaseerd op het gebruik van geconditioneerde medium verzameld uit borst kanker celculturen en gemengd met verse medium. Dit mengsel wordt vervolgens gebruikt voor het opwekken van osteoclast differentiatie. Wij ook geoptimaliseerd voor een methode van directe co cultuur in welke kanker cellen en monocyten differentiatie ondergaan delen van het medium en wisselen secreted factoren. Dit is een significante verbetering over de oorspronkelijke methode van de indirecte samenwerking cultuur als onderzoekers kunnen de wederzijdse interactie van de twee celtypes observeren en downstream-analyses voor zowel de kankercellen als de osteoclasten uitvoeren. Deze methode kan we bestuderen het effect van drugs op de communicatie van uitgezaaide bot en zaad cellijnen die niet worden afgeleid van borstkanker. Het model kan ook worden gebruikt om te bestuderen van andere ziekten zoals osteoporose of andere bot-voorwaarden.

Een methode is geoptimaliseerd zodat u kunt gemakkelijk onderscheiden van osteoclasten uit menselijk bloed van perifere monocyten. De monocyt-cultuur werd gekweekt met kankercellen, (zoals beschreven in de literatuur18) bevestigt dat kankercellen geschikt zijn voor het behoud van osteoclastogenesis in de botmetastasen. Osteoclasten van kankercellen onderscheiden en GFs zijn afgebeeld in Figuur 1. Een osteoclast-achtige-cel is een cel m...

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van een in vitro menselijke preklinische model van osteoclastogenesis uit perifeer bloed monocyten gekweekt met borst kanker cellijnen na te bootsen de kanker cel-osteoclast interactie. Het model kan worden gebruikt om verdere van ons begrip van metastase biomineralisatie en therapeutische opties te verbeteren.

Ontwikkeling van een menselijke preklinische Model van Osteoclastogenesis uit perifeer bloed monocyten mede gekweekt met borst kanker cellijnen

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

Het algemene doel van dit in vitro menselijke preklinische model van osteoclastogenese, afgeleid van perifere bloedmonocyten, of PBMC's, gekweekt met borstkankercellijnen, is om de interacties tussen kankercellen en osteoclasten na te bootsen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van botmetastase te beantwoorden over de effecten van de interactie tussen kankercellen en botcellen binnen de botmicro-omgeving. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een volledig menselijk preklinisch model is.Deze methode kan ook inzicht geven in botmetastase. Het kan ook worden toegepast op de studie van andere botgerelateerde pathologische mechanismen, zoals osteoporose. Personen die nieuw zijn in deze methode kunnen worstelen vanwege de variabiliteit tussen gezonde donoren en bij het selecteren van de juiste PBMC-celdichtheid.Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat ze onze PBMC-selectie- en zaaistappen moeten zien. Er is enige handmatige ervaring nodig voordat vakbekwaamheid kan worden bereikt. Begin met het verdunnen van minimaal 20 milliliter gezonde donor-volbloed in EDTA in een een-op-een verhouding in PBS. Na grondig mengen, verdeel de bloedoplossin

development-human-preclinical-model-osteoclastogenesis-from

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Bij standaard kweekmethoden cellen uit hun fysiologische omgeving en gekweekt op het plastic oppervlak van een schotel. Om het gedrag van primaire humane beenmergcellen bestuderen we een 3-D kweeksysteem waarbij cellen worden gekweekt onder omstandigheden indient de natieve micro van het weefsel.

Een Drie-dimensionale Tissue Culture Model om te studeren Primary humaan beenmerg en zijn Malignancies

Osteoclasten zijn de voornaamste botresorberende cellen in het lichaam. Het vermogen om osteoclasten te isoleren in grote aantallen heeft tot aanzienlijke vooruitgang in het inzicht van osteoclast biologie. In dit protocol beschrijven we een werkwijze voor het isoleren, kweken en kwantificeren van osteoclasten in vitro.

Osteoclast Afleiding van Mouse Bone Marrow

Protocollen worden beschreven voor het bestuderen van borstkanker celmigratie, proliferatie en kolonisatie in een menselijk botweefsel explantaatmodel systeem.

Methoden voor het kweken van menselijke dijbeen weefselexplantaten naar Breast Cancer Cell Kolonisatie van het gemetastaseerde Niche Bestudeer

Het huidige rapport vat een protocol samen dat kan worden gebruikt om de invloed van de beenmerg-micro-omgevingsniche op leukemiecellen te modelleren, met nadruk op de verrijking van de meest chemoresistente subpopulatie.

Modeling Chemotherapie Resistant Leukemie<em&gt; In Vitro</em

Notch-signalering is een vorm van cellulaire communicatie die afhankelijk is van direct contact tussen cellen. Om Notch-signalering goed te induceren in vitro, moeten Notch-liganden aan cellen worden gepresenteerd in een geïmmobiliseerde toestand. Dit protocol beschrijft methoden voor in vitro stimulatie van Notch-signalering in voorlopers van muizenosteoclasten.

Stimulatie van Notch signalering in Mouse osteoclastvoorlopers

Dit manuscript wordt beschreven van een protocol bij isolaat en cultuur osteoclasten in vitro uit beenmerg van de muis, en te bestuderen van de rol van het zoogdier/mechanistische doelwit van rapamycin complexe 1 in osteoclast vorming.

Een RANKL gebaseerde Osteoclast cultuur Assay van muis beenmerg te onderzoeken van de rol van mTORC1 in Osteoclast vorming

Hier beschrijven we een driedimensionale cultuur-methode voor het analyseren van de morfologie van primaire borstkankercellen, alsmede over de studie van hun directe/indirecte interacties met monocyten en de resultaten zoals de aantasting van het collageen, immuun cel aanwerving, cel invasie, en bevordering van kanker-gerelateerde ontsteking.

Analyseren van de communicatie tussen monocyten en primaire borstkankercellen in een extracellulaire Matrix extraheren (ECME)-gebaseerde driedimensionaal systeem

Osteoclasten zijn weefsel-specifieke macrofagen polykaryons afgeleid van de monocyten-macrofagen afstamming van hematopoietische stamcellen. In dit protocol wordt beschreven hoe u beenmergcellen isoleren zodat grote hoeveelheden osteoclasten worden verkregen terwijl het risico op ongevallen in traditionele methoden wordt verminderd.

Isolatie, zuivering en differentiatie van osteoclast precursoren van het Rat beenmerg

Hier presenteren we een eenvoudige en effectieve testprocedure voor resorptieputtests met behulp van met calciumfosfaat gecoate celkweekplaten.

Een eenvoudig pittestprotocol om osteoclastische resorptie in vitro te visualiseren en te kwantificeren

Osteoclasten zijn belangrijke bot-resorberende cellen in het lichaam. Dit protocol beschrijft een betrouwbare methode voor de in vitro differentiatie van osteoclasten van menselijke perifere bloedmonocyten. Deze methode kan worden gebruikt als een belangrijk hulpmiddel om de biologie van osteoclasten in homeostase en bij ziekten verder te begrijpen.

Differentiatie van functionele osteoclasten van humaan perifeer bloed CD14+ monocyten

Dit protocol presenteert de differentiatie van humane osteoclasten van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) en beschrijft methoden voor de karakterisering van osteoclasten en osteoclastprecursoren.

Differentiatie en karakterisering van osteoclasten van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Leer hoe je een preklinisch model van osteoclastogenese ontwikkelt uit perifere bloedmonocyten gekweekt met borstkankercellijnen. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van botmetastasen.

Ontwikkeling van een menselijke preklinische Model van Osteoclastogenesis uit perifeer bloed monocyten mede gekweekt met borst kanker cellijnen (Video) | JoVE Journal

Ontwikkeling van een menselijke preklinische Model van Osteoclastogenesis uit perifeer bloed monocyten mede gekweekt met borst kanker cellijnen

Meer video's verkennen