Real-time schokkend-geïnduceerde conversie Assay voor het opsporen van CWD prionen in fecaal materiaal
29 september 2017
Hier presenteren we een protocol om te beschrijven van een eenvoudige, snelle en efficiënte prion amplificatie techniek, de real-time schokkend-geïnduceerde conversie (RT-QuIC) methode.
Het algemene doel van dit protocol voor real-time quaking-induced conversion assay is om een gevoelige detectie van chronische verspillingziekte prionen in cervid fecale monsters mogelijk te maken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het CWD-onderzoeksveld, zoals wanneer geïnfecteerde cervid CWD prionen in uitwerpselen aanwezig zijn. Het grote voordeel van deze techniek is dat het specifiek, gevoelig is en een hoge doorvoer van monsters mogelijk maakt.
Ginny Cheng, een laboratoriumtechnicus uit mijn laboratorium, zal de procedure demonstreren. Om deze procedure te starten, voeg je één gram fecesmateriaal toe aan een buisje met 10 milliliter feces extract buffer. Gebruik een dissociator met een vooraf ingesteld programma voor eiwitten om de fecespellets een minuut bij kamertemperatuur te homogeniseren.
Herhaal dit twee tot drie keer totdat de fecesmonsters volledig gehomogeniseerd zijn. Gebruik vervolgens parafilm om de buisjes te verzegelen en plaats ze op een slingerplatform of schuddenschakelaar voor een uur incubatie bij kamertemperatuur. Centrifugeer daarna bij 18.000 g's gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.
Verzamel de supernatants en verdeel ze in 1,5 milliliter buisjes. Bewaar bij min 80 graden Celsius tot u klaar bent om ze te gebruiken. Om de natriumfosfowolframzuur precipitatie methode te starten, voeg je 250 microliter sarkosyl toe aan één milliliter feces eiwit extract.
Gebruik parafilm om de buis te verzegelen. Plaats de buis in een thermische mixer en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten met constant schudden bij 1.400 rpm. Voeg daarna een stockoplossing toe met 10% natriumfosfowolframzuur en 170 millimolair magnesiumchloride zodat de uiteindelijke concentratie natriumfosfowolframzuur in de monsters 3% is. Breng de monsters over naar de thermische mixer en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende twee uur met constant schudden bij 400 rpm.
Centrifugeer vervolgens bij 15.800 g's gedurende 30 minuten bij 14 graden Celsius. Verwijder voorzichtig de supernatants en was de pellets door ze op te schorten in wasbuffer. Centrifugeer vervolgens bij 15.800 g's gedurende 15 minuten bij 14 graden Celsius.
Verwijder voorzichtig de supernatants en schors de pellets op in 100 microliter RT-QuIC verdunningsbuffer. Bewaar de behandelde monsters bij min 20 graden Celsius tot u klaar bent om de RT-QuIC assay uit te voeren. Om te beginnen, voeg je 0,032 gram Thioflavin T toe aan 10 milliliter dubbel gedestilleerd water om een verse 10 millimolair Thioflavin T stockoplossing te bereiden.
Gebruik vervolgens dubbel gedestilleerd water om een een op tien verdunning van de stockoplossing te maken, wat resulteert in een eindconcentratie van één millimolair Thioflavin T. Gebruik een spuit voorzien van een 0,2 micrometer Acro disk filter om de een millimolair Thioflavin T oplossing te filteren. Ontdooi vervolgens het meest recombinante prioneiwit substraat. Laad 500 microliter recombinant prioneiwit substraat tegelijk in 100 kilo Dalton size exclusion filter microbuisjes.
Centrifugeer bij 14.000 g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Transfer daarna het geëluteerde substraat in een steriele 1,5 milliliter buis. Bewaar bij vier graden Celsius tot u klaar bent om het te gebruiken.
Ontdooi vervolgens de opgeslagen RT-QuIC verdunningsbuffer. Verdun het zaad en bereid de stockoplossingen en RT-QuIC reactiemengsel voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Gebruik een pipet met een filtertip om de reactiemengsel door op en neer te pipetten te mengen.
Giet het mengsel in een 50 milliliter wegwerp pipetreservoir. Gebruik een multikanaals pipet om 98 microliter RT-QuIC reactiemengsel in elk putje van een 96-well optische bodemplaat te laden. Voeg aan elke reactie twee microliter van ofwel onverdund of tienvoudig serieel verdunde feces eiwit extract toe.
Gebruik vervolgens afdichtingstape om de plaat te verzegelen. Incubeer in een platelezer bij 42 graden Celsius gedurende 25 uur met herhaalde cycli van één minuut dubbel orbitaal schudden bij 700 rpm en één minuut rust gedurende de incubatie. Definieer ondertussen de fluorescentiemeetinstellingen zoals beschreven in het tekstprotocol.
Na 25 uur verwijder je de plaat uit de platelezer. Centrifugeer de plaat bij 3.000 g's gedurende drie minuten om mogelijke besmetting tussen de putjes te voorkomen. Verwijder vervolgens de verzegeling van de plaat.
Bereid een nieuwe plaat voor door 90 microliter RT-QuIC reactiemengsel toe te voegen dat vers substraat en verse Thioflavin T fluorescentie kleurstof bevat. Breng 10 microliter van elke put van de eerste plaat over naar de nieuw bereide 96-well plaat. Gebruik afdichtingstape om de nieuwe plaat te verzegelen.
Na het definiëren van de fluorescentiemeetinstellingen, zet je de assay nog gedurende 50 uur voort. Lees en documenteer elke 15 minuten het Thioflavin T fluorescentiesignaal voor elke put. Verzamel en plot vervolgens de gegevens zoals beschreven in het tekstprotocol.
In dit onderzoek worden fecesmateriaal van niet-geïnfecteerde elanden of mul eenden gehomogeniseerd in feces extract buffer om een uiteindelijke monstersconcentratie van 10% te verkrijgen. Sommige homogenaten worden vervolgens verwerkt en tienvoudig geconcentreerd door natriumfosfowolframzuur precipitatie. Hoewel een vermindering van spontane conversies wordt waargenomen in gezuiverde monsters, vertoonden alle monsters lage fluorescentiesignaal in CWD positieve fecesmonsters. Om de amplificatie van prionen te verbeteren en de gevoeligheid van detectie te verhogen, wordt een substraat vervangingsstap geïncorporeerd.
Monsters die een substraat vervanging hebben ondergaan als onderdeel van het RT-QuIC protocol, laten een toename van de gevoeligheid en specificiteit van detectie zien met 14 van de 18 monsters positief en geen van de negatieve controles vals positief registreren. Eenmaal beheerst, kan feces extract bereiding en PRP/SCRP concentratie in ongeveer vier uur worden gedaan en de RT-QuIC assay kan in ongeveer 1/1-2 uur worden ingesteld als deze goed word
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor de real-time quaking-induced conversion (RT-QuIC) methode, een gevoelige techniek voor het detecteren van prions van de chronic wasting disease in fecale monsters van cerviden. De methode is ontworpen om kritische vragen te beantwoorden met betrekking tot de aanwezigheid van CWD-prions in feces.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Prionziektenonderzoek
- Diergezondheid
Achtergrond
- Chronic wasting disease (CWD) treft cerviden en vormt een aanzienlijk ecologisch probleem.
- De detectie van prionen in fecesmonsters is cruciaal voor het begrijpen van de transmissie van de ziekte.
- RT-QuIC is een nieuwe methode die de sensitiviteit en specificiteit bij de detectie van prionen verhoogt.
- De techniek maakt een high-throughput analyse van monsters mogelijk.
Doel van de studie
- Om een betrouwbaar protocol te bieden voor het detecteren van CWD-prionen in feces.
- Om onderzoek naar de timing van prionuitscheiding bij geïnfecteerde cerviden te faciliteren.
- Om het begrip van de CWD-dynamiek in wilde populaties te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van fecesmonsters met behulp van een fecesextractiebuffer.
- Homogenisatie van fecespellets met een dissociator.
- Toepassing van de RT-QuIC-assay voor de detectie van prionen.
- Demonstratie van de procedure door een getrainde laboratoriumtechnicus.
Belangrijkste resultaten
- De RT-QuIC-methode detecteert succesvol CWD-prionen in fecesmonsters.
- Het protocol is efficiënt en maakt de analyse van meerdere monsters tegelijkertijd mogelijk.
- De resultaten geven aan dat het tijdstip waarop prionen in de feces aanwezig zijn, bepaald kan worden.
- De methode vertoont een hoge specificiteit en sensitiviteit in vergelijking met traditionele technieken.
Conclusies
- RT-QuIC is een waardevol instrument voor onderzoek naar en monitoring van CWD.
- Het protocol kan het begrip van priondynamiek bij cerviden verbeteren.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze methode om transmissiepaden van prionen te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
De detectie van prionuitscheiding in fecaal materiaal maakt niet-invasieve surveillance van chronic wasting disease in wilde populaties mogelijk, wat vroege interventiestrategieën ondersteunt. De RT-QuIC-assay biedt een high-throughput, specifieke en sensitieve methode voor het identificeren van prion-seeding-activiteit, wat cruciaal is voor het begrijpen van transmissiedynamiek en het informeren van beslissingen over ziektebeheer. Deze benadering vermindert de afhankelijkheid van invasieve bemonstering en vergroot de schaalbaarheid voor grootschalige monitoringsprogramma's in onderzoek en toepassingen voor de gezondheid van wilde dieren.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om prion-seedingactiviteit te onderzoeken als biomarker voor de aanwezigheid van ziekten in preklinische en klinische stadia.
- Operationele waarde: Ondersteunt de functionele validatie van methoden voor priondetectie met behulp van niet-invasieve monstermatrices.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve fluorescentie-uitlezingen via Thioflavine T om amyloïdevorming in real-time te monitoren.
- Operationele waarde: Faciliteert assay-standaardisatie door gestandaardiseerde monsterpreparatie, inclusief homogenisatie op basis van detergentia en precipitatie met fosfowolfraamzuur.
- Wetenschappelijke waarde: Verbetert de sensitiviteit en specificiteit via substraatvervanging, waardoor achtergrondruis wordt verminderd en de detectie van foutpositieven wordt verbeterd.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een ziekterellevant systeem voor het bestuderen van de kinetiek van prionuitscheiding bij cerviden, ter ondersteuning van de afstemming van translationele biomarkers.
- Operationele waarde: Maakt longitudinale bemonstering mogelijk om de verschijning en persistentie van prionen in feces gedurende verschillende ziektestadia te volgen.
Integratie van Pipeline en Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van hypothesetoetsing in de vroege ontdekkingsfase tot assay-gereedheid voor screeningstoepassingen, in het bijzonder wanneer niet-invasieve biomarkerdetectie vereist is.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing met betrekking tot de timing en frequentie van prionuitscheiding bij geïnfecteerde dieren.
- Screening: Zorgt voor analyse-gereedheid via reproduceerbare stappen voor monsterconcentratie en zuivering die inhibitoren minimaliseren.
- Analytics: Produceert kwantitatieve Thioflavine T-fluorescentiesignalen die vergelijking van seeding-activiteit tussen monsters en condities mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit door detectie in levende dieren mogelijk te maken, wat longitudinale studies faciliteert.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor priondetectie dat, mits passend gevalideerd, kan worden aangepast aan verschillende monstertypes en soorten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij de detectie van prionen door het aantal fout-negatieven te verminderen via het verwijderen van inhibitoren en signaalversterking.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid via gestandaardiseerde protocollen voor fecale verwerking en detectie op basis van 96-wells platen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go beslissingen in surveillanceprogramma's door het bieden van betrouwbare detectiecapaciteit in een vroeg stadium.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van onderzoeksactiviteiten mogelijk op basis van prion-uitscheidingspatronen in doelpopulaties.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de omgang met prionen, praktijken op biosafety-niveau 2+ en de interpretatie van fluorescentie-gebaseerde assays.
- Is afhankelijk van toegang tot plaatlezers met schudfunctie en temperatuurregeling, centrifuges en size-exclusion filters.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor monstername, opslag (-80°C) en voorbehandeling om consistentie te waarborgen.
- Houdt rekening met aanpassingen voor verschillende fecale matrices, waarvoor optimalisatie van de buffersamenstelling en precipitatiecondities nodig kan zijn.
- Omvat praktische beperkingen zoals potentiële variabiliteit in de inhibitorbelasting tussen monsters, wat empirische validatie van de zuiveringsstappen noodzakelijk maakt.
