27 oktober 2017
Dit manuscript beschrijft de zWEDGI (zebrafish Wounding en Entrapment apparaat voor groei en Imaging), die is een verzuilde apparaat ontworpen bedwingen zebrafish larven te oriënteren. Het ontwerp staat staart transect en op lange termijn collectie van hoge-resolutie fluorescentie microscopie beelden van wondgenezing en regeneratie.
Het algemene doel van deze fabricage van beeldvormingsapparatuur is om een aanpasbaar platform te creëren voor microscopische analyse van wondgenezing bij levende zebravislarven. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het veld van wondgenezing, zoals wat de bijdrage is van de reorganisatie van collageenvezels en cellulaire reacties op de daaropvolgende weefselgroei na verwonding. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat wonden en beeldvorming binnen een enkel apparaat plaatsvinden, terwijl de staartgroei niet wordt belemmerd door het apparaat.
Bovendien kunnen de meerdere functionele compartimenten van de zWEDGI onafhankelijk worden aangepast om verschillende larvale stadia en een reeks experimentele protocollen mogelijk te maken. Om te beginnen, modelleerd het PDMS-onderdeel van het apparaat met de gewenste geometrieën en attributen volgens het tekstprotocol. Na het printen van de mallen met behulp van een fotopolymeer 3-D printer, reinig de mallen met behulp van een fijne borstel, ontsmettingsalcohol in een spuitfles en perslucht.
Schrob voorzichtig en verwijder de ongenezen hars, vooral elk materiaal uit de microkanaalgebieden. Belicht vervolgens de mallen in een UV-nabehandelingsapparaat gedurende 60 minuten aan elke kant, omdat ongenezen hars giftig is voor zebravislarven. Schuur met 200 korrels schuurpapier de holtezijde van de mal op een vlakke oppervlakte totdat alle plafondoppervlakken in contact zijn met het schuurpapier.
Schuur met 400 en 600 korrels schuurpapier lichtjes om gladde, vlakke oppervlakken over alle geometrieën van de mal te produceren. Gebruik vervolgens een draaislinger om de diepte van de holte na het schuren te meten om te verifiëren dat deze dicht bij de ontwerpdiepte ligt. Reinig de mallen en glazen dekschijfjes door ze 30 minuten in een ultrasone reiniger met water te plaatsen of door ze onder stromend water door te spoelen.
Gebruik isopropylalcohol en gefilterde perslucht om de mallen en deksels te reinigen en te laten drogen. Bereid een schone werkplek voor om de apparaten te fabriceren om besmetting door luchtdeeltjes tot een minimum te beperken. Maak het PDMS door basis en activator in een verhouding van 5:1 in een plastic beker te gieten.
Meng met behulp van een houten ambachtenstok gedurende twee minuten goed, waarbij het gel wordt omgegooid alsof je brood kneedt. Ontgast het mengsel in een vacuümexsiccator gedurende 25 tot 45 minuten totdat alle bubbels verdwenen zijn. Vul vervolgens met behulp van een 10 milliliter spuit de holte van elke 3-D geprinte mal met ongeveer 0,75 milliliter PDMS totdat de mal lichtjes overstroomt met een meniscus.
Ontgast de gevulde mallen gedurende 45 minuten om extra bubbels te verwijderen die mogelijk zijn gevormd tijdens het vullen. Breng een glazen dekschijf op de bovenkant van de met PDMS gevulde mal aan en druk de schijf schuin naar beneden om te voorkomen dat er luchtbellen vast komen te zitten. Laat overtollig PDMS uitstromen terwijl de glazen schijf wordt aangebracht.
Gebruik vervolgens een kleine ratelklemmen om de dekschijf stevig aan de mal te klemmen. Voor efficiëntie kan een multi-klemapparaat worden gebruikt. Behandel het PDMS-apparaat en de geklemde mallen gedurende ten minste 90 minuten in een oven op 100 graden Celsius.
Verwijder vervolgens de mallen uit de oven en laat ze afkoelen totdat ze gemakkelijk kunnen worden gehanteerd. Klem de mal met het uitgeharde PDMS-apparaat in een werkbanktang zodat de geometrieën van de mal omhoog staan, parallel aan de werktafel. Begin met het verwijderen van het PDMS-apparaat door vlakke pincetten te gebruiken om de PDMS-uittrektap uit de mal los te maken.
Werk vervolgens rond de omtrek van de mal met de pincetten. Het PDMS moet gedurende ten minste 90 minuten bij 100 graden Celsius zijn uitgehard, anders blijft het plakkerig en blijft het aan de mal plakken. Een goed teken dat u het apparaat lang genoeg hebt uitgehard, is dat u een luchtbel zult zien op het grensvlak tussen de mal en het PDMS-apparaat, wat aangeeft dat het gemakkelijk kan worden verwijderd.
Gebruik gefilterde perslucht en pincetten om het apparaat voorzichtig uit de mal te tillen door op de uittrektab te klemmen en lucht onder het apparaat te blazen. Plaats vervolgens het PDMS-apparaat ondersteboven op de binnenkant van het deksel van een schaal met glazen bodem, zodat de remmende tunnelwiggen de plastic raken. Plaats vervolgens het schaaldeksel met de ondersteboven liggende zWEDGI en de bijbehorende schaal met glazen bodem in een plasmareiniger met de binnenkant van het glas naar boven gericht.
Evacueer de plasmareinigingskamer totdat de druk 500 millitorr bereikt. Stel de radiofrequentie of RF-vermogen op hoog in en stel het apparaat en de schaal bloot aan RF-frequentie gedurende ongeveer twee minuten. Ontdruk vervolgens langzaam de kamer en breng het apparaat en de schaal terug naar een schone kamerkap.
Verwijder het PDMS-apparaat van het schaaldeksel. Draai vervolgens de PDMS zWEDGI om naar de juiste oriëntatie op het glas door het voorzichtig in het midden van de schaal met glazen bodem te plaatsen. Om de hechting van PDMS aan het glas te waarborgen, gebruikt u het achterste uiteinde van de pincetten om druk uit te oefenen rond de minuscule geometrieën van de microkanalen, waardoor het PDMS naar de randen wordt geëgaliseerd.
Druk lichtjes op het PDMS-apparaat om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen onder het apparaat vastzitten. Voeg 70% ethanol toe aan de schaal en spoel de kanalen, inclusief de remmende tunnel, met een micropipet. Verwijder vervolgens het ethanol en spoel het apparaat twee of drie keer met dubbel gedestilleerd water af voordat u het laat drogen.
Vul de kanalen met mageremelk en incubeer het apparaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om de hechting van de larven aan de
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Dit manuscript beschrijft de zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), een apparaat dat is ontworpen om zebravislarven te oriënteren en te fixeren voor hoge-resolutie beeldvorming van wondgenezing. Deze methode maakt staarttransectie en langetermijnobservatie van regeneratieprocessen mogelijk.
Hoge-resolutie, langetermijn live-imaging van zebravislarven met behulp van het zWEDGI-apparaat maakt nauwkeurige analyse van wondgenezings- en weefselregeneratiemechanismen mogelijk. Dit platform ondersteunt voorspellende betrouwbaarheid bij vroege ontdekkingen door real-time observatie van cellulaire en extracellulaire matrixdynamiek mogelijk te maken. De modulariteit en herbruikbaarheid maken het tot een schaalbare hulpbron voor fenotypische screening en mechanistische risicoreductie in preklinische modelsystemen.
Het zWEDGI-apparaat past binnen het continuüm van vroege ontdekking tot preklinisch onderzoek en ondersteunt hypothese-gestuurd onderzoek en de ontwikkeling van assays voor regeneratieve biologie en wondgenezing.