Op lange termijn levende Imaging Device voor verbeterde experimentele manipulatie van zebravis larven
October 27th, 2017
Dit manuscript beschrijft de zWEDGI (zebrafish Wounding en Entrapment apparaat voor groei en Imaging), die is een verzuilde apparaat ontworpen bedwingen zebrafish larven te oriënteren. Het ontwerp staat staart transect en op lange termijn collectie van hoge-resolutie fluorescentie microscopie beelden van wondgenezing en regeneratie.
Het algemene doel van deze fabricage van beeldvormingsapparatuur is om een aanpasbaar platform te creëren voor microscopische analyse van wondgenezing bij levende zebravislarven. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het veld van wondgenezing, zoals wat de bijdrage is van de reorganisatie van collageenvezels en cellulaire reacties op de daaropvolgende weefselgroei na verwonding. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat wonden en beeldvorming binnen een enkel apparaat plaatsvinden, terwijl de staartgroei niet wordt belemmerd door het apparaat.
Bovendien kunnen de meerdere functionele compartimenten van de zWEDGI onafhankelijk worden aangepast om verschillende larvale stadia en een reeks experimentele protocollen mogelijk te maken. Om te beginnen, modelleerd het PDMS-onderdeel van het apparaat met de gewenste geometrieën en attributen volgens het tekstprotocol. Na het printen van de mallen met behulp van een fotopolymeer 3-D printer, reinig de mallen met behulp van een fijne borstel, ontsmettingsalcohol in een spuitfles en perslucht.
Schrob voorzichtig en verwijder de ongenezen hars, vooral elk materiaal uit de microkanaalgebieden. Belicht vervolgens de mallen in een UV-nabehandelingsapparaat gedurende 60 minuten aan elke kant, omdat ongenezen hars giftig is voor zebravislarven. Schuur met 200 korrels schuurpapier de holtezijde van de mal op een vlakke oppervlakte totdat alle plafondoppervlakken in contact zijn met het schuurpapier.
Schuur met 400 en 600 korrels schuurpapier lichtjes om gladde, vlakke oppervlakken over alle geometrieën van de mal te produceren. Gebruik vervolgens een draaislinger om de diepte van de holte na het schuren te meten om te verifiëren dat deze dicht bij de ontwerpdiepte ligt. Reinig de mallen en glazen dekschijfjes door ze 30 minuten in een ultrasone reiniger met water te plaatsen of door ze onder stromend water door te spoelen.
Gebruik isopropylalcohol en gefilterde perslucht om de mallen en deksels te reinigen en te laten drogen. Bereid een schone werkplek voor om de apparaten te fabriceren om besmetting door luchtdeeltjes tot een minimum te beperken. Maak het PDMS door basis en activator in een verhouding van 5:1 in een plastic beker te gieten.
Meng met behulp van een houten ambachtenstok gedurende twee minuten goed, waarbij het gel wordt omgegooid alsof je brood kneedt. Ontgast het mengsel in een vacuümexsiccator gedurende 25 tot 45 minuten totdat alle bubbels verdwenen zijn. Vul vervolgens met behulp van een 10 milliliter spuit de holte van elke 3-D geprinte mal met ongeveer 0,75 milliliter PDMS totdat de mal lichtjes overstroomt met een meniscus.
Ontgast de gevulde mallen gedurende 45 minuten om extra bubbels te verwijderen die mogelijk zijn gevormd tijdens het vullen. Breng een glazen dekschijf op de bovenkant van de met PDMS gevulde mal aan en druk de schijf schuin naar beneden om te voorkomen dat er luchtbellen vast komen te zitten. Laat overtollig PDMS uitstromen terwijl de glazen schijf wordt aangebracht.
Gebruik vervolgens een kleine ratelklemmen om de dekschijf stevig aan de mal te klemmen. Voor efficiëntie kan een multi-klemapparaat worden gebruikt. Behandel het PDMS-apparaat en de geklemde mallen gedurende ten minste 90 minuten in een oven op 100 graden Celsius.
Verwijder vervolgens de mallen uit de oven en laat ze afkoelen totdat ze gemakkelijk kunnen worden gehanteerd. Klem de mal met het uitgeharde PDMS-apparaat in een werkbanktang zodat de geometrieën van de mal omhoog staan, parallel aan de werktafel. Begin met het verwijderen van het PDMS-apparaat door vlakke pincetten te gebruiken om de PDMS-uittrektap uit de mal los te maken.
Werk vervolgens rond de omtrek van de mal met de pincetten. Het PDMS moet gedurende ten minste 90 minuten bij 100 graden Celsius zijn uitgehard, anders blijft het plakkerig en blijft het aan de mal plakken. Een goed teken dat u het apparaat lang genoeg hebt uitgehard, is dat u een luchtbel zult zien op het grensvlak tussen de mal en het PDMS-apparaat, wat aangeeft dat het gemakkelijk kan worden verwijderd.
Gebruik gefilterde perslucht en pincetten om het apparaat voorzichtig uit de mal te tillen door op de uittrektab te klemmen en lucht onder het apparaat te blazen. Plaats vervolgens het PDMS-apparaat ondersteboven op de binnenkant van het deksel van een schaal met glazen bodem, zodat de remmende tunnelwiggen de plastic raken. Plaats vervolgens het schaaldeksel met de ondersteboven liggende zWEDGI en de bijbehorende schaal met glazen bodem in een plasmareiniger met de binnenkant van het glas naar boven gericht.
Evacueer de plasmareinigingskamer totdat de druk 500 millitorr bereikt. Stel de radiofrequentie of RF-vermogen op hoog in en stel het apparaat en de schaal bloot aan RF-frequentie gedurende ongeveer twee minuten. Ontdruk vervolgens langzaam de kamer en breng het apparaat en de schaal terug naar een schone kamerkap.
Verwijder het PDMS-apparaat van het schaaldeksel. Draai vervolgens de PDMS zWEDGI om naar de juiste oriëntatie op het glas door het voorzichtig in het midden van de schaal met glazen bodem te plaatsen. Om de hechting van PDMS aan het glas te waarborgen, gebruikt u het achterste uiteinde van de pincetten om druk uit te oefenen rond de minuscule geometrieën van de microkanalen, waardoor het PDMS naar de randen wordt geëgaliseerd.
Druk lichtjes op het PDMS-apparaat om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen onder het apparaat vastzitten. Voeg 70% ethanol toe aan de schaal en spoel de kanalen, inclusief de remmende tunnel, met een micropipet. Verwijder vervolgens het ethanol en spoel het apparaat twee of drie keer met dubbel gedestilleerd water af voordat u het laat drogen.
Vul de kanalen met mageremelk en incubeer het apparaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om de hechting van de larven aan de
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit manuscript beschrijft de zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), een apparaat ontworpen om zebravislarven te oriënteren en te beperken voor beeldvorming met hoge resolutie van wondgenezing. Deze methode maakt staartdoorsnijding en langdurige observatie van regeneratieprocessen mogelijk.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Regeneratieve Geneeskunde
Achtergrond
- Het zWEDGI-apparaat vergemakkelijkt de studie van wondgenezing in levende zebravislarven.
- Het maakt gelijktijdige verwonding en beeldvorming mogelijk zonder de staartvergroei te hinderen.
- De compartimenten van het apparaat kunnen worden aangepast voor verschillende experimentele protocollen.
- Deze aanpak behandelt belangrijke vragen over collageenreorganisatie en cellulaire reacties na verwonding.
Doel van het onderzoek
- Om een platform te creëren voor microscopische analyse van wondgenezing.
- Om de bijdragen van verschillende biologische factoren in weefselvergroei te onderzoeken.
- Om een veelzijdig apparaat te ontwikkelen voor verschillende larvestadia en experimentele behoeften.
Gebruikte methoden
- Modellering van de PDMS-component van het apparaat volgens gespecificeerde geometrieën.
- Gebruik van een fotopolymeer 3-D printer om mallen te maken.
- Reiniging van de mallen met gedenatureerde alcohol en perslucht.
- Implementatie van het apparaat voor live beeldvorming van zebravislarven.
Belangrijkste resultaten
- De zWEDGI ondersteunt effectief langetermijnbeeldvorming van wondgenezing.
- De staartvergroei werd tijdens experimenten niet belemmerd door het apparaat.
- Beeldvorming met hoge resolutie gaf inzicht in het genezingsproces.
- Het ontwerp van het apparaat maakt aanpassingen mogelijk om aan te sluiten bij verschillende experimentele opstellingen.
Conclusies
- De zWEDGI is een waardevol hulpmiddel voor het onderzoek van wondgenezing bij zebravislarven.
- Dit apparaat stelt onderzoekers in staat om cruciale biologische processen in real-time te verkennen.
- Toekomstige studies kunnen dit platform gebruiken om de mechanismen van weefselregeneratie verder te begrijpen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
High-resolution, long-term live imaging of zebrafish larvae using the zWEDGI device enables precise interrogation of wound healing and tissue regeneration mechanisms. This platform supports predictive confidence in early discovery by allowing real-time observation of cellular and extracellular matrix dynamics. Its modularity and reusability position it as a scalable asset for phenotypic screening and mechanistic de-risking in preclinical model systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of cellular responses and collagen fiber reorganization post-injury.
- Supports functional target validation by permitting manipulation and observation within a single device.
- Facilitates mechanistic de-risking through real-time, longitudinal imaging of regenerative processes.
Screening & Assay Development
- Provides standardized orientation and parallel processing of multiple larvae for reproducible imaging workflows.
- Allows for quantitative, high-content imaging outputs suitable for downstream analysis.
- Streamlines assay development by integrating wounding, treatment application, and imaging in one platform.
Translational & Preclinical Research
- Offers a disease-relevant system for studying tissue regrowth and wound healing dynamics.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting diverse experimental protocols.
- Permits integration of drug application and biomarker analysis within live imaging workflows.
Pipeline & Workflow Integration
The zWEDGI device fits within the early discovery to preclinical continuum, supporting hypothesis-driven research and assay development for regenerative biology and wound healing.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on cellular and matrix responses to injury in vivo.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for comparative analysis.
- Analytics: Enables 3D spatial reconstruction and time-lapse analysis of regenerative processes.
- Translational Research: Aligns with biomarker discovery and validation in a live vertebrate model.
- Enterprise Reuse: Modular design allows adaptation for various larval stages and experimental needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in regenerative studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput in live imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling robust phenotypic screening.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of regenerative targets and therapeutic strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, live imaging, and device fabrication.
- Needs access to 3D printing, PDMS molding, and advanced microscopy infrastructure.
- Demands cross-team standardization for device preparation and imaging protocols.
- Adaptable across larval stages and experimental designs due to modular compartments.
- Careful handling of photopolymer resins and device cleaning is essential for viability and reproducibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Design and 3D Printing of Molds
2:57
PDMS Fabrication of zWEDGI Device
4:43
Plasma-bonding zWEDGI to Glass Dish
7:19
Channel Preparation and Loading Larvae
9:52
Wounding and Imaging Larvae and End of Experiment
11:14
Results: Post Wound Live Imaging and 3D Reconstruction of Zebrafish Larvae Tail Fin
12:36
Conclusion
